阅读说明：本技术 用于打印生物材料的方法和系统 (Method and system for printing biological material ) 是由 梅兰妮·P·马修 于 2018-03-09 设计创作，主要内容包括：本公开内容提供了用于打印三维(3D)材料的方法和系统。在一些实例中,用于打印3D生物材料的方法包括提供包含介质的介质室,所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体。随后,可以根据计算机存储器中用于打印3D生物材料的计算机指令,沿着被图案化为其中x、y和z维度可以被同时存取的3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质,以形成所述3D生物材料的至少一部分,所述3D生物材料包括(i)所述多个细胞的至少子集,和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物。(The present disclosure provides methods and systems for printing three-dimensional (3D) materials. In some examples, a method for printing a 3D biomaterial includes providing a media chamber comprising a medium comprising (i) a plurality of cells and (ii) one or more polymer precursors. Subsequently, at least one energy beam can be directed to the medium in the medium chamber along at least one energy beam path patterned as a 3D projection in which x, y, and z dimensions can be accessed simultaneously to form at least a portion of the 3D biomaterial according to computer instructions in computer memory for printing a 3D biomaterial, the 3D biomaterial comprising (i) at least a subset of the plurality of cells, and (ii) a polymer formed from the one or more polymer precursors.)

用于打印生物材料的方法和系统

交叉引用

本申请要求于2017年3月10日提交的美国临时专利申请号62/469,948的权益，该申请通过引用整体并入本文。

背景技术

迄今为止，尽管在细胞生物学、微流体、工程学和三维打印领域取得了显著进展，但常规方法未能再造供给并支撑构建人体器官所必需的厚组织的功能性毛细血管。迄今为止，组织工程学中的这些方法依赖于血管向组织工程化设备中的内向生长，以实现持久的脉管形成。该策略适用于一些非常薄的组织(如膀胱壁置换)或不需要脉管系统工作的组织(如骨置换)。然而，当前的组织工程化技术在产生复杂组织如大型重要器官(包括肝、肾、厚皮和心脏)方面达不到要求。较大的组织也可以看作是较小的组织亚单位的组织；例如，肾由数十万个肾单位组成，肺的功能单位(即肺泡腔)的总表面积为70至80平方米(m²)，但其仅为1个细胞壁，厚度为5至10微米(μm)。当前的组织打印方法不仅不能再造支撑厚度大于300微米(μm)的组织所必需的精细微脉管系统，而且不能将细胞组织成器官功能所必需的结构取向和小生境。

在化学和物理学中，基于多光子激光的激发用于使用光聚合反应以亚纳米分辨率生成微结构，其中光聚合是材料基于光的聚合。在1981年，首次描述了使用双光子显微镜诱导聚合。随后通过沿x-y维度光栅扫描精确聚焦的激光，逐行绘制出结构，将其用于构建微米至纳米级的零件和工具。双光子激发的高分辨率精确允许了亚纳米级的打印分辨率，以及可光聚合的塑料的增材制造。随着双光子技术的发展以及双光子激发与激光扫描显微镜的结合，对活体组织进行成像成为可能。多光子激发中使用的通常大于700纳米(nm)的长波长由于减小的瑞利散射、最小的荧光探针的光漂白以及无可检测组织毒性的最小毒性而允许更大的组织穿透。因此，多光子激光激发在生物学中逐渐用于组织的非侵入性成像，其深度大于基于单光子激光的共聚焦成像所能达到的深度。

此后不久描述了通过使用由两光子和三光子吸收所激发的内源探针，其使活细胞成像的时间延长了通常超过几小时。双光子成像的最早应用之一是在植物学领域，该领域首先描述了双光子激发对活细胞固有的低毒性。随着其在神经元信号传导研究中的应用，双光子显微镜被证明是哺乳动物细胞中重要的低毒性光成像工具，其中双光子激发足够温和，而不会在施加外部刺激之前触发单个神经元的激发。在2002年，视频速度双光子成像被证明对整个组织如***中的哺乳动物活细胞无毒。之后，使用双光子显微镜检查了皮肤、肺、脾、肝和多种其他组织中的活细胞。现在，延长的成像时间长达24小时，而对细胞的生物学活性或活力没有明显的负面影响，并且已经在许多哺乳动物的细胞和组织中得以实施。

总之，单个细胞的高活力与使生物材料聚合的能力相结合已使多光子激发成为用于在无细胞培养基和含有待嵌入细胞的培养基中使材料聚合的理想工具。因此，基于多光子激光的激发已用于一些三维组织结构的组织工程化，但是，如当前技术所述，与使用二维光栅扫描打印复杂结构相关的速度受到的显著限制迄今为止使产生复杂的、包括功能器官在内的多细胞三维组织结构无法进行。这是由于在单个单元(扫描线)过程的制造速度和分辨率方面存在固有的权衡。例如，估计以足以产生以立方厘米计的组织的精细分辨率进行的激光的光栅扫描可能要花费三十多年才能完成。但是，在组织工程学领域，三维组织结构的前景为需要进行器官移植的患者提供了有前景的治疗选择的希望，并且提供了基于经历错误的整个人源组织而非动物模型的改善药物发现和研究。

已经示出，组织工程学的多光子激发方法优于基于挤出或喷雾的打印技术，这些技术依赖于将通过喷嘴压出的材料沉积成预定的图案或形状，从而生成结构。基于喷雾或小液滴的细胞打印缺乏分辨率、生物相容性，相对较慢且不可扩展，因此无法构建整个组织。存在于所有器官和组织中的微脉管系统或毛细血管的直径为至多例如5至10微米。这种精细结构的脉管系统对于组织的存活必不可少。当前的小液滴或喷雾打印方法不具有产生小于50微米的脉管结构的能力。因此，迄今为止，尚无存活的厚于约例如250至300微米的组织结构的报道，该厚度是氧扩散和废物交换的极限。如果没有来自微脉管系统的适当灌注，厚于例如250至300微米的组织会缺氧且急需营养，最终会坏死并由内而外死亡。此外，使用当前的挤出或基于小液滴的打印方法无法实现打印支撑组织完整性和功能所必需的微脉管系统所需的单细胞层和精细分支。

在细胞水平上缺乏分辨率进一步限制了复杂或小规模三维结构以及取决于多种细胞类型或细胞层的直接相互作用的细胞小生境的发展。预打印精细结构或使用预打印的非细胞支架可以实现产生微脉管系统所必需的分辨率，但是这些结构需要细胞接种，从而限制了将细胞置于特定取向或小生境中的能力，增加了组织的发育时间，并导致降低的细胞活力，因为许多细胞接种技术需要用力将细胞嵌入小的多孔结构中。此外，打印的支架结构的刚性通过限制细胞引导的架构和结构变化以及通过限制新血管的发育而阻碍了完全相容的生物学功能组织的发育。另外，打印的支架结构的刚度限制了适应功能性小生境的架构变化，由于细胞是固定的并且在此类刚性结构中只能沉积少数几种类型的细胞，因此阻止了脉管化组织的发育。

在挤出打印中，细胞活力也受到损害，并且打印时间太慢而无法在打印组织结构所必需的延长的时间段内维持细胞活力。挤出打印的可扩展性也受到固有限制，使得其不能解决分辨率问题，因此挤出打印不具有大规模打印组织的能力。打印的组织的大小和功能受到一系列因素的限制。这些限制因素包括无法扩展到更大的器官大小的结构(打印时间)、打印期间的细胞活力、产生多细胞三维小生境的能力、最终结构的非柔性以使得可能发生天然细胞诱导的发育，以及缺乏仅允许最大组织厚度为例如250至300微米的微脉管系统、。因此，当前的挤出打印技术在组织工程学中的应用受到生产时间长和缺乏足够精细以精确生产复杂的脉管化三维结构的分辨率的限制。另外，挤出技术通常不允许将细胞直接放置在打印介质中，不具有生物相容性，并且不允许通过发育过程改变结构。

在组织微加工领域中已采用双光子激发来加快生产时间并改善打印分辨率。脉冲双光子激光器是波长可调的，并且产生材料的精确的超快亚纳米分辨率的聚合。双光子光聚合已应用于隔离限定结构内的单一细胞类型。但是，用于细胞技术的双光子封装技术由于多种原因而受到显著限制，主要原因是与三维结构的逐步另外产生相关的时间，因此无法产出生产脉管组织所必需的必要复杂毛细血管网络或多细胞结构。

主要的限制包括这些技术并不总是生物相容的问题，这在很大程度上是由于对生物不相容的光引发剂的依赖。进一步的限制包括但不限于打印速度，以使得在细胞活力的窗口内只能产生仅包含少量细胞的小结构。因此，当前的双光子细胞封装方法无法产生足够大的组织结构以用于器官移植和用于大多数基于组织的应用。另外，没有允许在组织生长和发育期间所必需的细胞超结构流动以及促进细胞-细胞的接触的措施，这两者对于功能性组织的生长和发育都是必需的。没有用于引入另外的细胞层的措施。并且最后，没有用于允许将一定张力施加到发育细胞床上的网络特异性结构化的措施，这是脉管发育的必要步骤。

