阅读说明：本技术 低起始量细胞样本的核小体dna测序文库的构建方法和应用 (Construction method and application of nucleosome DNA sequencing library of low-initial-amount cell sample ) 是由 陶晨雨 侯胜奎 崔浩亮 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法和应用,涉及测序技术领域。低起始量细胞样本为至少含有1×10<Sup>3</Sup>个细胞的样本,该构建方法包括使用微球菌核酸酶片段化样本的DNA,得到核小体DNA片段,核小体DNA片段建库后使用磁珠纯化,得到核小体DNA测序文库。该构建方法能够显著降低用于构建测序文库的细胞数量。(The invention provides a construction method and application of a nucleosome DNA sequencing library of a low-initial-amount cell sample, and relates to the technical field of sequencing. The low initial cell sample is at least 1 × 10 3 The construction method of the sample of each cell comprises the steps of fragmenting DNA of the sample by using micrococcal nuclease to obtain nucleosome DNA fragments, and purifying the nucleosome DNA fragments by using magnetic beads after a library is built to obtain a nucleosome DNA sequencing library. The construction method can obviously reduce the number of cells for constructing a sequencing library.)

低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法和应用

技术领域

本发明涉及测序技术领域，尤其是涉及一种低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法和应用。

背景技术

核小体是真核生物染色质组成的基本结构单位和基本结构亚基，呈念珠状排列在染色质上。它是由长度约为147bp的DNA与包裹缠绕在其中的组蛋白核心八聚体组成的结构，相邻核小体之间存在组蛋白H1，位于约为20-50bp的自由区域(linker DNA)上起加固作用。

近年来，已得到了许多物种的核小体图谱，并证明核小体富集程度及分布不仅反映了染色质的结构状态，还与基因表达有着密切的关系，核小体研究已成为表观遗传学又一热门的领域。但是这些研究所需要的细胞样本量约在10⁶-10⁷级，这对于一些珍贵细胞样品如***，胚胎等是一个很大的限制因素。因此，一种量样本的核小体片段建库测序的方法是目前市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法，该构建方法能够显著降低用于构建测序文库样本的细胞数量。

本发明的第二目的在于提供采用上述低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法构建得到的核小体DNA测序文库。

本发明的第三目的在于提供上述低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法或上述核小体DNA测序文库在测序中的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法，所述低起始量细胞样本为至少含有1×10³个细胞的样本；所述构建方法包括使用微球菌核酸酶片段化样本的DNA，得到核小体DNA片段，核小体DNA片段建库后使用磁珠纯化，得到核小体DNA测序文库。

优选地，所述微球菌核酸酶的用量为0.01～0.5U/10³个细胞。

优选地，所述使用微球菌核酸酶消化细胞包括分离核酸，然后使用微球菌核酸酶片段化DNA，得到核小体DNA；

优选地，使用微球菌核酸酶片段化DNA后，对片段化的DNA进行纯化，得到核小体DNA。

优选地，所述使用微球菌核酸酶消化细胞包括采用ZYMO Nucleosomal DNA PrepKit试剂盒。

优选地，核酸分离包括如下步骤：使用Nuclei Prep Buffer重悬细胞，使NucleiPrep Buffer浸没细胞4～6min；

优选地，去除体系中的Nuclei Prep Buffer，使用MN Digestion Buffer润洗细胞；

优选地，使用MN Digestion Buffer润洗细胞至少两次；

优选地，Nuclei Prep Buffer和MN Digestion Buffer分别独立的经预冷后再使用。

优选地，使用Nuclei Prep Buffer重悬细胞前，去除体系中残留的细胞消化试剂；

优选地，使用缓冲液重悬细胞至少两次，以去除体系中残留的细胞消化试剂。

优选地，所述使用磁珠纯化包括如下步骤：将建库后的DNA片段和磁珠混合均匀，孵育4～6min；吸附体系中的磁珠至体系固液分离后弃去液相；将用于溶解磁珠上吸附的DNA片段的溶剂和磁珠混合均匀，再吸附体系中的磁珠至体系固液分离，吸取体系中的液相，得到纯化后的核小体DNA测序文库；

