阅读说明：本技术 一种利用新型dCas9调控基因表达的方法 (Method for regulating gene expression by using novel dCas9 ) 是由 霍毅欣 郭丽微 刘玉美 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：CRISPRi系统由于可以阻断RNA聚合酶复合物的起始或延长来抑制基因转录,为了可控地调节基因的转录,dCas9基因会与各种诱导型启动子连接后进行表达。然而由于一些诱导型启动子宽松的调控机制,在不添加诱导剂的情况下,dCas9仍具有微弱的表达能力,进而对目的基因进行部分抑制。工业生产的大规模发酵中需要实现基因的精准调控,故诱导型启动子引起的泄露表达问题亟待解决。本发明的目的在于提供一种利用新型dCas9系统调控基因表达的方法,利用密码子偏好性和tRNA氨酰化水平的差异,在翻译水平上,简单有效地通过补加氨基酸实现dCas9基因的表达调控。将dCas9基因中的氨基酸替换为其稀有密码子形式,外源添加对应氨基酸,可以使其恢复表达有功能的蛋白而发挥抑制作用。(Since the CRISPRi system can block initiation or elongation of an RNA polymerase complex to inhibit gene transcription, the dCas9 gene is expressed after being linked to various inducible promoters in order to controllably regulate gene transcription. However, due to the loose regulation mechanism of some inducible promoters, dCas9 still has weak expression ability without adding an inducer, thereby partially inhibiting the target gene. In large-scale fermentation of industrial production, precise regulation and control of genes need to be realized, so the problem of leakage expression caused by an inducible promoter needs to be solved urgently. The invention aims to provide a method for regulating gene expression by using a novel dCas9 system, which utilizes the difference of codon preference and tRNA aminoacylation level to simply and effectively realize the expression regulation of dCas9 gene by adding amino acid at the translation level. The amino acid in the dCas9 gene is replaced by a rare codon form, and the corresponding amino acid is added by external sources, so that the protein with the expression function can be restored to play a role in inhibiting.)

一种利用新型dCas9调控基因表达的方法

技术领域：

本发明涉及一种利用新型dCas9系统调控基因表达的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

CRISPRi系统由于可以阻断RNA聚合酶复合物的起始或延长来抑制基因转录，因此被广泛的用于各种微生物以及细胞等。通常，为了可控地调节基因的转录，dCas9基因会与各种诱导型启动子连接后进行表达。然而由于一些诱导型启动子宽松的调控机制，在不添加诱导剂的情况下，dCas9依然具有微弱的表达能力，进而对目的基因进行部分抑制。工业生产的大规模发酵中需要实现基因的精准调控，故诱导型启动子引起的泄露表达问题亟待解决。

将dCas9基因中的氨基酸替换为其稀有密码子形式，外源添加对应氨基酸，可以使其恢复表达有功能的蛋白而发挥抑制作用。通过这种策略，可以在翻译水平上更加精确地调节基因的表达，减少基因泄露表达；诱导剂本身对细胞无毒害作用，价格低廉；稀有密码子对dCas9基因表达的调控只作用于含有此密码子的基因中，不会干扰到其他基因的表达和影响菌体的正常生长。

发明内容

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本发明的目的在于提供一种利用新型dCas9系统调控基因表达的方法，利用密码子偏好性和tRNA 氨酰化水平的差异，在翻译水平上，简单有效地通过补加氨基酸实现dCas9基因的表达调控。

按照本发明提供的技术方案，一种利用新型dCas9系统调控基因表达的方法，采用以下方法步骤：

1.需要确定所用菌株和其密码子偏好性。

2.根据氨基酸密码子偏好性和dCas9基因序列，确定选用的氨基酸和其稀有密码子，将所需调控基因中的相应氨基酸的密码子替换为对应的稀有密码子，使用PCR方法重新人工合成此序列。

3.将步骤2中人工合成的基因序列与质粒载体1连接，将连接产物化转至感受态细胞中，经过PCR 验证，挑选正确的单菌落，保存菌液，提取质粒1。

4.设计靶向所需调控基因的sgRNA，利用PCR将sgRNA表达框连接到载体2上，将连接产物化转至感受态细胞中，经过PCR验证，挑选正确的单菌落，保存菌液，提取质粒2。

5.将3、4中提取的两质粒转化到同一感受态细胞中，涂平板，挑取单菌落接入培养基中培养，补加相应氨基酸，检测调控基因的表达。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。

以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

实施例1、一种利用新型dCas9系统调控GFP表达的方法

以大肠杆菌DH5α(购于北京博迈德基因技术有限公司)为例，大肠杆菌DH5α翻译使用的亮氨酸密码子共有UUG，UUA，CUC，CUG，CUU和CUA六种，其中密码子CUA的使用频率最低(记载大肠杆菌密码子偏好性的非专利文献为Dong H,Nilsson L,Kurland C G.,1996，Co-variation of tRNA abundance and codon usage in Escherichia coli at differentgrowth rates.Journal of molecular biology,260(5):649-663.)。将dCas9 中的亮氨酸对应的密码子全部替换为稀有密码子CUA，采用基因全合成的方法得到突变的的dCas9蛋白基因。

基因全合成体系为：5×TransStart○R FastPfu Fly Buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物预混液2μL， TransStart○R FastPfu Fly DNA Polymerase 1μL,蒸馏水35μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃变性20秒、 55℃退火20秒、72℃延伸20秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增产物包含dCas9蛋白基因及其上游各515个碱基，下游118个碱基，并将其连接到载体1上。连接体系：1.5μL PCR扩增产物、 1μL载体1片段，7.5μL Gibson Master Mix(购自NEW ENGLAND BioLabs)，轻轻混合，50℃水浴反应60分钟。随后加入50μL DH5α感受态细胞中(购于北京博迈德基因技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激60秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μL SOC培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1 小时。取200μL菌液涂于含有卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，经PCR测序验证后将阳性克隆进行液体培养，提取质粒进行测序验证。测序结果表明载体中***了新合成的dcas9蛋白基因，证明质粒构建正确，保菌。

通过网站http://chopchop.cbu.uib.no/设计靶向GFP的sgRNA，通过PCR和两次IVA将sgRNA表达框连接到载体2上。基因PCR体系为：5×TransStart○R FastPfu FlyBuffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物 2μL，TransStart○R FastPfu Fly DNA Polymerase1μL,模板1μL，蒸馏水32μL，总体积为50μL。扩增条件为 95℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性5分钟，55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。将PCR产物用DpN1酶在37℃消化1小时，取5ul加入50μL DH5α感受态细胞中 (购于北京博迈德基因技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激60秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μL SOC培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时。取200μL菌液涂于含有氯霉素的LB平板上，过夜培养后，经PCR测序验证后将阳性克隆进行液体培养，提取质粒进行测序验证，质粒构建正确，保菌。

将以上两质粒化转DH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热激90秒，立刻置于冰上2分钟。加入 250μL SOC培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时。因为两质粒分别含有卡那青霉素氯霉素、抗性基因，取200μL菌液涂于含有卡那青霉素、氯霉素的LB平板上，37℃过夜培养。隔天挑取单菌落接入5ml含有卡那青霉素、氯霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时，补加1g/L亮氨酸，每隔2小时取 200ul菌液酶标仪检测GFP表达量、OD₆₀₀。