当前的打印或沉积技术不允许特定的细胞移动、细胞-细胞相互作用以及组织结构的最终发育。这些在发育期间自然发生的细胞固有行为对于活组织的形成至关重要。组织是由处于多种分化状态的细胞组成的三维结构，每个细胞具有特定的功能。能够有效地用作置换组织的具有生物活性和自我维持的组织的发育要求细胞相对于其他细胞以及相对于结构元件如脉管系统、腱、骨基质和组织的其他结构组分的适当定位。分化通常由遗传变化驱动，遗传变化可能直接导致结构变化，诸如退化、结构上的显著转变，并且/或者可能通过组织特异性的结构蛋白、功能蛋白或信号传导蛋白的表达变化促进组织发育。例如，在形态发生、伤口修复和癌症侵袭期间，细胞以较大的片、链或簇的形式共同移动，从而允许快速的基于接触的力生成或共同极化。这些细胞移动共同地对于适当的组织形成和功能是必需的。这些细胞移动和暴露于不同环境力如血流是导致功能性组织分化的关键发育线索的原因。例如，由于动脉和静脉毛细血管由统一的前体细胞形成，该前体细胞的基因表达经历显著转变，驱动表型分化并导致功能性脉管结构源自同一细胞类型。此外，支撑和允许拉伸和压力变化的结构耐受性对于脉管功能和维持脉管内皮细胞同一性是必需的。实际上，脉管壁具有作为其主要组分之一的弹性纤维沉积。尽管有许多方法利用生物打印技术来发育血管，但目前尚无报道或假设的过程允许结合基于链的结构的沉积以形成用于脉管发育的细胞小生境或片或链组件中的细胞移动。简言之，当前开发和描述的用于基于组织的细胞打印的结构并未被设计成耐受或支撑这些力，并且尚未证明适当的脉管形成或微脉管(毛细血管)发育。如果不使用毛细血管进行脉管形成，则打印的细胞只能在极薄的片中生存，该极薄的片由于提供废物和营养交换的氧气和营养扩散而被限制在例如200-300微米。因此，在没有微脉管系统的情况下发育功能性可移植组织是不可能的。

发明内容

本文认识到用于将细胞打印到组织形成结构中的先前描述的方法的多种问题。此类方法可能受到以下限制：(i)产生复杂的脉管化组织所必需的细胞种类繁多；(ii)不允许发生超结构移动的刚性结构，所述超结构移动是进一步分化所必需的发育变化的必需元件或促进所述发育变化；(iii)具有不同结构刚度或力矩的元件，其可以促进或适应发育期间相似或不同细胞层之间的细胞-细胞相互作用；(iv)缺乏细胞类型特异性的通道或网；以及(v)缺乏预先打印(第一步)或重新打印(中间或最终步骤)的脉管细胞，(vi)被设计成允许细胞-细胞相互作用，同时承受机械力，包括组织内的压力、张力、扭曲、拉伸或者脉管发育、分化和功能所必需的运动的结构。

另外，单光子光栅扫描打印和一片光的二维投影作为制造过程都可能比本文提供的方法和系统显著更慢。在一些情况下，估计使用单光子光栅扫描会花费数十年，且在2D投影的情况下会花费数周而产生的结构使用本文提供的三维(3D)全息打印方法和系统可能在约24小时或更短的时间内产生。此外，当一次投影整个结构时，本文提供的3D全息打印方法和系统可以不依赖于填充因子，因为打印在立方体体积内的所有点处同时进行打印。因此，当使用诸如本文提供的3D全息打印方法和系统所使用的全息打印投影时，打印速度可以不与分辨率挂钩。当使用本文提供的3D全息打印方法和系统时，打印速度可以取决于体积，并且打印体积可以由静态光学组件决定。

迄今为止，组织工程学领域可能未能产生这样的响应性的生物活性的脉管化组织，在足够大以用于移植、系统集成药物测试和/或诸如人抗体的生物疗法开发的结构中表现如天然组织一般。

基于以下原因，双光子激光器可能提供低细胞毒性谱：1)双光子激发的精确位点，所述定点位置根据在x、y和z维度上距焦点的距离的平方而下降，使得峰值激光功率可能不会散布到整个样品中；2)激发点的快速x、y扫描，其在激发点处使细胞暴露于峰值激光功率的时间最小化；以及3)超短的亚皮秒的脉冲宽度，这可能允许几乎没有光子与材料或细胞接合的时间间隙。

在一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的方法，包括：(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞，和(ii)一种或多种聚合物前体；以及(b)根据计算机存储器中用于打印所述3D生物材料的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以形成所述3D生物材料的至少一部分，所述3D生物材料包括(i)所述多个细胞的至少子集，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物。

在一些实施方式中，所述生物材料发育成生物功能性组织。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前，在计算机存储器中生成所述3D生物材料的点云表示(point-cloud representation)或基于线的表示(lines-based representation)，并且使用所述点云表示或基于线的表示来生成所述计算机指令。在一些实施方式中，所述方法还包括将所述点云表示或基于线的表示转换为图像。

在一些实施方式中，所述图像以全息方式投影。在一些实施方式中，在以全息方式投影之前对所述图像进行解构和重构。在一些实施方式中，所述点云表示或所述基于线的表示包括对应于所述3D生物材料的多维结构元件。在一些实施方式中，所述点云表示或所述基于线的表示包括二维的结构元件，其中所述结构元件与组织功能和/或细胞分离相关联。在一些实施方式中，点云表示或所述基于线的表示包括三维的结构元件，其中所述结构元件与组织功能和/或细胞分离相关联。

在一些实施方式中，所述至少一个能量束包括相干光。在一些实施方式中，所述至少一个能量束由激光器生成。在一些实施方式中，所述至少一个能量束是相位调制的。在一些实施方式中，所述一种或多种聚合物前体包括至少两种不同的聚合物前体。

在一些实施方式中，所述方法还包括沿着一个或多个另外的能量束路径重复(b)以形成所述3D生物材料的至少另一部分。在一些实施方式中，所述3D生物材料的所述至少另一部分与在(b)中形成的所述3D生物材料链接。在一些实施方式中，所述3D生物材料的所述至少另一部分不与在(b)中形成的所述3D生物材料链接。在一些实施方式中，(b)还包括根据所述计算机指令，沿着至少两个能量束路径将至少两个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以允许所述介质室中的所述介质的多个部分同时形成所述3D生物材料的至少一部分。

在一些实施方式中，所述至少两个能量束具有相同的波长。在一些实施方式中，所述至少两个能量束具有不同的波长。在一些实施方式中，所述3D生物材料的所述至少一部分包括微脉管系统，以向所述多个细胞提供一种或多种营养物。在一些实施方式中，所述微脉管系统是血液微脉管系统、淋巴微脉管系统或其任何组合。在一些实施方式中，所述微脉管系统具有约1μm至约20μm的横截面。在一些实施方式中，所述3D生物材料具有约100μm至约5cm的厚度或直径。

在一些实施方式中，所述介质还包括多个珠子，并且其中在(b)中，形成的所述3D生物材料的所述至少一部分包括所述多个珠子。在一些实施方式中，所述珠子还包含信号传导分子或蛋白质。在一些实施方式中，所述信号传导分子或蛋白质促进所述3D生物材料的形成以允许器官功能。在一些实施方式中，所述3D生物材料的所述至少一部分包括含细胞的支架，所述含细胞的支架包括所述多个细胞的至少子集。在一些实施方式中，所述3D生物材料包括含细胞的支架。

在一些实施方式中，所述含细胞的支架耦合在一起。在一些实施方式中，所述含细胞的支架粘结地或机械地耦合在一起。在一些实施方式中，所述含细胞的支架通过选自以下的一种或多种构件机械地耦合在一起：接头、铰链、锁定接头和铰链、Velcro样元件、弹簧、线圈、拉伸点、互锁环、承窝、齿轮、棘轮、螺钉和链节。在一些实施方式中，所述含细胞的支架包含网络，其中所述网络包含多条绞线。在一些实施方式中，所述多条绞线形成网状结构、网格结构、片状结构或管状结构。在一些实施方式中，所述多条绞线中的单条绞线具有约0.1nm至约5cm的厚度。

在一些实施方式中，在(b)之后，在所述3D生物材料的所述至少一部分内形成所述3D生物材料的所述至少另一部分。在一些实施方式中，所述计算机指令包括对应于所述3D生物材料的图像集合。在一些实施方式中，所述计算机指令引导至少以下的调整：(i)根据所述3D生物材料形成期间的时间的所述至少一个能量束的一个或多个参数，和/或(ii)所述3D生物材料形成于其上的台的位置。

在一些实施方式中，所述方法还包括使所述多个细胞的所述至少子集的至少一部分经历分化以形成至少两种不同类型的细胞。在一些实施方式中，所述多个细胞的所述至少子集包括所述至少两种不同类型的细胞。在一些实施方式中，在(b)中，所述多个细胞包括所述至少两种不同类型的细胞。在一些实施方式中，所述至少一个能量束是多光子能量束。在一些实施方式中，所述多光子能量束是双光子能量束。

在另一方面，本公开内容提供了打印三维(3D)生物材料的方法，包括：(a)提供包含第一介质的介质室，其中所述第一介质包含第一多个细胞和第一聚合物前体；(b)根据计算机存储器中用于打印所述3D生物材料的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述介质室中的所述第一介质的至少一部分形成所述3D生物材料的第一部分；(c)在所述介质室中提供第二介质，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中所述第二多个细胞与所述第一多个细胞是不同的类型；以及(d)根据所述计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D生物材料的至少第二部分。

在一些实施方式中，所述生物材料是生物功能性组织。在一些实施方式中，所述方法还包括在(d)之后，从所述介质室去除剩余的所述第一介质，以将所述3D生物材料的所述第一部分留在所述介质室中。在一些实施方式中，留在所述介质室中的所述3D生物材料的所述第一部分被可移除地固定到所述介质室。在一些实施方式中，所述方法还包括在(b)之前，在计算机存储器中生成所述3D生物材料的点云表示或基于线的表示，并且使用所述点云表示或基于线的表示来生成所述计算机指令。

在一些实施方式中，所述方法还包括将所述点云表示或基于线的表示转换为图像或图像集合，所述图像或图像集合用于在空间上调制入射的相干光源，使得生物结构以一维投影。在一些实施方式中，所述方法还包括将所述点云表示或基于线的表示转换为图像或图像集合，所述图像或图像集合用于在空间上调制入射的相干光源，使得生物结构以二维投影。在一些实施方式中，所述方法还包括将所述点云表示或基于线的表示转换为图像或图像集合，所述图像或图像集合用于在空间上调制入射的相干光源，使得生物结构以三维投影。

在一些实施方式中，所述方法还包括将所述点云表示或基于线的表示转换为图像或图像集合，所述图像或图像集合用于在空间上调制至少一种入射的相干光源，使得生物结构以一维、二维和/或三维结构的混合投影。在一些实施方式中，所述图像或图像集合以全息方式投影。在一些实施方式中，在以全息方式投影之前将所述图像或图像集合解构和重构为部分元件或代表性结构。

