极速rna建库方法及试剂盒
阅读说明：本技术 极速rna建库方法及试剂盒 (Rapid RNA library building method and kit ) 是由 刘娜 江翱 罗元廷 曹振 宋东亮 于 2021-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种极速RNA建库方法,其步骤包括：在total RNA加入逆转录阻碍探针5.8S/18S/28S rRNA probe mix以及随机引物与total RNA混合后退火；加入逆转录酶,进行1st cDNA的合成；使用聚合酶合成2nd cDNA,磁珠回收2nd cDNA,得到ds-cDNA；ds-cDNA进行片段化、末端修复及接头连接；文库扩增及回收。并公开了对应的极速RNA建库试剂盒。可以在3h内完成RNA的极速建库,可以在病原诊断领域有广泛的应用。(The invention provides a rapid RNA database building method, which comprises the following steps: adding a reverse transcription blocking probe 5.8S/18S/28S rRNA probe mix and a random primer into the total RNA, mixing and annealing; adding reverse transcriptase to synthesize 1st cDNA; synthesizing 2nd cDNA by using polymerase, and recovering the 2nd cDNA by using magnetic beads to obtain ds-cDNA; carrying out fragmentation, end repair and joint connection on the ds-cDNA; and (5) amplifying and recovering the library. And discloses a corresponding rapid RNA library construction kit. Can complete the extremely fast library establishment of RNA within 3h, and can be widely applied in the field of pathogen diagnosis.)
技术领域
本发明专利涉及一种极速RNA建库方法及试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
RNA-seq是一种通过检测基因表达水平来分析基因组的技术。转录组研究能够从整体水平研究基因功能和基因结构，揭示生物发育及疾病发生过程，已经被广泛的利用于基础研究、临床诊断和药物研究等领域。RNA-seq技术能够更为快速、准确的提供更多的生物体转录信息，在生物医学领域被广泛的应用。在临床诊断方向，通过RNA-seq技术，可以一次性完成细菌、真菌、RNA病毒和寄生虫等多种病原的检出，检出率高、灵敏度高。尤其是2019年末至今的新冠病毒的疫情时代，RNA-seq技术可以在第一时间获取未知病毒的基因组信息，通过构建进化树揭示病原相关性、分析新冠病毒的进化来源、研究新冠病毒的致病病理机制等。
常规RNA-seq的建库策略是，通过Oliog dT磁珠进行mRNA捕获或者rRNA的去除；然后高温进行Mg2+的片段化；再通过1st cDNA的合成，2nd cDNA的合成及末端修复；再通过接头连接及去接头的磁珠纯化；最后进行文库的扩增及纯化。建库时长6~8h。但是，对于临床诊断行业，病原样本RNA提取的浓度较低，一般5~10ng/μL左右，再进行宿主rRNA的去除，建库成功率偏低。因此，病原检出一般采用不去除宿主rRNA的方式进行RNA建库，但是提取的总RNA中，由于宿主rRNA的占比在90%，会造成低拷贝的病原检出率下降甚至会出现漏检的概率。而且，对于病原样本的检出能做到一天内提取建库加上机出报告，是最理想的策略。因此，亟需一种可以去宿主rRNA的快速建库方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种RNA快速建库方法，具有耗时短、操作简单和损失小的优点。
本发明采取的技术方案为：一种极速RNA建库方法，其特征在于其步骤包括：
（1）提取样本中的total RNA，加入逆转录阻碍探针5.8S/18S/28S rRNA probemix（探针的序列参考CN202110257924 .X）以及随机引物与total RNA混合后退火，以去除total RNA中的rRNA；
（2）加入逆转录酶，以步骤（1）的产物为模板，进行1st cDNA的合成；
（3）使用聚合酶，以步骤（2）合成的1st cDNA为模板合成2nd cDNA，磁珠回收DNA，得到ds-cDNA；
（4）采用转座酶Tn5对ds-cDNA进行片段化；
（5）文库扩增及回收。
优选的，步骤（1）中的反应体系为total RNA、逆转录阻碍探针、随机引物和DEPC水。
优选的，步骤（1）中的退火程序为85℃ 5 min，72℃ 2 min，60℃ 10 min，保存于4℃。
优选的，步骤（2）中逆转录酶为SuperScript™ III 逆转录酶、SuperScript™ II逆转录酶、Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase 、Hifair® IV Reverse Transcriptase的一种或多种。
