阅读说明：本技术 一种基于增强采样分子动力学模拟的混合拟、抗***干扰物的识别方法 (Identification method of mixed mimetic and antiestrogen interferent based on enhanced sampling molecular dynamics simulation ) 是由 史薇 陈钦畅 于红霞 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于增强采样分子动力学模拟的混合拟、抗雌激素效应的识别和预测方法,基于核受体变构和共调节因子调控机制,采用增强采样分子动力学模拟方法,通过识别局部和全局自由能最低点并进行动态轨迹聚类,提取配体化合物作用下雌激素受体α的稳态构象,并根据受体第12号螺旋稳定位置与共调节因子招募/抑制机制的关系,判断受测化合物的雌激素干扰效应,识别和预测拟性、抗性和混合拟、抗性干扰物。相比于传统体外实验方法,此方法成本低廉、效率更高,且避免了混合拟、抗性干扰物的细胞特异性问题；相比于已有的计算机辅助筛选方法,此方法能有效识别稳态构象,实现混合拟、抗雌激素干扰效应的预测。(The invention discloses a mixed simulation and antiestrogen effect recognition and prediction method based on enhanced sampling molecular dynamics simulation, which is based on nuclear receptor allosteric and co-regulatory factor regulation mechanisms, adopts the enhanced sampling molecular dynamics simulation method, extracts the steady-state conformation of an estrogen receptor alpha under the action of a ligand compound by recognizing local and global free energy lowest points and carrying out dynamic trajectory clustering, judges the estrogen interference effect of a tested compound according to the relation between the stable position of the No. 12 helix of the receptor and the recruitment/inhibition mechanism of the co-regulatory factor, and recognizes and predicts the simulation, resistance and mixed simulation and resistance interferents. Compared with the traditional in-vitro experiment method, the method has low cost and higher efficiency, and avoids the problem of cell specificity of mixed quasi-resistant interferents; compared with the existing computer-assisted screening method, the method can effectively identify the steady state conformation and realize the prediction of mixed simulation and antiestrogen interference effect.)

一种基于增强采样分子动力学模拟的混合拟、抗***干扰 物的识别方法

技术领域

本发明属于使用计算机程序进行预测毒理学领域，具体涉及一种采用计算机软件的基于增强采样分子动力学模拟的核受体介导的拟性、抗性和混合拟、抗性内分泌干扰物筛选和预测方法。

背景技术

内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)指通过干扰内分泌系统造成有害影响的化合物。EDCs在环境介质^1,2、食物³甚至人体血液^4,5中都有广泛检出，其暴露会对人体健康造成一系列影响，并造成巨大的经济损失，欧盟因EDCs导致的疾病花费为2170亿美元，占国内生产总值的1.28％，而美国的达到3400亿美元，占国内生产总值的2.33％^6,7。因而，EDCs的识别与控制一直是全世界环境健康与安全领域研究的热点。EDCs的主要作用途径是通过与细胞核中的激素受体结合并改变其功能，从而导致干扰效应。在过去30年中，由于***干扰物与生殖疾病⁸、出生缺陷⁹和乳腺癌¹⁰等风险之间的潜在关系，***受体α(estrogen receptorα,ERα)成为关于EDCs的研究中最为广泛、最受关注的受体¹¹。

EDCs可以通过核受体产生激动或拮抗效应(即拟性或抗性效应)，也有大量EDCs可同时引起拟性和抗性，如部分双酚类物质可以对ERα产生混合拟、抗性效应^12,13。EDCs的拟性和抗性效应会激活不同的有害结局路径(adverse outcome pathway,AOP)并导致不同的有害结局(adverse outcome,AO)。拟***效应会导致乳腺癌¹⁴，而抗***效应则与生殖紊乱相关(AOP:200,https://aopwiki.org/)。混合拟、抗性效应通常具有细胞、组织特异性^15–17，比如，双酚A在肝细胞系中同时具有ERα的拟性和抗性，但在乳腺癌细胞和成骨瘤细胞系中只有ERα的拟性¹⁸。这意味着具有混合拟、抗性效应的EDCs会影响更大范围的组织¹⁹，而只通过一种细胞系的筛选方法是不完善的，容易产生假阴性^20,21。EDCs可能在一种细胞系中呈现纯拟性效应，而在另一种细胞系中呈现抗性效应^12,13，因此，亟需改善现有的基于细胞的筛选方法，以有效筛查拟性、抗性和混合拟、抗性物质。