在一些实施方式中，所述点云表示或所述基于线的表示包括对应于所述3D生物材料的多维结构元件。在一些实施方式中，所述点云表示或所述基于线的表示包括二维的结构元件，其中所述结构元件与组织功能和/或细胞分离相关联。在一些实施方式中，所述点云表示或所述基于线的表示包括三维的结构元件，其中所述结构元件与组织功能和/或细胞分离相关联。

在一些实施方式中，所述至少一个能量束包括相干光。在一些实施方式中，所述至少一个能量束由激光器生成。在一些实施方式中，所述至少一个能量束是相位调制的。在一些实施方式中，在整个样品介质中对所述至少一个能量束进行相位调制和光栅扫描。在一些实施方式中，所述3D生物材料的所述至少一部分包括微脉管系统，以向所述多个细胞提供一种或多种营养物。在一些实施方式中，所述微脉管系统是血液微脉管系统、淋巴微脉管系统或其任何组合。在一些实施方式中，所述微脉管系统具有约1μm至约20μm的横截面。在一些实施方式中，所述3D生物材料具有约100μm至约5cm的厚度或直径。

在一些实施方式中，所述第一介质和/或所述第二介质还包括多个珠子，并且其中在(b)中，形成的所述3D生物材料的所述至少一部分包括所述多个珠子。在一些实施方式中，所述珠子还包含信号传导分子或蛋白质。在一些实施方式中，所述信号传导分子或所述蛋白质促进所述3D生物材料的形成以允许器官功能。在一些实施方式中，所述3D生物材料在至多约350小时的时间段内打印。在一些实施方式中，所述3D生物材料在至多约72小时的时间段内打印。在一些实施方式中，所述3D生物材料在至多约12小时的时间段内打印。

在一些实施方式中，所述3D生物材料的所述至少一部分包括含细胞的支架，所述含细胞的支架包括所述多个细胞的至少子集。在一些实施方式中，形成的所述3D生物材料包括多个含细胞的支架。在一些实施方式中，所述多个含细胞的支架耦合在一起。在一些实施方式中，所述多个含细胞的支架耦合在一起以形成粘结结构。在一些实施方式中，所述多个含细胞的支架机械地耦合在一起。在一些实施方式中，所述多个含细胞的支架通过选自以下的一种或多种构件机械地耦合在一起：接头、铰链、锁定接头和铰链、Velcro样元件、弹簧、线圈、拉伸点、互锁环、承窝、齿轮、棘轮、螺钉和链节。

在一些实施方式中，所述含细胞的支架包含网络，其中所述网络包含多条绞线。在一些实施方式中，所述多条绞线形成网状结构、网格结构、片状结构或管状结构。在一些实施方式中，所述多条绞线具有约0.1nm至约5cm的厚度。在一些实施方式中，在(d)之后，在所述3D生物材料的所述第一部分和/或所述3D生物材料的所述第二部分内形成所述3D生物材料的至少另一部分。在一些实施方式中，所述第一介质和/或所述第二介质还包含谷胱甘肽或其功能变体。

在另一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的系统，包括：(a)被配置成含有介质的介质室，所述介质包含含有至少两种不同类型的细胞的多个细胞以及一种或多种聚合物前体；(b)被配置用于将至少一个能量束引导至所述介质室的至少一个能量源；以及(c)可操作地耦合到所述至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印所述3D生物材料的计算机指令；和(ii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以使所述聚合物前体的至少一部分形成所述3D生物材料的至少一部分。

在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于在计算机存储器中生成所述3D生物材料的点云表示或基于线的表示，并且使用所述点云表示或基于线的表示来生成所述计算机存储器中用于打印所述3D生物材料的所述计算机指令。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于将所述点云表示或基于线的表示转换为图像。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于以全息方式投影所述图像。

在一些实施方式中，所述至少一个能量源是多个能量源。在一些实施方式中，所述多个能量源引导多个所述至少一个能量束。在一些实施方式中，所述至少一个能量源是激光器。在一些实施方式中，所述至少一个能量源衍生自相干光源。在一些实施方式中，所述相干光源包括约300nm至约5mm的波长。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于引导所述至少一个能量源，以沿着一个或多个另外的能量束路径引导所述至少一个能量束，以形成所述3D生物材料的至少另一部分。在一些实施方式中，所述一个或多个另外的能量束路径沿着x轴、x和y平面或者x、y和z平面。

在一些实施方式中，所述方法还包括至少一个物镜，用于将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质。在一些实施方式中，所述至少一个物镜包括水浸物镜。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于接收所述3D生物材料的边缘的图像。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于引导所述3D生物材料与其他组织的链接，所述连接根据所述计算机指令。在一些实施方式中，所述多个细胞包括至少两种不同类型的细胞。在一些实施方式中，所述介质还包含谷胱甘肽或其功能变体。

在另一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的系统，包括：(a)被配置成含有介质的介质室，所述介质包含多个细胞以及多种聚合物前体；(b)被配置用于将至少一个能量束引导至所述介质室的至少一个能量源；以及(c)可操作地耦合到所述至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印所述3D生物材料的计算机指令；(ii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以使所述聚合物前体的至少一部分形成所述3D生物材料的至少一部分；和(iii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D生物材料的至少第二部分，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中所述第二多个细胞与所述第一多个细胞是不同的类型。

在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于生成所述3D生物材料的点云表示或基于线的表示，并且使用所述点云表示或基于线的表示来生成所述计算机存储器中用于打印所述3D生物材料的所述计算机指令。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于将所述点云表示或基于线的表示转换为图像。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于以全息方式投影所述图像。在一些实施方式中，所述至少一个能量源是多个能量源。在一些实施方式中，所述多个能量源引导多个所述至少一个能量束。在一些实施方式中，所述至少一个能量源是激光器。在一些实施方式中，所述至少一个能量源衍生自相干光源。

在一些实施方式中，所述相干光源包括约300nm至约5mm的波长。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于引导所述至少一个能量源，以沿着一个或多个另外的能量束路径引导所述至少一个能量束，以形成所述3D生物材料的至少另一部分。在一些实施方式中，所述一个或多个另外的能量束路径沿着x轴、x和y平面或者x、y和z平面。在一些实施方式中，所述系统还包括至少一个物镜，用于将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质。在一些实施方式中，所述至少一个物镜包括水浸物镜。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于接收所述3D生物材料的边缘的图像。在一些实施方式中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于引导所述3D生物材料与其他组织的链接，所述连接根据所述计算机指令。在一些实施方式中，所述介质还包含谷胱甘肽或其功能变体。

在另一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)物体的方法，包括：将至少一个能量束引导至包含一种或多种前体的介质中，以生成包含由所述一种或多种前体形成的材料的3D物体，其中所述至少一个能量束作为对应于所述3D物体的3D投影被引导至所述介质中。

在一些实施方式中，所述材料是聚合物材料。在一些实施方式中，所述介质包含细胞或细胞成分。在一些实施方式中，所述一种或多种前体是聚合物前体。在一些实施方式中，所述一种或多种前体包括一种或多种金属。在一些实施方式中，所述3D投影是全息图。在一些实施方式中，所述介质还包含谷胱甘肽或其功能变体。

在另一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的方法，包括：(a)将至少第一能量束引导至包含第一介质的介质室中，所述第一介质包含(i)第一多个细胞和(ii)第一聚合物前体，以生成所述3D生物材料的第一部分，以及；(b)将至少第二能量束引导至包含第二介质的所述介质室中，所述第二介质包含(i)第二多个细胞和(ii)第二聚合物前体，以生成邻近于所述3D生物材料的所述第一部分的所述3D生物材料的第二部分。

在一些实施方式中，所述至少第一能量束和所述至少第二能量束来自相同的能量源。在一些实施方式中，所述至少第一能量束和所述至少第二能量束是激光束。在一些实施方式中，所述第一多个细胞中的细胞和第二多个细胞中的细胞是不同类型。在一些实施方式中，所述第一多个细胞中的细胞和第二多个细胞中的细胞是相同类型。在一些实施方式中，所述第一聚合物前体和所述第二聚合物前体不同。在一些实施方式中，所述第一聚合物前体和所述第二聚合物前体相同。在一些实施方式中，所述第一介质和/或第二介质还包含谷胱甘肽或其功能变体。

本公开内容提供了使用多光子激发源的空间光调制来快速生成多层脉管化组织的方法和系统。使用该方法，通过将具有嵌入式机械和/或生物元件(如微脉管系统)的细胞大小特异性的网分层来提供快速产生含细胞的结构的方法。基于三维(全息)投影、二维投影和/或在任何平面轴(如x,y、x,z或y,z)上，胶原网或者其他生物相容性或惰性材料网中包含的细胞的沉积是快速的迭代的过程，可以与多光子激光激发的扫描进行结合。可以以各种组合同时使用三维扫描、二维扫描和光栅扫描，以实现快速产生完整结构。激光投影模式之间的动态转变允许在大视场中快速生成复杂的结构，同时维持微米至纳米级的精细分辨率。该方法允许快速产生较大(例如，至多约5厘米(cm))多层脉管系统和较小脉管系统(例如，1-10微米(μm))单细胞层的脉管系统。

本公开内容允许在二维和/或三维上对多种细胞类型进行分层，使得可以以不受多种细胞类型、大小或复杂性限制的方式构建组织。在一些情况下，这通过使用多光子(例如，双光子)激发光来实现，如可由例如激光所提供的。

本公开内容的另一方面提供了包括机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文其他各处的任何方法。

本公开内容的另一方面提供了包括一个或多个计算机处理器以及与其耦合的计算机存储器的系统。所述计算存储器包括机器可执行代码，所述机器可执行代码在由所述一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文其他各处的任何方法。

通过以下在其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方式的详细描述，本公开内容的其他方面和优点将会对本领域技术人员而言变得显而易见。如将认识到的，本公开内容能够具有其他的和不同的实施方式，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些均不脱离本公开内容。因此，附图和说明书在本质上将被视为是说明性而非限制性的。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾时，说明书旨在替代和/或优先于任何这样的矛盾材料。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述以及附图(本文也称“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些附图中：