优选地，先使用乙醇溶液清洗磁珠，去除乙醇溶液后再将用于溶解磁珠上吸附的DNA片段的溶剂和磁珠混合均匀；

优选地，所述乙醇溶液清洗磁珠包括将磁珠浸没至乙醇溶液中25～35s；

优选地，使用75～85w/v％的乙醇水溶液浸没磁珠；

优选地，使用乙醇溶液清洗磁珠至少两次；

优选地，所述去除乙醇溶液包括采用使乙醇溶液挥发的方式；

优选地，所述用于溶解磁珠上吸附的DNA片段的溶剂和磁珠混合均匀包括将所述溶剂浸没磁珠4～6min；

优选地，所述用于溶解磁珠上吸附的DNA片段的溶剂包括ddH₂O；

优选地，所述溶剂浸没磁珠的温度条件为23～27℃，优选为25℃。

优选地，所述磁珠包括AMPure XP磁珠。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种核小体DNA测序文库，该核小体DNA测序文库使用上述低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法构建得到。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法或上述核小体DNA测序文库在测序中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法使用微球菌核酸酶消化细胞，片段化细胞中的DNA得到核小体的片段化DNA片段。将核小体DNA片段按照常规方法建库后，采用磁珠法纯化核小体DNA测序文库，磁珠纯化核小体DNA测序文库，能够有效的分离文库中的DNA片段，提高核小体DNA测序文库的质量。

传统方法中构建提高核小体DNA测序文库需要的细胞量约在10⁶～10⁷个细胞，采用本发明提供的构建方法，需要的细胞量可低至1×10³个细胞。本发明提供的构建方法，缓解了由于样本细胞量要求过高导致的核小体DNA测序文库构建不适于一些珍贵细胞样品如***和胚胎细胞等细胞的问题。本发明提供的文库构建方法为后续一些珍贵样本进行核小体表观遗传分析提供了可能和技术支持。

本发明提供的采用上述构建方法构建得到的核小体DNA测序文库，文库质量高，文库中片段大小集中，大片段和小片段污染小，测序质量高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例制备得到的核小体DNA测序文库的库检结果；

图2为本发明实施例制备得到的核小体DNA测序文库的库检结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法，包括使用微球菌核酸酶片段化样本的DNA，得到核小体DNA片段，以核小体DNA片段建库后使用磁珠纯化，得到核小体DNA测序文库。

本发明提供的构建方法使用微球菌核酸酶消化细胞，微球菌核酸酶(micrococcalnuclease，MNase)是一种非特异性的核酸切割酶，只降解核小体连接区DNA的核酸酶，得到核小体的片段化DNA片段。将核小体DNA片段按照常规方法建库后，本发明采用磁珠法纯化核小体DNA测序文库，磁珠纯化核小体DNA测序文库，能够有效的分离文库中的DNA片段，提高核小体DNA测序文库的质量。

传统方法中构建提高核小体DNA测序文库需要的细胞量约在10⁶～10⁷个细胞，采用本发明提供的构建方法，需要的细胞量可低至1×10³个细胞，细胞数≥1×10³个均可以使用本发明提供的构建方法。本发明提供的构建方法，缓解了由于样本细胞量要求过高导致的核小体DNA测序文库构建不适于一些珍贵细胞样品如***和胚胎细胞等细胞的问题。本发明提供的文库构建方法为后续一些珍贵样本进行核小体表观遗传分析提供了可能和技术支持。

在一些优选的实施方式中，所述微球菌核酸酶的用量为0.01～0.5U/10³个细胞，例如可以为但不限于为0.01U/10³个细胞、0.05U/10³个细胞、0.1U/10³个细胞、0.2U/10³个细胞、0.3U/10³个细胞、0.4U/10³个细胞或0.5U/10³个细胞。

在一些优选的实施方式中，所述使用微球菌核酸酶片段化样本的DNA包括先分离细胞中的核酸，再使用微球菌核酸酶片段化DNA，然后收集片段化的核小体DNA。使用微球菌核酸酶片段化DNA优选使用ZYMO EZ Nucleosomal DNA Prep Kit试剂盒，产品货号为D5220。其中，分离细胞中的核酸的步骤中，加速细胞膜的破裂，提高细胞裂解效率能够进一步的降低样本中细胞的起始量。优选按照如下步骤实施：

将消化后的细胞使用缓冲液清洗，优选清洗至少两遍，以去除含有细胞的体系中残留的消化试剂，主要是消化试剂中的胰酶以及EDTA或EDTA的盐对微球蛋白酶消化作用有很大的影响。清洗后分离细胞，彻底去除其中的液相，将细胞重悬后加入预冷的NucleiPrep Buffer，重悬细胞。优选将浸没于Nuclei Prep Buffer的细胞置于冰上，或在4℃左右的环境中放置4～6min左右，以加速细胞膜的破裂，提高细胞裂解效率，降低细胞起始量。静置后彻底去除Nuclei Prep Buffer，然后加入MN Digestion Buffer，轻轻的细胞混合均匀，以润洗细胞，去除体系中残留的Nuclei Prep Buffer，优选使用MN Digestion Buffer润洗细胞至少两次。需要注意的是，该步骤中所有的步骤都应在冰上或保持4℃温度操作，且所有的试剂在使用前均经预冷处理。