优选的，步骤（2）中逆转录程序为25℃ 5 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。
优选的，步骤（3）中聚合酶是DNA Polymerase I、Taq聚合酶、A家族DNA聚合酶、B家族高保真聚合酶中的一种或者多种。
优选的，步骤（3）中反应程序是16℃ 30 min，保存于4℃。
本发明还公开了一种极速RNA建库试剂盒，包括：
5.8S/18S/28S rRNA probe mix和随机引物；
1st cDNA合成酶和1st cDNA反应缓冲液；
2nd cDNA合成酶和2nd cDNA反应缓冲液；
片段化酶转座酶Tn5和反应缓冲液；
PCR反应试剂。
优选的，所述1st cDNA合成酶为SuperScript™ III 逆转录酶、SuperScript™II 逆转录酶、Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase 、Hifair® IV ReverseTranscriptase的一种或数种的混合物；所述2nd cDNA合成酶为DNA Polymerase I、Taq聚合酶、A家族DNA聚合酶、B家族高保真聚合酶中的一种或者数种的混合物；所述片段化酶为转座酶。
本发明目的在于提供一种极速的RNA建库的方法和试剂盒。相较于传统的RNA建库方法，流程短，操作简便，3h内即可完成宿主rRNA的去除，1st cDNA及2nd cDNA的合成，高效转座酶的酶切及接头连接，文库的扩增全过程。可以大大缩短病原检出的时间，可以广泛的应用于病原检出行业。
附图说明
图1本发明的极速RNA建库流程。
图2 本发明的极速RNA建库峰图。
图3 传统RNA建库峰图。
图4本发明的极速RNA建库与传统RNA建库方法的基因区域覆盖均一性比较。
图5本发明的极速RNA建库试剂盒对掺入COVID-19-pseudovirus的建库峰图。
图6本发明试剂盒COVID-19-pseudovirus的RNA到1st cDNA的合成效率分析。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
实施例1： 一种极速RNA建库的方法
在本实施例中，利用293 Cell的总RNA，组建了一种极速RNA建库的流程，流程和原理示意图见图1。具体方式如下：
1）宿主rRNA去除 ：
使用的Random primer是NNNNNN（生工合成），5.8S/18S/28S rRNA probe 序列参考CN202110257924 .X）。
表1
组分
用量
293 Total RNA
10~500ng
4 μM 5.8S/18S/28S rRNA probe mix (CN202110257924 .X)
1 μL
1 mM Random primer
1 μL
补DEPC水至
15 μL
85℃ 5 min，72℃ 2 min，60℃ 10 min，4℃保存。
2）1st cDNA的合成 ：
1st Reaction 缓冲液：200 mM Tris-HCl，250 mM KCl，10mM MgCl2，5mM dNTP，20mM DTT，pH值为8.3。
表2
组分
用量
上述反应体系
15μL
1st Reaction 缓冲液
8 μL
SuperScript™ II RT (200 U/µL，ThermoFisher)
1 μL
SUPERase•In™ RNase 抑制剂 (40 U/µL)
1 μL
Total
25 μL
25℃ 5 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存。
3）2nd cDNA的合成及回收
2nd Reaction 缓冲液：50 mM Tris-HCl，250 mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM dNTP，5 mM DTT，pH值为7.9。
表3
组分
用量
上述反应体系
25μL
2nd Reaction 缓冲液
7 μL
DNA Polymerase I（5U/µL，Neb）
2 μL
RNase H（5U/µL，Neb）
1 μL
Total
35 μL
16℃ 30 min，保存于4℃。
反应结束后，加入21 μL Agencourt AMPure XP beads（Beckman，A63881）混匀后，室温静置孵育5 min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸去上清；加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸干净乙醇。室温静置3 min，晾干乙醇，加入13 μL 无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5 min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清，取1μL进行Qubit定量。
4）ds-cDNA的片段化
5×Reaction Buffer（Yeasen）：50% DMF，50 mM TAPS-NaOH(pH 8.5)， 25mMMgCl2。
表4
组分
用量
上述上清液
10 ng
5×Reaction Buffer（Yeasen）
4 μL
Transposome Mix V1（Yeasen）
5 μL
补水至
20 μL
55℃ 10 min，保存于4℃。
5）文库扩增及回收
N501，N701选自翊圣生物的Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®（Cat. #12610）。
表5
组分
用量
上述反应体系
20 μL
2×Ultima Amplification Mix（Yeasen）