ERα介导的拟性、抗性效应的产生与共调节因子，包括共激活因子(coactivator,CoA)和共抑制因子(corepressor,CoR)，的作用密切相关。已有研究报道也说明了CoA和CoR对拟性、抗性和混合拟、抗性效应的重要性^22,23。事实上，已有结晶结果发现在混合拟、抗性效应物质作用下，核受体可以形成多稳态构象共存的现象，即同时形成多种不同类型的构象，受体的第12号螺旋(H12)稳定于不同的位置，并分别招募CoA和CoR，从而分别引起拟性和抗性效应²⁴。因此，于红霞等(于红霞,史薇,王小享.基于分子动力学模拟的核受体介导内分泌干扰物质的虚拟筛选方法:CN,CN103324861A[P].2013.)、张爱茜等(张爱茜,蔺远,彭素芬,刘磊,高常安,韩朔睽.一种有机物***受体激动和拮抗作用的识别方法:CN,CN101381894A[P].2009.)和于红霞等(于红霞,史薇,陈钦畅,王小享.一种基于核受体共调节因子的甲状腺激素干扰物虚拟筛选及其干扰活性的定量计算方法:CN,CN105893759A[P].2016)都曾采用分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟等计算机辅助的筛选方法，通过核受体H12的稳定情况和/或共因子招募情况预测配体化合物的内分泌干扰效应。然而，已有的计算机辅助的筛选方法，都只针对拟性或抗性效应建立预测模型，且没有全面考虑EDCs与受体结合后的变构和共因子招募过程及混合拟、抗性干扰物可能导致的多稳态构象共存的现象，因此，无法同时区分EDCs的拟性、抗性和混合拟、抗性效应。增强采样分子动力学模拟方法能促使EDCs-受体系统跳出局部能量最低点并搜索全局能量最低点，已经成功运用于核受体构象变化的研究^25,26，有助于探索EDCs可能导致的ERα多稳态共存现象及由此造成的混合拟、抗***效应。文献检索结果表明，在本发明完成之前，还未发现基于增强采样分子动力学模拟得到的ERα多稳态共存现象识别和预测混合拟、抗性***干扰物的报道。

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发明内容

本发明要解决的技术问题是基于增强采样分子动力学模拟方法提供一种发现ERα的稳态构象的方法，以解决现有方法在发现多稳态构象共存现象上的局限性。

本发明还要解决的技术问题是提供一种***受体α介导的拟性、抗性和混合拟、抗性干扰物筛选和预测方法，即根据配体化合物作用于ERα后导致ERα的功能性变化来预测配体化合物的拟性、抗性和混合拟、抗性干扰效应的方法，以解决现有技术存在的筛选和预测不准确等问题，同时构建一种基于计算机程序的迅速、高效、准确的混合拟、抗***干扰物的识别方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种基于增强采样分子动力学模拟的混合拟、抗***干扰物的识别方法，包括以下步骤：

(1)构建并优化***受体α(estrogen receptorα,ERα)的结构；构建并优化配体化合物结构，将配体化合物对接到ERα的激素结合口袋中，得到配体-ERα复合体；选取能有效提高受体第12号螺旋(helix 12,H12)运动性的集合变量，将所得配体-ERα复合体进行增强采样分子动力学模拟；

(2)根据增强采样分子动力学模拟得到的分子运动轨迹，选取能有效描述受体H12状态的集合变量，绘制自由能特征图并得到自由能低点；对增强采样分子动力学模拟得到的分子运动轨迹进行构象聚类，得到代表性构象；根据自由能低点和对应的代表性构象，提取代表性稳态构象；

(3)对于H12位于阻挡共激活因子和共抑制因子结合位置的稳态构象，判定为阻挡型构象；对H12位于暴露共激活因子结合位置而阻挡共抑制因子结合位置的稳态构象，判定为激活型构象；对于H12位于暴露共激活因子和共抑制因子结合位置的稳态构象，判定为竞争型构象；