在一些优选的实施方式中，使用磁珠纯化核小体DNA测序文库优选按照如下方法实施：将建库后的DNA片段和磁珠混合均匀，室温静置放置4～6min，以使磁珠充分的吸附DNA文库片段，磁珠优选使用Beckman Coulter的AMPure XP磁珠；吸附体系中的磁珠至体系固液分离后弃去液相；将用于溶解磁珠上吸附的DNA片段的溶剂和磁珠混合均匀，使磁珠上吸附的DNA文库片段溶解于液相中，优选在室温(25℃左右，可选的为23～27℃即可，优选25℃)的条件下将磁珠浸没于溶剂中4～6min；优选使用ddH₂O和磁珠混合均匀，使磁珠上的DNA片段溶解于ddH₂O中。最后吸附体系中的磁珠至体系固液分离，吸取体系中的液相，得到纯化后的核小体DNA测序文库。

在一些优选的实施方式中，磁珠吸附DNA文库片段后，使用乙醇溶液清洗磁珠，以去除体系中残留的其他试剂，避免残留物质转移至纯化后的核小体DNA测序文库中。使用乙醇溶液清洗磁珠优选按照如下方法实施：乙醇优选使用75～85w/v％的乙醇水溶液浸没磁珠，浸没时间优选25～35s，以使杂质充分的溶解于乙醇溶液中，然后去除液相。优选使用乙醇水溶液清洗磁珠至少两次，且乙醇水溶液优选现用现配。优选在使用溶剂溶解吸附在磁珠上的DNA片段前，将乙醇水溶液除尽，以避免残留的溶剂影响下一步的测序步骤，优选采用使乙醇溶液挥发的方式除尽体系中的乙醇。

本发明提供的低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法中，经使用微球菌核酸酶片段化DNA后，可采用常规的方法收集和纯化方法得到核小体DNA，例如采用商品化的试剂盒对核小体DNA进行收集和纯化。核小体DNA片段建库可采用本领域常规的建库方法，例如包括5’端磷酸化，3’端加A尾，加接头序列和PCR富集等常规步骤，本发明对此不作限制。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了采用上述低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法构建得到的核小体DNA测序文库。该核小体DNA测序文库文库质量高，文库中片段大小集中，大片段和小片段污染小，测序质量高。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法或上述核小体DNA测序文库在测序中的应用。使用上述低起始量细胞样本的核小体DNA测序文库的构建方法，可使低起始量细胞数量的样本也能够用于核小体DNA的测序，缓解了珍贵细胞样本无法进行核小体DNA测序的问题。采用上述构建方法构建得到的核小体DNA测序文库，质量高，文库中大片段和小片段的污染少，测序质量高。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例

构建猪胎儿成纤维细胞测序文库，两个重复，取1×10³个细胞，使用微球菌核酸酶消化，包括如下步骤：

(一)微球菌核酸酶消化细胞，使用ZYMO Nucleosomal DNA Prep Kit试剂盒，货号为D5220。

(1)核酸分离步骤：

1.胰酶消化细胞后用PBS洗两遍，以彻底去除EDTA(EDTA及胰酶的浓度对微球菌核酸酶消化作用有很大的影响)。

2.彻底去除上清溶液，将细胞沉淀用1mL PBS重新悬浮。

3.将重新悬浮的细胞移至1.5mL离心管中，离心1分钟。

4.彻底去除上清液，加入100μL预冷后的Nuclei Prep Buffer，用移液枪缓慢的重新悬浮细胞，或轻轻地颠倒离心管使其重新悬浮。

5.将离心管在冰上放置5分钟，用预冷后的Nuclei Prep Buffer重新悬浮细胞，并在冰上放置5分钟，这样可以加速细胞膜的破裂，提高细胞裂解效率，降低细胞起始量。

6.离心1分钟后，彻底去上清液。

7.加入100μL MN Digestion Buffer，轻轻颠倒离心管2-3次混匀细胞。

8.离心1分钟后，彻底去上清液。

9.重复步骤7-8。

核酸分离步骤中，所有的步骤都应在冰上或保持4℃温度操作；所使用到的溶液都经预冷处理；该步骤中所有离心步骤条件均为200×g，离心1分钟。

(2)微球菌核酸酶消化步骤：

1.向离心管中加入100μl MN Digestion Buffer，使上步离心沉淀的细胞重悬。

2.加入0.2U的微球菌核酸酶，用移液枪轻轻混匀。

3.室温(约25℃)放置5分钟。

4.加入20μL 5×MN Stop Buffer，轻轻混匀，停止消化反应。若5×MN StopBuffer形成了白色絮状沉淀，则在37℃水浴锅内温浴几分钟，絮状沉淀消失，不影响使用。