图1图示了用于期望组织的快速多光子打印的系统的实施方式。

图2A-图2D图示了在介质室内生成期望组织的示例性阶段。图2A图示了包含含有第一细胞组的介质的介质室。图2B图示了包含含有第二细胞组的介质的介质室。图2C图示了多光子激光束的脉冲向介质的递送。图2D图示了其中沿包含介质的介质室的底部打印含细胞的支架的实施方式。

图3A-图3C图示了激光系统的各个实施方式。图3A图示了具有单个多光子激光源的激光系统的实施方式。图3B图示了具有多条激光线的激光系统的实施方式。图3C图示了包含多条激光线、光电倍增管(PMT)和物镜的激光系统的实施方式。

图4A-图4C图示了打印系统的各个实施方式。图4A图示了这样的打印系统的实施方式，其包含光束扩展器、光学聚焦透镜、另外的激光聚焦透镜，并且没有轴棱锥透镜或TAG透镜。图4B图示了这样的打印系统的实施方式，其包含光束扩展器、光学聚焦透镜、另外的激光聚焦透镜，以及轴棱锥透镜或TAG透镜。图4C图示了Z步长投影打印设置，其包含用于2D的x,y片状或全息投影的单个SLM或DMD，用于在以给定Z步长打印的细胞和所得结构周围的打印打印。

图5A-图5B图示了多光子组织打印头的各个实施方式。图5A图示了包括单个竖直物镜的多光子组织打印头的实施方式。图5B图示了具有用于对结构进行成像的倒置光学器件的多光子组织打印头的实施方式。

图6A-图6B图示了可移除和可附接的纤维光缆附件的实施方式。图6A图示了纤维光缆附件和纤维光缆。图6B图示了用于打印期望的复杂组织结构的纤维光缆附件。

图7图示了其中打印头光学器件包括至少三个物镜的实施方式，其中每个物镜包括引导进入单个介质室的纤维光缆附件。

图8图示了其中打印头光学器件包括至少六个物镜的实施方式，其中每个物镜包括引导进入单独的介质室如多孔板中的单独的孔的纤维光缆附件。

图9图示了具有充当打印头的物镜阵列的打印头光学器件的实施方式。

图10图示了被编程用于在X和Y方向上在多孔板上方移动以将激光束投影递送到每个孔中的物镜。

图11图示了由可聚合材料形成的示例性网结构。

图12A-图12B图示了网结构的各个实施方式。图12A图示了由具有约0.1微米的厚度的链组成的网。图12B图示了由具有大约5微米的厚度的链组成的网。

图13图示了暂时诱捕在网内的圆形细胞。

图14图示了彼此靠近安设的第一网和第二网，使得细胞能够移动通过孔径并在生理条件下接合。

图15A-图15C图示了在网结构500内产生这样的结构特征的区域的方法。图15A图示了网结构的生成。图15B图示了来自靶向网结构内的特定坐标的激光束的多光子激光束的第二投影。图15C图示了在网链的预定相交处具有各种增强点的最终网结构。

图16A-图16D图示了在网内产生这样的结构特征的区域的另一方法。图16A示出了通过将来自多光子组织打印打印头的光学器件的多光子激光束投影到介质中来生成网结构。图16B图示了靶向网结构内的特定坐标的多光子激光束的第二投影。图16C图示了具有增强的Z字形结构特征的最终网结构。图16D图示了引导结构变形的较厚的网区域。

图17A-图17B图示了使用网内的结构特征来引起组织结构折叠或起皱。图17A图示了在介质内形成的网结构，其中该网状结构包括结构增强。图17B图示了拉向彼此的第一网链和第二网链。

图18A-图18B图示了使用网内的结构特征来引起组织结构折叠或起皱。图18A图示了当细胞移动并通信时细胞的向下运动(由箭头指示)以形成折叠。图18B图示了已经在第一网链、第二网链与第三网链之间形成折叠的细胞，并且第三网链将第一网链和第二网链拉向彼此。

图19A-图19C图示了具有增加的厚度区域的网的另一实施方式。图19A图示了形成在介质内的网结构，其中该网结构包括第一结构增强、第二结构增强和第三结构增强。图19B图示了拉向彼此的第一网链和第二网链。图19C提供了组织的侧视图，示出第一未增强部分、第二未增强部分和第三未增强部分被拉在一起，从而形成折叠或褶皱。

图20图示了具有由低密度网区域包围的高密度网区域的网结构。

图21图示了另一实施方式，其中网结构的密度变化指导细胞的移动和相互作用。

图22图示了另一实施方式，其中网结构的密度变化指导细胞的移动和相互作用，以制造三维组织结构。

图23A-图23E图示了沿着网链的纹理化元件，其可以促进细胞粘附或吸引。图23A图示了纹理化元件的第一实例。图23B图示了纹理化元件的第二实例。图23C图示了纹理化元件的第三实例。图23D图示了纹理化元件的第四实例。图23E图示了纹理化元件的第五实例。

图24A-图24B图示了沿着网链的纹理化元件，其可以促进细胞粘附或吸引。图24A图示了纹理化元件的第六实例。图24B图示了纹理化元件的第七实例。

图25图示了沿着网链的纹理化元件的又一实例，其可以促进细胞粘附或吸引。

图26图示了具有切割位点的网的实施方式。

图27A-图27B图示了包括枢轴接头的机械元件的实施方式。图27A图示了包括第一突起和第二突起的枢轴接头。图27B图示了附接到第一网结构的第一突起和附接到第二网结构的第二突起。

图28A-图28B图示了包括球窝接头的机械元件的实施方式。图28A图示了包括具有圆形球头的第一突起和具有凹陷窝头的第二突起的球窝接头。图28B图示了被打印成使得第一突起附接到第一网结构且第二突起附接到第二网结构的球窝接头。

图29A-图29B图示了包括鞍形接头的机械元件的实施方式。图29A图示了包括具有鞍形压痕的第一突起和第二突起的鞍形接头。图28B图示了被打印成使得第一突起和第二突起附接到网结构的鞍形接头。

图30图示了包括具有承窝形腔的第一突起和第二突起的承窝接头的实施方式。

图31图示了被打印成使得第一突起和第二突起附接到网结构的承窝接头的实施方式。

图32图示了螺纹接头的实施方式，该螺纹接头包括具有第一头部和第二头部的第一突起，该第二头部具有带有凹槽和螺纹的承窝形腔。

图33图示了被打印成使得第一突起和第二突起附接到网结构的螺纹接头的实施方式。

图34A-图34B图示了包括线圈或弹簧的机械元件的实施方式。图34A图示了弹簧的实施方式。图34B图示了被打印成使得其端部附接到网结构的弹簧的实施方式。

图35A-图35B图示了包括链的机械元件。图35A图示了包括两个端部和四个链节的链的实施方式。图35B图示了被打印成使得其端部附接到网结构的链的实施方式。

图36A-图36B图示了包括挂钩接头的机械元件的实施方式。图36A图示了具有弯曲形状的挂钩接头的实施方式。图36B图示了被打印成使得钩附接到网结构的挂钩接头的实施方式。

图37A-图37C图示了包括钩环接头的机械元件的实施方式，该钩环接头以类似于的方式工作。图37A图示了包括可与环表面配合的钩表面的钩环接头的实施方式。图37B图示了被分离的钩环接头实施方式。图37C图示了被打印成使得钩表面附接到网结构的钩环接头的实施方式。

图38A-图38C图示了包括铰链的机械元件的实施方式。图38A图示了包括托架的铰链的实施方式。图38B图示了延伸穿过并连接两个托架的杆。图38C图示了被打印成使得其托架附接到网结构的铰链的实施方式。

图39图示了由捕获在网中的细胞组成的组织结构的实施方式，其中网由于机械元件的存在而成环。

图40图示了由捕获在网中的细胞组成的组织结构的实施方式，其中网由于机械元件的存在而扭转。

图41A-图41B图示了被设计用于诱导位于两个单独的网结构中的两个单独的细胞组之间的细胞-细胞相互作用的实施方式。图41A图示了具有边缘的两个网。图41B图示了沿边缘保持的细胞，其有利于彼此之间发生细胞-细胞相互作用。

图42A-图42B图示了可用于生成细胞链的可变密度网的实施方式。图42A图示了包括纵向区域的网结构，其中第一孔的大小被设计用于诱捕特定的细胞，而四周的第二孔的大小被设计用于排除细胞。图42B图示了使用可变密度网产生细胞链。

图43示出了被编程或以其他方式配置用于实现本文提供的方法的计算机控制系统。

图44图示了没有时间聚焦的打印系统的实施方式的光学组件和光路。

图45图示了具有时间聚焦的打印系统的另外的实施方式的光学组件和光路。

图46图示了没有时间聚焦的打印系统的又一实施方式的光学组件和光路。

图47图示了光检测系统。

图48A-图48E示出了通过全息打印生成的细胞化的三维(3D)不可渗透的微脉管系统结构的实例。图48A示出了3D微脉管系统的俯视图。图48B示出了3D微脉管系统的外管的俯视图。图48C示出了完整的3D微脉管系统结构。图48D示出了封装细胞的三个微脉管系统的荧光图像。图48E示出了在全息打印五天之后封装细胞的三个微脉管系统的明场像。

图49A-图49H示出了使用全息打印生成含细胞结构的示例性过程。图49A示出了含细胞结构的计算机生成的三维(3D)图像。图49B示出了含细胞结构的3D图像的点云表示。图49C示出了对应于含细胞结构的3D图像的点云表示的全息图。图49D图示了计算机打印系统。图49E示出了悬浮在液体打印介质中的细胞簇的图像。图49F示出了在三维打印点云表示之后相同的活细胞簇的图像。图49G示出了显示打印的3D含细胞结构内的细胞的切面图像。图49H示出了打印后完整的3D含细胞结构的代表性图像。

图50A-图50C示出了“斯坦福兔子(Stanford Bunny)”的全息打印的图像。图50A示出了“斯坦福兔子”的计算机生成的三维(3D)图像。图50B示出了“斯坦福兔子”的计算机生成的3D图像的俯视图。图50C示出了如使用明场显微镜成像的“斯坦福兔子”的代表性3D打印。