(4)根据稳态构象类型及其数量，对于促使ERα形成单一阻挡型构象的配体化合物，判定为抗***干扰物；对于促使受体形成单一激活型构象的配体化合物，判定为拟***干扰物；对于促使受体形成单一竞争型构象或不止一种类型的稳态构象的配体化合物，判定为混合拟、抗***干扰物。

步骤(1)中，核受体选自蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中搜索并下载ERα的晶体结构，要求配体为***，分辨率小于2.5埃米，受体的优化方法为：首先在Swiss-PdbViewer软件下检查结构的完整性，并将残缺的氨基酸残基补充完整，然后在SYBYL软件下对受体添加氢原子，最后对受体赋予AMBER力场。

步骤(1)中，配体化合物的构建和优化方法为：采用Chem3D软件，将配体化合物分子结构先用分子力学阿林格力场2(Molecular Mechanics,Allinger Force Fieldversion2，MM2)进行初步优化，再在SYBYL软件下采用鲍威尔(Powell)梯度算法和特里波(Tripos)力场进行再次优化。

步骤(1)中，配体-受体复合体进行增强采样分子动力学模拟的方法为：配体和受体分别赋予CHARMM(Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics)力场，并浸入TIP3P模型水中，加入钠离子或氯离子平衡体系电荷后，进行能量最小化；经过正则系综和等温等压系综两步平衡后，使体系维持在300K和1个标准大气压下；最后进行不少于25纳秒的增强采样分子动力学模拟，高斯高度和宽度分别设置为4.0千焦每摩尔和0.2纳米。

步骤(1)中，能有效提高受体H12运动性的集合变量的选择方法为：采用ERα的L544与E380和L544与M522之间α碳原子的距离为集合变量进行增强采样分子动力学模拟。

步骤(2)中，能有效描述受体H12状态的集合变量的选择方法为：采用ERα的M543、L539、A350和L354四个氨基酸上α碳原子形成的二面角为集合变量1，L539、M534和M522三个氨基酸上α碳原子形成形成的夹角为集合变量2，绘制自由能特征图，描述H12的位置。

步骤(2)中，运动轨迹的构象聚类方法为：以H12的轨迹为基础，根据其均方根偏差，以0.16纳米为界限进行聚类，得到每个聚类的代表性构象。

步骤(2)中，代表性稳态构象的判断方法为：首先根据自由能特征图得到全局和局部自由能最低点及其自由能；其次选择全局自由能最低点和与其相差20kJ/mol以内的局部自由能最低点，获得对应的集合变量值；最后，根据集合变量值定位对应的聚类，并得到代表性构象，即为代表性稳态构象。

步骤(3)中，稳态构象类型的判断方法为：若H12上的α碳原子和V355与E380两者α碳原子的中点之间距离小于5埃米，则认为阻挡了共激活因子和共抑制因子结合位置；若H12上的α碳原子和V355与E380两者α碳原子的中点之间距离大于5埃米而小于10埃米，则认为暴露了共激活因子而主档了共抑制因子结合位置；若H12上的α碳原子和V355与E380两者α碳原子的中点之间距离大于10埃米，则认为暴露了共激活因子和共抑制因子结合位置。

步骤(1)、(2)、(3)中，对于第12号螺旋长度小于12个氨基酸的核受体，如***受体、甲状腺激素受体等，可以基于上述方法，根据受体与***受体α叠合后相对应的氨基酸设定集合变量、进行增强采样分子动力学模拟、判断受体的稳态类型和预测干扰类型。

本发明中，所述分子动力学模拟采用的分子模拟软件为gromacs和plumed软件包。

有益效果

本发明基于核受体变构和共调节因子调控机制，采用增强采样分子动力学模拟方法，通过自由能低点和动态轨迹聚类，提取配体化合物作用下ERα的稳态构象，并根据H12稳定位置与共调节因子招募/抑制机制的关系，判断受测配体化合物的内分泌干扰效应，筛选和预测拟性、抗性和混合拟、抗性干扰物。

本发明采用增强采样分子动力学模拟方法进行内分泌干扰效应的预测，首次建立了多稳态构象识别及混合拟、抗***干扰物预测方法。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)采用增强采样分子动力学模拟方法进行分子模拟，较为全面地发现核受体的全局和局部能量最低点，并通过动态轨迹聚类获得稳态构象；