(3)核小体DNA纯化步骤：

1.向上步离心管中按体积比5:1(约600μL)加入DNA Binding Buffer，颠倒混匀。

2.将离心管内溶液加入到Zymo-SpinTM IIC过柱离心管中。

3.短暂离心，离心速度为12000×g，30秒。

4.将收集管内的液体弃掉。

5.加入300μL Wash Buffer，离心30秒，速度离心速度为12000×g。

6.重复第五步骤。

7.为了去除残留的Wash Buffer，将离心柱转到新的离心管中，空离2分钟。

8.向离心柱内加入30μL DNA Elution Buffer或ddH₂O，放置2分钟。

9.将离心柱放入一个新的离心管后，离心速度为12000×g，离心1分钟，收集核小体DNA片段。

(二)核小体片段建库：

得到单核小体的DNA片段后，加接头扩增建库，具体步骤如下：

(1)片段末端准备：5’端磷酸化，3’端加A尾，反应体系如表1所示：

表1

轻轻混匀，置于有热盖功能的PCR仪中，反应条件为20℃，30min；65℃，30min。

(2)接头连接，向上一步体系中加入如表2中的试剂表2

Blunt/TA Ligase Master Mix	15μL
		Adaptor for Illumina	2.5μL
Ligation Enhance	1μL
		共计	83.5μL

其中Adaptor for Illumina来自于NEBNext MutiplexOligos for Illumina(NEB#7335)接头试剂盒。混匀后，置于有热盖功能的PCR仪中，反应条件为20℃，15min；再加入3μL USER Enzyme，继续反应37℃，15min。

(3)磁珠纯化去除接头

1.涡旋震荡AMPure XP Beads(Beckman Coulter,US)磁珠，使其沉淀的磁珠重新悬浮并混匀。

2.加入86.5μL等体积的磁珠，用移液器上下混匀至少10次。

3.室温静止放置5分钟。

4.快速短暂的离心，将离心管壁中的液体离到管底，将离心管放在合适的磁石上。约5分钟后，溶液变澄清，小心的去除透明的液体，注意枪头不要碰到管底部的磁珠。

5.将离心管固定在磁石上保持不动，加入200μl新鲜配制的80％乙醇溶液，室温30秒后，去除液体。

6.重复步骤5。

7.将离心管依然固定在磁石上保持不动，打开离心管的盖子，室温放置约5分钟，将剩余的液体挥发。

8.将离心管从磁石上取下，加入20μL 10mM Tris-HCl或0.1×TE溶液溶解磁珠。

9.用移液枪上下反复吹打混匀，室温放置5分钟以上。

10.快速短暂离心，将离心管放置在磁石上。

11.磁石上放置约5分钟后，溶液渐渐变澄清，待此时用移液器小心将离心管内的液体吸取15μL至一个新的PCR离心管中。

(4)加接头DNA片段的PCR富集反应，反应体系如表3所示。

表3

加接头的DNA片段	15μL
		Q5 Hot Start Hifi Master Mix	25μL
Index Primer	5μL
		Universal PCR Primer	5μL
共计	50μL

轻轻混匀，置于有热盖功能的PCR仪中，反应条件为：98℃，30s变性；98℃变性，30s，65℃退火及延伸，75s，共12个循环；65℃最后延伸5min。

(5)磁珠纯化

1.涡旋震荡AMPure XP Beads(Beckman Coulter,US)磁珠，使其沉淀的磁珠重新悬浮并混匀。

2.加入50μL等体积的磁珠，用移液器上下混匀至少10次。

3.室温静止放置5分钟。

4.快速短暂的离心将离心管壁中的液体离到管底，将离心管放在合适的磁石上。约5分钟后，溶液变澄清，小心的去除透明的液体，注意枪头不要碰到管底部的磁珠。

5.将离心管固定在磁石上保持不动，加入200μl新鲜配制的80％乙醇溶液，室温30秒后，去除液体。

6.重复步骤5。

7.将离心管依然固定在磁石上保持不动，打开离心管的盖子，室温放置约5分钟，将剩余的液体挥发。

8.将离心管从磁石上取下，加入30μL ddH₂O溶解磁珠。

9.用移液枪上下反复吹打混匀，室温放置5分钟以上。

10.快速短暂离心，将离心管放置在磁石上。

11.磁石上放置约5分钟后，溶液渐渐变澄清，待此时用移液器小心将离心管内的液体吸取30μL至一个新离心管中，-20℃保存。

效果例

将实施例中制备得到的文库交付北京诺禾致源科技股份有限公司进行库检及测序。公司通过Aligent 2000进行库检，判断最终浓度及体系中的片段大小，库检结果如图1和图2所示。使用库检合格的两个文库进行测序，采用Illumina Hiseq 2000平台进行的双端125bp测序。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。