图51A-图51B示出了对应于两种不同制剂的全息打印的双光子激光束曝光时间(毫秒)—激光功率(瓦)的图表。图51A示出了在制剂A中打印的阈值。图51B示出了在制剂B中打印的阈值。

图52A-图52C示出了使用全息打印的靶向单细胞封装。图52A示出了悬浮在打印介质中的多个封装的细胞和未封装的细胞。图52B示出了多个封装的细胞的放大图像。图52C示出了多个未封装的细胞的放大图像。

图53示出了投影全息图的扩展激光束。

图54A-图54D图示了不同的激光打印模式。图54A图示了单光子激光束投影到包含光敏打印介质的介质室中。图54B图示了多光子吸收过程。图54C图示了产生全息图的波前整形的代表性图形。图54D图示了在多个平面上的完整图像投影(即3D全息图)，其允许全息打印复杂结构。

图55A-图55F示出了在先前打印的3D微脉管系统结构内全息打印球体。图55A图示了打印的微脉管系统结构。图55B示出了打印的微脉管系统结构的图像。图55C图示了使用多光子激光束将球体的全息图投影到3D微脉管系统结构的内腔中。图55D确切地示出了当使用多光子激光束将球体的全息图投影到3D微脉管系统结构的内腔中时的3D微脉管系统结构的图像。图55E图示了微脉管系统结构的内腔内部的球体。图55F示出，球形(由虚线圆圈描画)沉积在微脉管系统结构的内腔内而不破坏该内腔。

图56A-图56B示出了使用本文提供的方法和系统打印的聚合物脉管系统床的图像。图56A示出了在全息打印期间的脉管系统床的图像。图56B示出了全息打印过程完成后的脉管系统床的图像。

具体实施方式

尽管本文中已经示出并描述了本发明的各种实施方式，但对于本领域技术人员容易理解的是，这些实施方式仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下可想到多种变化、改变和替代。应当理解，可采用本文所述的本发明实施方式的各种替代方案。

本文使用的术语仅为了描述具体情况，而不意在限制。如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”也意在包括复数形式。此外，在术语“包括”、“具有”或其变化形式用于具体实施方式和/或权利要求的情况下，这样的术语意为包含性的，类似于术语“包含”。

术语“约”或“大约”是指接近所述量约10％、5％或1％的量，包括其中的增量。例如，“约”或“大约”可意指包括该特定值以及从低于该特定值10％跨越到高于该特定值的10％的范围。

如本文所用，术语“生物材料”通常是指可以发挥化学或生物功能的任何材料。生物材料可以是生物功能性组织或功能性组织，其可以是能够发挥或发挥生物力学或生物功能的生物结构。生物功能性组织可以包括在彼此扩散距离以内的细胞，包括至少一种细胞类型，其中每个细胞都在毛细管或脉管网络组分的扩散距离以内，促进和/或抑制蛋白质功能的实现，或其任何组合。生物功能性组织可以是组织或诸如重要器官的器官的至少一部分。在一些实例中，生物材料可以用于药物开发，诸如例如，用不同的治疗剂筛选多种细胞或组织。

生物材料可包括基质如聚合物基质，其包括一种或多种其他类型的材料如细胞。生物材料可以具有多种形状、大小或配置。在一些情况下，诸如肉或肉类材料的生物材料可以由受试者(例如，动物)消耗。

如本文所用，术语“三维打印”(也称为“3D打印”)通常是指用于生成3D部件(或物体)的过程或方法。此类过程可用于形成3D部件(或物体)，诸如3D生物材料。

如本文所用，术语“能量束”通常是指能量的束。能量束可以是电磁能束或电磁辐射束。能量束可以是粒子束。能量束可以是光束(例如，伽马波、X射线、紫外线、可见光、红外光、微波或无线电波)。光束可以是相干光束，如可由通过受激发射的辐射(“激光”)的光放大所提供的。在一些实例中，光束由激光二极管或多二极管激光器生成。

本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的方法和系统。在一方面，用于打印3D生物材料的方法包括提供包含介质的介质室，该介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体。随后，根据计算机存储器中用于打印3D生物材料的计算机指令，可以沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质。这可以形成该3D生物材料的至少一部分，该3D生物材料包括(i)多个细胞的至少子集，该多个细胞的至少子集包含至少两种不同类型的细胞，和(ii)由一种或多种聚合物前体形成的聚合物。

本公开内容的方法和系统可以用于同时打印3D物体如3D生物材料的多个层。这样的3D物体可以由聚合物材料、金属、金属合金、复合材料或其任何组合形成。在一些实例中，3D物体由聚合物材料形成，在一些情况下该聚合物材料包括生物材料(例如，一个或多个细胞或细胞组件)。在一些情况下，可以通过将能量束(例如，激光)作为3D投影(例如，全息图)引导至聚合材料的一种或多种前体以诱导聚合和/或交联从而形成3D物体的至少一部分来形成3D物体。这可以用于同时形成3D物体的多个层。

作为替代，3D物体可以由金属或金属合金形成，诸如例如，金、银、铂、钨、钛或其任何组合。在这样的情况下，可以通过烧结或熔化金属颗粒来形成3D物体，如可由例如通过将能量束(例如，激光束)引导至包含金属或金属合金的颗粒的粉末床所实现的。在一些情况下，可以通过将这样的能量束作为3D投影(例如，全息图)引导至粉末床中以促进颗粒的烧结或熔化来形成3D物体。这可以用于同时形成3D物体的多个层。3D物体可以由有机材料如石墨烯形成。3D物体可以由无机材料如聚硅氧烷形成。在这样的情况下，可以通过烧结或熔化有机和/或无机颗粒来形成3D物体，如可由例如通过将能量束(例如，激光束)引导至包含有机和/或无机材料的颗粒的粉末床所实现的。在一些情况下，可以通过将这样的能量束作为3D投影(例如，全息图)引导至粉末床中以促进有机和/或无机颗粒的烧结或熔化来形成3D物体。

能量束穿透的深度可以由束波长与给定金属、金属合金、无机材料和/或有机材料的电子场的相互作用来决定。有机材料可以是石墨烯。无机材料可以是聚硅氧烷。可以对这些颗粒进行功能化或组合，以允许与给定的能量束更大的相互作用或更小的相互作用。

在一些实例中，至少一个能量束是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100个或更多个能量束。至少一个能量束可以是或包括相干光。在一些情况下，至少一个能量束是激光束。

至少一个能量束可以作为图像或图像集合来引导。图像可以随时间固定或随时间改变。至少一个能量束可以作为视频来引导。

计算机指令可以对应于3D生物材料的计算机模型或表示。计算机指令可以是计算机模型的一部分。计算机指令可以包括对应于3D生物材料的图像的集合。

至少一个能量束可以作为全息图像或视频来引导。这可以使介质中的不同点同时暴露于至少一个能量束，以例如同时在多个层诱导聚合物基质的形成(例如，通过聚合)。在一些情况下，可以使用例如空间光调制器(SLM)在不同的焦点处将3D图像或视频投影到介质中。

计算机指令可以包括和/或引导根据3D生物材料形成期间的时间的至少一个能量束的一个或多个参数的调整，诸如例如，向至少一个能量束的来源施加功率(例如，开/关激光)。可以根据与3D生物材料相对应的图像或视频(例如，全息图像或视频)进行这样的调整。替代地或附加地，计算机指令可以包括和/或引导3D生物材料形成于其上的台的位置的调整。

在一些情况下，在3D生物材料形成期间或之后，可以使多个细胞的至少子集的至少一部分经历分化以形成至少两种不同类型的细胞。例如，可以通过使细胞暴露于药剂或使细胞经历诱导分化的条件来采用。替代地或附加地，可以使细胞经历去分化。

本公开内容的另一方面提供了用于打印3D生物材料的方法，该方法提供了包含第一介质的介质室。第一介质可以包含第一多个细胞和第一聚合物前体。可以根据用于打印3D生物材料的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第一介质，以使介质室中的第一介质的至少一部分形成3D生物材料的第一部分。随后，可以在介质室中提供第二介质。第二介质可以包含第二多个细胞和第二聚合物前体。第二多个细胞可以与第一多个细胞是不同的类型。随后，可以根据计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D生物材料的至少第二部分。

在本公开内容的另一方面，用于打印3D生物材料的系统包括：被配置成含有介质的介质室，该介质包含含有至少两种不同类型的细胞的多个细胞以及一种或多种聚合物前体；被配置用于将至少一个能量束引导至该介质室的至少一个能量源；以及可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中该一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印3D生物材料的计算机指令；和(ii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分。

在另一方面，用于打印3D生物材料的系统包括：被配置成含有介质的介质室，该介质包含多个细胞以及多种聚合物前体；被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的至少一个能量源；以及可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中该一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印3D生物材料的计算机指令；(ii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分；和(iii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D生物材料的至少第二部分，其中第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中第二多个细胞与第一多个细胞是不同的类型。

在本公开内容的另一方面，用于打印三维(3D)物体的方法可以包括：将至少一个能量束引导至包含一种或多种前体的介质中，以生成包含由一种或多种前体形成的材料的3D物体，其中该至少一个能量束作为对应于3D物体的3D投影被引导至介质中。

在另一方面，用于打印三维(3D)生物材料的方法可以包括将至少一个能量束引导至：1)包含第一多个细胞和第一聚合物前体的第一介质，以及2)包含第二多个细胞和第二聚合物前体的第二介质，以生成3D生物材料的第一部分和3D生物材料的第二部分。