25 μL
N501（Yeasen）
1 μL
N701（Yeasen）
1 μL
PCR Primer Mix（Yeasen）
1 μL
Total
50 μL
72℃ 3 min，95℃ 3 sec，13 cycles（98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s），72℃ 1min，保存于4℃。
反应结束后，加入45 μL Agencourt AMPure XP beads（Beckman，A63881）混匀后，室温静置孵育5 min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸去上清；加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸干净乙醇。室温静置3 min，晾干乙醇，加入20 μL 无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5 min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清。
实施例2： 一种极速RNA建库的方法与传统建库方法的比较分析
在本实施例中，我们将本发明的极速RNA建库的方法与传统的RNA建库方法进行了对比。传统RNA建库方法使用NEBNext® Ultra™ II Directional RNA Library Prep Kitfor Illumina进行文库构建，RNA投入量为500 ng，建库流程按照产品说明书进行。本极速RNA建库的方法我们进行了RNA投入量为500ng、100ng、50ng的建库，建库流程参照实施例1。
使用Qubit对构建好的文库进行定量，Agilent 2100 Bioanalyzer进行验证文库大小分布。构建好的文库在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序并分析。结果见表6、图2-图4，图2是本发明的极速RNA建库峰图，图3是传统建库的峰图，图4是测序数据均一性分析。
表6 不同 RNA投入量的文库产量及测序数据分析
方法
文库产量（μg）
比对率（%）
rRNA残留率（%）
基因检出数
传统建库-500ng
1.5
97.13
1.28
21007
Test-500ng
2.5
97.2
0.95
21964
Test-100ng
2.56
97.13
1.44
21740
Test-50ng
2.15
97.27
1.08
21919
结果如表6和图2-4所示，相较于传统RNA-seq方法，本发明的极速RNA建库的方法能够显著提高文库的产量，文库峰图相对更为集中。在比对率和rRNA去除效率上，本发明的极速RNA建库的方法和传统RNA-seq都能够高效去除rRNA，并具有很高的比对率。在基因检出数上，和传统RNA-seq相当。这些结果表明，一种极速RNA建库的方法比传统RNA-seq具有更高的建库效率和产量。可以显著的缩短建库时间。
实施例3： 一种极速RNA建库的试剂盒在假病毒检出中的应用测试
在本实施例中，我们将COVID-19-pseudovirus（2019-nCOV假病毒）（ Yeasen，11900）按照104个-107个/mL比例添加2.5μL到50 ng的293 Total RNA中，使用一种极速RNA建库的试剂盒进行建库并且送测序。
COVID-19-pseudovirus（2019-nCOV假病毒）（ Yeasen，11900）逆转录病毒载体，载体装载了COVID-19病毒ORF1 a/b 基因部分序列，E 基因和N基因编码区的全部序列，其中N基因序列如SEQ ID No.1所示。根据N基因序列，我们使用QRT-PCR检测引物ORF1ab-F：5´-GTGARATGGTCATGTGTGGCGG-3´,ORF1ab-R：5´-CARATGTTAAASACACTATTAGCATA-3´,检测了1stcDNA合成后，COVID-19-pseudovirus的RNA到1st cDNA的合成效率。使用Hieff® qPCRSYBR Green Master Mix (No Rox)（Yeasen，11201）对1st cDNA产物100倍稀释后的模板进行定量PCR分析。
使用Qubit对构建好的文库进行定量，琼脂糖凝胶电泳进行验证文库大小分布。构建好的文库在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序并分析。结果见表7、图5、6。图5是本发明的极速RNA建库试剂盒对掺入COVID-19-pseudovirus的建库峰图分析。图6是COVID-19-pseudovirus的RNA到1st cDNA的合成效率分析。
表7 50 ng 293 RNA中掺入假病毒的文库产量及测序数据分析
结果如表7和图5,6所示，本发明的极速RNA建库试剂盒确实可以高效的检测样本中的病毒。宿主样本的比对率正常，rRNA残留较低，基因检出数目没有差异。这些结果表明，本极速RNA建库的试剂盒可以应用于病原检出领域。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
<120> 极速RNA建库方法及试剂盒
<141> 2021-07-06
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1260
<212> DNA
<213> COVID-19
<400> 1
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260
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