(2)根据核受体H12稳定位置与共调节因子招募/抑制机制的关系，将稳态构象分为激活型、阻挡型和竞争型三种类型，并据此判断配体化合物的***干扰效应类型：拟性、抗性和混合拟、抗性；

(3)相比于传统体外实验方法，此方法成本低廉、效率更高，且避免了混合拟、抗性干扰物的细胞特异性问题；相比于已有的计算机辅助筛选方法，此方法更能有效识别稳态构象，实现混合拟、抗性干扰效应的预测。

附图说明

图1为本发明的拟、抗和混合拟、抗***干扰物虚拟筛选和预测流程图。

图2A为拟***标准物质作用下ERα的自由能特征图及对应的稳态构象。

图2B为混合拟、抗***标准物质作用下ERα的自由能特征图及对应的稳态构象。

图3A为12个配体化合物作用下ERα的自由能特征图及对应的稳态构象类型。

图3B为11个配体化合物作用下ERα的自由能特征图及对应的稳态构象类型。

图4为ERα稳态构象类型与共调节因子招募/抑制实验结果的比较。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

下面将结合本发明实施例和附图，对本发明技术方案清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一个具体的实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本研究领域其他普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，都处于本发明保护的范围。

以下实施例根据图1所示的流程图开展，所采用的受体为人类的ERα，配体化合物选择内源性******(E2)，混合拟、抗***标准品4-羟基他莫昔芬(OHT)和环境中常见的内分泌干扰物双酚类物质。

实施例1：ERα的分子动力学模拟

人类ERα结构来自蛋白质数据库中获得的PDB代码为3erd的ERα蛋白质结构，并通过Swiss-PdbViewer软件下检查结构的完整性和修补缺省残基。配体小分子，包括标准物质和环境中常见的内分泌干扰物双酚类物质，经过结构优化后，采用SYBYL 7.3中的Surflex-Dock模块对接于受体中形成配体-受体复合体。将复合体采用广受认可的增强采样分子动力学模拟方法——metadynamics模拟方法——进行增强采样分子动力学模拟，采用的分子模拟软件为gromacs和plumed软件包。以ERα中L544与E380和L544与M522之间α碳原子的距离作为集合变量开展metadynamics模拟，每个metadynamics模拟时间为25ns，温度为300K，高斯高度和宽度分别设置为4.0kJ/mol和0.2nm。

实施例2：分子动力学模拟结果分析

将本发明开展的metadynamics模拟所得分子模拟轨迹用于进一步分析。采用ERα的M543、L539、A350和L354四个氨基酸上α碳原子形成的二面角为集合变量1(CV1，单位为弧度)，L539、M534和M522三个氨基酸上α碳原子形成的夹角为CV2(单位为弧度)，绘制自由能(Free Energy，单位为kJ/mol)特征图，描述H12的位置，得到全局和局部自由能最低点，并通过构象聚类得到自由能最低点处的代表性构象，即为代表性稳态构象。根据代表性稳态构象的H12稳定位置，判断各稳态构象的类型。最后，根据稳态构象的类型和数量，预测化合物的活性：对于促使ERα形成单一阻挡型构象的配体化合物，预测为抗***干扰物；对于促使ERα形成单一激活型构象的配体化合物，预测为拟***干扰物；对于促使ERα形成单一竞争型构象或不止一种类型的稳态构象的配体化合物，预测为混合拟、抗***干扰物。

实施例3：标准物质E2、OHT的结果分析

对于纯拟性标准物质的E2，metadynamics模拟结果表明E2-ERα的稳态构象均为激活型构象(图2A)，这与已有报道的E2-ERα的晶体结构相一致。激活型构象的H12形成“空间位阻”效应从而选择性招募CoA。因此，纯拟性化合物E2作用下ERα形成激活型构象，导致受体选择性招募CoA，进而导致转录激活和纯拟性效应的产生。对于混合拟、抗性化合物的OHT，metadynamics模拟结果表明OHT-ERα具有多种类型的稳态构象(图2B)。OHT-ERα具有激活型、阻挡型和竞争型三种类型的稳态构象，其中阻挡型和竞争型构象都与已有报道的晶体结构相一致。阻挡型构象的H12阻挡了共激活因子(CoA)和共抑制因子(CoR)的结合表面从而抑制CoA的结合，而竞争型构象的H12同时暴露CoA和CoR的结合表面从而既能招募CoA又能招募CoR。因此，混合拟、抗性化合物OHT通过诱导OHT-ERα产生激活型、阻挡型和竞争型多种稳态构象，导致OHT-ERα在招募CoA产生拟性效应的同时具有招募CoR和抑制CoA并导致抗性效应的能力。以上结果表明，metadynamics模拟作为一种增强采样分子动力学模拟方法可用于研究配体作用下ERα的构象变化和稳态构象，用以预测ERα的混合拟、抗性效应。