参考图1，图示了用于期望组织的快速多光子打印的系统100的实施方式。此处，系统100包括由实体模型计算机辅助设计(CAD)建模系统112驱动的激光打印系统110。在该实施方式中，CAD建模系统112包括计算机114，计算机114基于期望组织的CAD模型和附加参数来控制激光打印系统110。激光打印系统110包括与多光子组织打印打印头118通信的激光系统116，多光子组织打印打印头118将多光子激光束120的波形投影到介质室122中以完整地或在特定部分中匹配期望的结构。多光子组织打印头118包括至少一个物镜124，物镜124在介质室122的横向和轴向平面中递送多光子激光束120，以在介质室122内提供CAD建模的组织的二维和/或三维和因此全息的投影。物镜124可以是水浸没式物镜、空气物镜或油浸没式物镜。可以同时生成二维和三维全息投影，并通过透镜控制将其投影到不同的区域。介质室122含有由细胞、可聚合材料和培养基组成的介质。可聚合材料可以包含生物相容的、可溶解的并且在一些情况下是生物惰性的可聚合单体单元。单体单元(或亚单元)可以响应于多光子激光束120而聚合、交联或反应，从而产生针对于待生成的组织的含细胞的结构，诸如细胞基质和基底膜结构。单体单元可以聚合和/或交联以形成基质。在一些情况下，可聚合单体单元可以包含胶原与其他细胞外基质组分的混合物，该其他细胞外基质组分包括但不限于弹性蛋白和透明质酸，其百分比取决于期望的组织基质而变化。

用于产生含细胞结构的细胞外基质组分的非限制性实例可以包括蛋白聚糖如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角质素，非蛋白聚糖多糖如透明质酸，胶原蛋白，以及弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白，或其任何组合。这些细胞外基质组分可用丙烯酸酯、二丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、肉桂酰、香豆素、胸腺嘧啶或者其他侧基或化学反应性部分进行官能化，以促进由多光子激发直接诱导或由一种或多种化学掺杂剂的多光子激发诱导的交联。在一些情况下，可以将可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体与细胞外基质组分结合使用以产生含细胞结构。可光聚合的大分子单体的非限制性实例可以包括聚乙二醇(PEG)丙烯酸酯衍生物、PEG甲基丙烯酸酯衍生物和聚乙烯醇(PVA)衍生物。在一些情况下，用于产生含细胞结构的胶原可以是纤维状胶原如I型、II型、III型、V型和XI型胶原，facit胶原如IX型、XII型和XIV型胶原，短链胶原如VIII型和X型胶原，基底膜胶原如IV型胶原、VI型胶原、VII型胶原、XIII型胶原或其任何组合。

可以产生单体单元的特定混合物以改变聚合的生物凝胶的最终性质。该基础打印混合物可以包含合成的并且不是哺乳动物组织天然的其他可聚合单体，包括生物材料和合成材料的混合物。示例混合物可以包括约0.4％w/v的胶原甲基丙烯酸酯加上添加约50％w/v的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。引导聚合的光引发剂可以在紫外线(UV)、红外线(IR)或可见光范围内是反应性的。两种这样的光引发剂的实例是曙红Y(EY)和三乙醇胺(TEA)，它们在组合时可以响应于暴露于可见光(例如，约390至700纳米的波长)而聚合。光引发剂的非限制性实例可以包括偶氮二异丁腈(AIBN)、苯偶姻衍生物、苯并酮缩醇(benziketals)、羟烷基苯酮、苯乙酮衍生物、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)、丙烯酰氯、过氧化苯甲酰、樟脑醌、二苯甲酮、噻吨酮和2-羟基-1-[4]-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮。羟烷基苯酮可以包括4-(2-羟基乙基乙氧基)-苯基-(2-羟基-2-甲基丙基)酮(295)、1-羟基环己基-1-苯甲酮(184)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(651)。苯乙酮衍生物可以包括2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)。噻吨酮可以包括异丙基噻吨酮。

可以产生生物材料的单体单元的特定混合物以改变聚合的生物凝胶的最终性质，示例性混合物可以包含约1mg/mL I型胶原-甲基丙烯酸酯、约0.5mg/mL III型胶原、约0.2mg/mL甲基丙烯酸酯化透明质酸、约0.1％曙红Y和约0.1％三乙醇胺。

在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含至少约0.01％的光引发剂。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约10％的光引发剂或更多。在一些情况下，聚合的生物凝胶包含约0.1％的光引发剂。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约0.01％至约0.05％、约0.01％至约0.1％、约0.01％至约0.2％、约0.01％至约0.3％、约0.01％至约0.4％、约0.01％至约0.5％、约0.01％至约0.6％、约0.7％至约0.8％、约0.9％至约1％、约0.01％至约2％、约0.01％至约3％、约0.01％至约4％、约0.01％至约5％、约0.01％至约6％、约0.01％至约7％、约0.01％至约8％、约0.01％至约9％或约0.01％至约10％的光引发剂。

聚合的生物凝胶可以包含约0.05％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含0.1％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.2％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.3％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.4％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.6％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.7％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.8％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.9％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.1％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.2％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.3％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.4％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.6％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.7％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.8％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.9％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约2％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约2.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约3％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约3.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约4％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约4.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约5.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约6％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约6.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约7％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约7.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约8％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约8.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约9％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约9.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约10％的光引发剂。

在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含至少约10％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约99％或更多的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约50％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约10％至约15％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约30％、约10％至约35％、约10％至约40％、约10％至约45％、约10％至约50％、约10％至约55％、约10％至约60％、约10％至约65％、约10％至约70％、约10％至约75％、约10％至约80％、约10％至约85％、约10％至约90％、约10％至约95％或约10％至约99％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。

聚合的生物凝胶可以包含约10％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约15％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约20％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约25％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约30％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约35％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约40％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约45％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约50％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约55％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约60％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约65％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约70％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约75％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约80％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约85％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约90％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约95％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约96％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约97％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约98％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约99％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。

双光子吸收是非线性的，并且无法基于化学物质的单光子吸收特性准确地预测或计算。光反应性化学物质可以在单光子吸收的两倍或附近具有双光子吸收的峰值，或者在吸收光谱中轻微红移。因此，通过激发聚合反应的催化剂例如EY或TEA的混合物，可以使用900纳米或约900纳米至约1400纳米的波长进行单体材料的聚合。单波长聚合可能足以产生所有结构元件，但是为了进一步加速打印过程，可以通过同一打印设备并进入同一打印室同时采用多个波长打印。

可聚合单体单元与包含不同吸收带的催化剂的预混合或预反应可允许在不同的波长下进行打印，从而在介质室122内同时形成不同的基于底物的结构元件。因此，可以通过将激光器的激发波长调谐到特定波长来生成某些结构元件，然后可以通过将另一或同一激光器调谐到可以与以更高的效率引发一种材料基底的聚合的不同光引发剂相互作用的不同激发波长来在现有元件周围生成其他结构元件。类似地，不同的波长可以用于不同的结构元件，其中在一些位置期望增加的刚度，而在其他位置期望柔软或弹性的结构。由于可聚合材料的不同物理性质，这可以允许通过简单地以电子方式调谐激光的激发波长、通过在不同激光器之间切换或通过同时投影两个不同的波长来在相同的打印步骤中使用相同的细胞产生潜在的更具刚性、更柔软或更具弹性的结构。

图2A-图2C图示了在介质室122内生成期望的组织的示例性阶段。图2A示出了含有介质126的介质室122，介质126由第一细胞组、可聚合材料和培养基组成。在该实施方式中，可以根据对应与期望组织的脉管结构和微脉管系统的CAD模型，将多光子激光束120的脉冲递送至介质126。在一些情况下，第一细胞组可以包含脉管和/或微脉管细胞，其包括但不限于内皮细胞、微脉管内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮祖细胞、干细胞或其任何组合。因此，介质126的部分可以聚合、交联或反应以形成含细胞的支架128，含细胞的支架128表示期望组织的脉管系统和微脉管系统。在该实施方式中，然后可以通过第一端口130a、第二端口130b、第三端口130c、第四端口130d和第五端口130e排出介质126，以去除第一细胞组和相关联的介质。在一些情况下，介质室122可以包含至少一个端口。在一些情况下，介质室122可以包含至少一个端口至至多100个端口的多个端口。介质室122可以包含至少两个端口。介质室122可以包含至少三个端口。介质室122可以包含至少四个端口。介质室122可以包含至少五个端口。

参考图2B，介质室122可以通过端口130填充有包含第二细胞组、可聚合材料和培养基的介质126。该第二细胞组可以用于在现有的含细胞的支架128周围生成组织结构。在一些情况下，含细胞的支架128可以是脉管支架。打印的脉管支架可以包括内皮细胞、脉管内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮祖细胞、干细胞或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括内皮细胞、微脉管内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮祖细胞、淋巴细胞、T细胞如辅助性T细胞和细胞毒性T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、网状细胞、肝细胞或其任何组合。第一细胞组和/或第二细胞组可以包括外分泌的分泌性上皮细胞、激素分泌细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞、肾细胞、胰腺细胞、肺细胞、细胞外基质细胞、肌细胞、血细胞、免疫细胞、生殖细胞、***或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括外分泌的分泌性上皮细胞，其包括但不限于唾液腺粘液细胞、乳腺细胞、汗腺细胞如外泌汗腺细胞和顶泌汗腺细胞、皮脂腺细胞、II型肺泡细胞或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括激素分泌细胞，其包括但不限于垂体前叶细胞、垂体中叶细胞、大细胞神经分泌细胞、肠道细胞、呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、莱迪希(Leydig)细胞、卵泡膜内层细胞、黄体细胞、肾小球旁细胞、致密斑细胞、极周细胞、系膜细胞、胰岛细胞如α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞和ε细胞或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括上皮细胞，其包括但不限于角化上皮细胞如角质形成细胞、基底细胞和毛干细胞、复层屏障上皮细胞如复层鳞状上皮的表面上皮细胞、上皮的基底细胞和尿道上皮细胞或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括神经细胞或神经元，其包括但不限于感觉换能器细胞、自主神经元细胞、周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元如中间神经元、纺锤体神经元、锥体细胞、星状细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、神经胶质细胞或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括肾细胞，其包括但不限于壁细胞、足细胞、系膜细胞、远端小管细胞、近端小管细胞、亨勒袢薄段细胞、集合管细胞、间质肾细胞或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括肺细胞，其包括但不限于I型肺泡细胞、肺泡细胞、毛细血管内皮细胞、肺泡巨噬细胞、支气管上皮细胞、支气管平滑肌细胞、气管上皮细胞、小气道上皮细胞细胞或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括细胞外基质细胞，其包括但不限于上皮细胞、成纤维细胞、周细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、骨原细胞、星状细胞、肝星状细胞或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括肌细胞，其包括但不限于骨骼肌细胞、心肌细胞、浦肯野纤维细胞、平滑肌细胞、肌上皮细胞或其任何组合。

第一细胞组和/或第二细胞组可以包括血细胞和/或免疫细胞，其包括但不限于红细胞、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞、破骨细胞、树突细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞、嗜伊红细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤性T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、网织红细胞或其任何组合。

图2C图示了根据剩余组织的CAD模型，将多光子激光束120的脉冲递送至介质126。因此，介质126的另外的部分可以聚合、交联或反应以在现有的含细胞的支架128(不再可见)周围形成含细胞的结构132，而不损坏或影响现有的脉管支架128。排出介质126、重新填充新介质126以及递送激光能量的步骤可以重复任何次数，以产生期望的复杂组织。

图2D图示了其中可以沿包含介质126的介质室122的底部打印含细胞的支架128的实施方式。因此，支架128可能不是自由静止的或自由漂浮的。多通道输入可以减少与来自一个方向的整体流动相关的剪切力、精细结构的不均匀洗涤(因为整体流动可能无法从小的特征洗涤不需要的细胞)以及新的含细胞介质的不均匀分布(因为其循环进入组织打印室)打印。多重输入可以同时来自同时顶部、底部、侧面或所有这三者。多重输入对于组织打印是特别期望的，因为含细胞结构相对脆弱，并且潜在地会被施加与通过室进行的介质交换相关的流体力的破坏。图2D示出了，组织可以打印在介质室的底板上方。在一些实施方式中，细胞和组织可以抵靠介质室的底部平齐地打印。另外，该设计可以允许打印的组织易于运输并在激光打印头(聚焦物镜)下定位，并且是可以允许在不暴露于室内空气的情况下进行介质交换和打印的封闭系统。这可能是期望的，因为暴露于室内空气会将感染剂引入细胞培养基中，这可能破坏或完全摧毁有用组织的发育。

激光打印系统

在一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的系统。x、y和z维度可以由本文提供的系统同时访问。用于打印3D生物材料的系统可以包括被配置成含有介质的介质室，该介质包含含有细胞的多个细胞以及一种或多种聚合物前体。该多个细胞可以包括至少一种类型的细胞。该多个细胞可以包括至少两种不同类型的细胞。该系统可以包括被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的至少一个能量源。该系统可以包括被配置用于将至少一个能量束引导至介质室和/或含细胞的室的至少一个能量源。该系统可以包括可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中该一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于：从计算机存储器接收用于打印3D生物材料的计算机指令；以及引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分。

在另一方面，本公开内容提供了用于打印3D生物材料的另外的系统，其包括被配置成含有介质的介质室，该介质包含多个细胞和多种聚合物前体。该系统可以包括被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的至少一个能量源。另外，该系统可以包括可以可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于：(i)从计算机存储器接收用于打印3D生物材料的计算机指令；(ii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分；以及(iii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D生物材料的至少第二部分，其中该第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中该第二多个细胞与第一多个细胞是不同的类型。

一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于在计算机存储器中生成3D生物材料的点云表示或基于线的表示，并且使用点云表示或基于线的表示来生成计算机存储器中用于打印3D生物材料的计算机指令。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于引导至少一个能量源，以沿着一个或多个另外的能量束路径引导至少一个能量束，从而形成3D生物材料的至少另一部分。

该系统可以包括可操作地耦合到至少一个能源和/或至少一个光图案化元件的一个或多个计算机处理器。计算机模型的点云表示或基于线的表示可以是全息点云表示或全息基于线的表示。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程以使用光图案化元件重新投影由至少一个能量源照亮的全息图像。

在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于将点云表示或基于线的表示转换为图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于以全息方式投影图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于将图像投影为全息图。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于将图像投影为部分全息图。在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于经由算法变换将完整图像集合的点云表示或基于线的表示转换为一系列全息图像。然后，可以通过光图案化元件如空间光调制器(SLM)或数字镜器件(DMD)，通过该系统依次投影经变换的图像集合，从而利用以2D和/或3D同时分布的投影光在打印室内重新产生投影图像。可以将扩展或加宽的激光束投影到用作全息图像的投影系统的SLM和/或DMD上。在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于以全息方式投影图像。在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于一次投影全部图像，或者作为视频连续播放，从而以全息方式形成更大的3D结构。

全息照相术是投影多维(例如，2D和/或3D)全息图像或全息图的技术。当能够使介质光聚合的激光被投影为全息图时，激光可以沿着投影的激光路径使介质光聚合、固化、交联、结合、硬化和/或改变介质的物理特性；因此，激光可以允许打印3D结构。全息照相术可能需要光源如激光或相干光源来产生全息图像。全息图像可以随时间恒定或随时间变化(例如，全息视频)。此外，全息照相术可能需要快门以打开或移动激光路径，分束器以将激光***成分开的路径，反射镜以引导激光路径，发散透镜以扩展光束，以及附加的图案化或光引导元件。

可以通过用发散透镜扩展激光束并将扩展后的激光束引导至全息图和/或至少一个图案形成元件(诸如例如，空间光调制器或称SLM)上来产生物体的全息图像。图案形成元件可以将包括全息图像的图案编码为激光束路径。图案形成元件可以将包括部分全息图的图案编码为激光束路径。随后，可以将图案引导向并聚焦在包含打印材料(即，包含多个细胞和聚合物前体的介质)的介质室中，在该介质室中可以激发在打印材料中(即，在介质中)发现的光反应性光引发剂。随后，光反应性光引发剂的激发可以导致基于聚合物的打印材料的光聚合，并以期望的图案(即，全息图像)形成结构。在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于通过沿不同的能量束路径引导能量源来投影全息图像。

在一些情况下，至少一个能量源可以是多个能量源。多个能量源可以引导多个至少一个能量束。能量源可以是激光器。在一些实例中，激光器可以是纤维激光器。例如，纤维激光器可以是具有活性增益介质的激光器，该活性增益介质包括掺杂有稀土元素诸如例如，铒、镱、钕、镝、镨、铥和/或钬的光纤。能量源可以是短脉冲激光器。能量源可以是飞秒脉冲激光器。飞秒脉冲激光器可以具有小于或等于约500飞秒(fs)、250fs、240fs、230fs、220fs、210fs、200fs、150fs、100fs、50fs、40fs、30fs、20fs、10fs、9fs、8fs、7fs、6fs、5fs、4fs、3fs、2fs、1fs或更小的脉冲宽度。飞秒脉冲激光器可以是例如钛:蓝宝石(Ti:Sa)激光器。至少一个能量源可以衍生自相干光源。

相干光源可以提供具有约300纳米(nm)至约5毫米(mm)的波长的光。相干光源可以包括约350nm至约1800nm或约1800nm至约5mm的波长。相干光源可以提供具有至少约300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1mm、1.1mm、1.2、mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、3mm、4mm、5mm或更大的波长的光。

计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于引导至少一个能量源，以沿着一个或多个另外的能量束路径引导至少一个能量束，从而形成3D生物材料的至少另一部分。一个或多个另外的能量束路径可以沿着x轴、x和y平面或者x、y和z平面。一个或多个另外的能量束路径可以沿着x轴。一个或多个另外的能量束路径可以沿着y轴。一个或多个另外的能量束路径可以沿着z轴。能量束路径可以在同一轴上与一个或多个其他束会聚。一个或多个另外的能量束路径可以在x和y平面中。一个或多个另外的能量束路径可以在x和z平面中。一个或多个另外的能量束路径可以在y和z平面中。一个或多个另外的能量束路径可以在x、y和z平面中。

该系统还可以包括至少一个物镜，用于将至少一个能量束引导至介质室中的介质。在一些情况下，至少一个物镜可以包括水浸没式物镜。在一些情况下，至少一个物镜可以包括水浸没式物镜。在一些情况下，至少一个物镜可以包括水浸渍式物镜。在一些情况下，至少一个物镜可以包括油浸没式物镜。在一些情况下，至少一个物镜可以包括消色差物镜、半复消色差物镜、plans物镜)、浸没式物镜、惠更斯物镜、拉姆斯登物镜、periplan物镜、补偿物镜、宽场物镜、超场物镜、聚光镜物镜或其任何组合。聚光镜物镜的非限制性示例可以包括阿贝聚光镜、消色差聚光镜和通用聚光镜。

一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于接收3D生物材料的边缘的图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于接收3D生物材料的外表面的图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于接收3D生物材料的内表面的图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于接收3D生物材料的内部的图像。

一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于引导3D生物材料与其他组织的链接，该连接根据计算机指令。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于将3D打印材料与已打印的结构直接连接、合并、结合或焊接，该连接根据计算机指令。在一些情况下，将3D生物材料与其他组织连接可能涉及化学交联、机械连接和/或粘结耦合。

在另一方面，该系统可以包括被配置成含有介质的介质室，该介质包含多个细胞和多种聚合物前体。该系统可以被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的包括至少一个能量源。该系统可以包括可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中该一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于：在计算机存储器中接收3D生物材料的计算机模型；在计算机存储器中生成3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示；引导至少一个能量源，以根据3D生物材料的计算机模型沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分；以及引导至少一个能量源，以根据3D生物材料的计算机模型沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D生物材料的至少第二部分，其中该第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中该第二多个细胞与第一多个细胞是不同的类型。

在细胞结构的激光打印中，使用最低毒性的激光激发快速生成三维结构对于维持细胞活力至关重要，并且在功能性组织打印的情况下，对于大幅面、高分辨率的多细胞组织生成必不可少。双光子打印的其他方法可以依赖于在二维平面(x,y)中对双光子激发进行光栅扫描(例如，选择性激光烧结)，同时在z方向上移动显微镜或台以产生三维结构。该技术对于大幅面多细胞组织打印可能会过慢，使得不太可能在复杂结构的打印期间维持细胞活力。某些具有高聚合速率的水凝胶也可以用于组织片的二维投影，该组织片是定时的使得每一步都在x、y或z平面上投影结构的一个切片。附加地，还可以利用表示片或包括正交切片的混合平面角。在快速聚合水凝胶的情况下，这些投影可以在与组织打印相容的时间尺度上起作用，而激光烧结或光栅扫描(例如，逐层沉积)对于构建复杂结构可能会过慢。