实施例4：典型内分泌干扰物的活性预测——以双酚类物质(BPs)为例

选取23种BPs作为典型内分泌干扰物进行活性预测。采用本发明构建23个BPs-ERα复合体并进行metadynamics增强采样分子动力学模拟。得到的自由能特征图(图3A、图3B)表明，BPs作用下ERα可以形成单一稳态或多稳态构象。根据稳态构象类型和数量，我们将化合物预测为拟性、抗性和混合拟、抗性***干扰物(表1)：80-09-1、843-55-0和2081-08-5作用下ERα形成激活型稳态构象，预测结果为拟***干扰物；1571-75-1等6个配体化合物作用下ERα形成阻挡型稳态构象，预测结果为抗***干扰物；其它14个配体化合物作用下ERα形成多稳态构象，其中1478-61-1、91221-46-4和79-95-8形成激活和阻挡型稳态构象，1844-01-5等7个配体化合物形成激活和竞争型稳态构象，而80-05-7等4个配体化合物则形成激活、阻挡和竞争型稳态构象，这些化合物的预测结果都为混合拟、抗***干扰物。

实施例5：预测结果的细胞实验验证

对实施例4中化合物***干扰活性的预测结果采用细胞实验进行验证。基于稳定转染带有由***效应原件驱动的荧光素酶报告基因的人乳腺癌细胞MVLN细胞系，我们测试了部分配体化合物的***干扰活性，并综合已有报导的数据，总结了23个配体化合物的***干扰效应(表1)，其中5个为拟***干扰物，8个为抗***干扰物，另外10个为混合拟、抗***干扰物。将预测结果与细胞实验结果相比较，发现23个配体化合物中，19个配体化合物的***干扰活性预测结果准确，准确率达到82.8％；其它4个配体化合物预测错误，它们的预测结果都是混合拟、抗***干扰物，却只检测出拟性或抗性效应，这可能跟混合拟、抗性干扰物的细胞和组织特异性有关。

表1根据配体化合物-ERα的稳态构象类型进行活性预测及与细胞实验结果的比较

注：“Y”表示模拟结果具有该类型稳态构象；“拟性”、“抗性”和“混合”分别代表拟***效应、抗***效应和混合拟、抗***效应。

实施例6：预测结果的共调节因子实验验证

对实施例4中部分配体化合物***干扰活性的预测结果采用共调节因子实验进行验证。由于共调节因子(包括CoA和CoR)对ERα的激活过程具有决定性作用，招募CoA可以视为拟性物质活性产生的标志，而招募CoR和抑制CoA则可以视为抗性物质活性产生的标志。因此，拟性干扰物选择性招募CoA，抗性干扰物抑制CoA，而混合拟、抗性干扰物招募CoA并招募CoR和/或抑制CoA。我们采用CoA招募、CoA抑制、CoR招募和CoR抑制实验检测了15个配体化合物的ERα干扰活性，结果显示(图4)：诱导单一激活型构象的80-09-1可招募CoA并抑制CoR，是拟性干扰物；诱导单一阻挡构象的1571-75-1等可抑制CoA和CoR，是抗性干扰物；诱导多稳态构象的配体化合物则可招募CoA并抑制CoA和/或招募CoR，是混合拟、抗性干扰物。因此基于增强采样分子动力学模拟的预测结果与基于共调节因子招募/抑制实验的结果相一致，因此，基于metadynamics的增强采样分子动力学模拟可用于研究受体的稳态构象并预测EDCs的干扰效应类型：纯拟性干扰物诱导产生单一的激活型稳态构象；纯抗性干扰物诱导产生单一的阻挡型稳态构象；而混合拟、抗性干扰物诱导产生单一的竞争型稳态构象或多稳态构象。