本公开内容的激光打印系统110可以配备有物镜124，物镜124可以允许在横向和轴向平面上聚焦三维或二维全息投影，以快速产生含细胞的结构。物镜124可以是水浸没式物镜、空气物镜或油浸没式物镜。在一些情况下，激光打印系统110可以包括具有多条激光线的激光系统116，并且可以能够经由全息投影到含细胞的介质中来进行图像的三维全息投影用于光刻。

图3A图示了具有第一多光子激光源140a的激光系统116的实施方式。此处，多光子激光束激光线一可以通过空间光调制器(SLM)以视频速率或更快的刷新速率反射以进行图像投影，从而允许所投影的三维结构中的快速变化。

在一些情况下，空间光调制器(SLM)可以用于打印3D生物材料。在一些情况下，本文提出的方法可包括在计算机存储器中接收3D生物材料的计算机模型，和进一步处理计算机模型，以便将计算机模型“切片”为层，从而产生每层的二维(2D)图像。该计算机模型可以是计算机辅助设计(CAD)模型。本文公开的系统可以包括至少一个计算机处理器，该计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于基于确定待打印3D生物材料的边界轮廓和/或填充顺序的“经切片的”计算机模型来计算激光扫描路径打印。全息3D打印可以与本文所述的一种或多种聚合物前体一起使用。SLM可以与本文所述的两种或多种聚合物前体一起使用。

空间光调制器(SLM)是电可编程器件，其可以根据固定的空间(即，像素)图案在空间和时间上调制光波的幅度、相位、偏振、传播方向、强度或其任何组合。SLM可以是基于半透明的，例如液晶显示器(LCD)微型显示器。SLM可以是基于反射的，例如硅上液晶(LCOS)微型显示器。SLM可以是微通道空间光调制器(MSLM)、平行对准的向列液晶空间光调制器(PAL-SLM)、可编程相位调制器(PPM)、相位空间光调制器(LCOS-SLM)或其任何组合。LCOS-SLM可以包括芯片，该芯片包括布置在硅衬底顶部上的液晶层。可以通过使用半导体技术在芯片的硅衬底上建立电路。LCOS-SLM芯片的顶层可以包含能够独立控制其电势的铝电极。可以在保持由液晶材料填充的恒定间隙的同时将玻璃衬底放置在硅衬底上。液晶分子可以通过硅和玻璃衬底中提供的对准控制技术平行对准。可以逐像素地控制跨该液晶层的电场。可以通过控制电场来调制光的相位；电场的变化可能导致液晶分子相应地倾斜。当液晶分子倾斜时，液晶折射率可能改变，从而进一步改变光路长度，导致相位差。

可以使用SLM打印3D生物材料。可以使用硅上液晶(LCOS)-SLM打印3D生物材料。可以使用液晶SLM打印3D生物材料。可以使用SLM投影3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示。本文公开的方法可以包括将点云表示或基于线的表示转换为全息图像。可以使用SLM投影3D生物材料的计算机模型的全息图像。可以使用SLM调制3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示的光的相位。可以使用SLM调制3D生物材料的计算机模型的全息图像的光的相位。

还可以通过单独使用双数字微镜器件(DMD)系统或与空间光调制器(SLM)组合使用来实现三维的多光子激发的投影。可以使用本文所述的方法将一对DMD与一对SLM一起使用，来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用至少一个SLM和至少一个DMD来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用一对SLM来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用一对DMD来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用至少一个SLM来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用至少一个DMD来打印3D材料。DMD是电输入、光输出的微电子机械系统(MEMS)，其允许高速、高效和可靠的空间光调制。DMD可以包括以矩形阵列布置的多个微镜(通常为数十万或数百万的数量级)。DMD中的每个微镜可以对应于待显示的图像的像素，并且可以旋转约例如10-12°至“开启”或“关闭”状态。在“开启”状态下，来自投影仪灯泡的光可以反射到微镜中，从而使其对应的像素在屏幕上显得明亮。在“关闭”状态下，可以将光引导引导至其他位置(通常引导至散热器上)，从而使微镜的对应像素显得黑暗。DMD中的微镜可以由高反射率的铝组成，并且其横向长度为大约16微米(μm)。每个微镜可以建立在相关联的半导体存储单元的顶部上并且安装在轭架上，该轭架转而经由扭转铰链连接到一对支柱。每个微镜的运动角度可以通过向每个下方的半导体存储单元加载“1”或“0”来控制。随后施加电压，这可以使每个微镜经由静电吸引而围绕扭转铰链静电偏转到相关联的+/-角度状态。

参考图3A-图3C，可以添加可选的光束扩展器，然后添加贝塞尔光束发生透镜，该透镜是固定的轴棱锥透镜或可调的声梯度(TAG)透镜，以改变激光器的性质从而实现更高的分辨率和更大的组织打印深度，特别是在混浊溶液中。利用快速切换反射镜将可包括可选的光束扩展器和/或贝塞尔光束发生透镜的激光线引导至不同的投影系统，这些投影系统在形成与组织打印相关联的特定结构方面具有材料优势。在一些情况下，与两个SLM系统能够达到的分辨率相比，高分辨率DMD反射镜结合SLM系统可以达到更高的轴向分辨率。最后，可以将激光线与单个DMD或SLM系统结合反射镜一起使用，以允许在任何轴面中对二维图像进行无扫描投影。还可以通过扫描镜在较大的视场上对3D投影图案进行光栅扫描，其中在激光发射图案中，控制波长和/或功率以匹配光栅扫描速度，使得可以沉积粘结且复杂的结构。在包含多于一条激光线的系统中，配置可以是双SLM、双DMD、单SLM、单DMD或简单平面扫描的任何组合。

在一些情况下，如图3A-图3C所示光路的一个或多个光路可以独立地使用或协同使用。在光路内聚焦和分布光束或能量束的透镜、光栅和反射镜可以放置在主要的波前整形元件之间，以分布通过关键元件的光或调制入射光(在光栅的情况下)，如图3A中所述。用于聚焦、分布或削波输入激光的目的，可以将至少一个光栅或反射镜放置在波前整形元件“F”之间(即，在SLM、DMD和/或TAG透镜之间)。光波前整形器件F可以包括SLM、LCOS-SLM、DMD、TAG透镜或其任何组合。

在一些情况下，可以使用DMD打印3D生物材料。可以使用DMD投影3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示。本文公开的方法可以包括将该点云表示或基于线的表示转换为全息图像。可以使用DMD投影3D生物材料的计算机模型的全息图像。可以使用DMD打印3D生物材料。

在一些情况下，在本文公开的方法中可以使用至少一个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。至少一个SLM和至少一个DMD的组合可以串联地布置。至少一个SLM和至少一个DMD的组合可以并联地布置。当用于打印3D生物材料时，可以串联地布置任何数目的SLM和任何数目的DMD。当用于打印3D生物材料时，可以并联地布置任何数目的SLM和任何数目的DMD。

可以使用至少两个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少三个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少四个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少五个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少十个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少二十个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。

可以使用至少一个SLM和至少两个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少三个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少四个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少五个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少十个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少二十个DMD的组合来打印3D生物材料。

可以使用至少两个SLM和至少两个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少三个SLM和至少三个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少四个SLM和至少四个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少五个SLM和至少五个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少十个SLM和至少十个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少二十个SLM和至少二十个DMD的组合来打印3D生物材料。

可以使用液晶SLM来打印3D生物材料。可以使用多个SLM来打印3D生物材料。多个SLM可以串联地布置。多个SLM可以并联地布置。可以使用至少一个或多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少两个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少三个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少四个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少五个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少二十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约五十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约二十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约十五个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约五个或更多个SLM来打印3D生物材料。

可以使用多个DMD来打印3D生物材料。多个DMD可以串联地布置。多个DMD可以并联地布置。可以使用至少一个或多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少两个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少三个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少四个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少五个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少二十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约五十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约二十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约十五个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约五个或更多个DMD来打印3D生物材料。

在该设计中，SLM可以指液晶SLM，并且DMD的功能可以类似于SLM。这些激光可以由一个或多个计算机输入控制，以解决多条激光线的位置和打印时序的问题。图3A中图示了包括可选的串联激发路径的光路的示例性总体设计，并且元件的进一步描述提供于表1中。由于双光子激发光的包之间的脉冲宽度较大，因此这些激光线的任何组合(可以是无干扰的)可同时用于打印和具有同时成像的打印。这可以允许光束之间的干涉非常低，使得光束不相交。因此，如图3B-图3C所示，使用具有最小干扰至无干扰的多条激光线是可能的，并且元件的进一步描述也提供于表1中。该配置中的群延迟色散光学元件可以用于使双光子包色散，使得如果要在某些配置中使用，则峰值功率输出不会损坏纤维光缆。另外，群延迟色散可以将光子集中到较短的脉冲宽度中，使得在焦点处或投影的图像中给予更多的能量，从而允许更快的打印。

可以在时间上控制双光子激发脉冲，使得在单个点处的激发以长度为飞秒至纳秒范围内的脉冲(取决于激光调谐)发生，同时这些光子包之间的时序比脉冲宽度长三到六个数量级。当使用串联的多个激光线时，这可以允许最小的激光激发交叉路径干扰，从而使用多个激光器进行同时打印。用于结构沉积的目的，在三个不同的理论波长下的多激光投影的实例在图3B中示出。多光子激光器是可调的；因此，它们可以允许选择一系列波长。这在组织打印中是有利的，其中可以组合或串联地使用响应于不同波长的用于聚合的不同光引发剂，以防止剩余材料的不需要的聚合。因此，这些激光线中的每一条可以被调谐到不同的多光子输出波长，可以具有不同的峰值功率输出，并且可以投影包括组织结构的CAD图像的不同元件。

表1.图3A-图3C的元件描述

图4A-图4B示出了在轴棱锥或可调声梯度(TAG)透镜之前的可选的光束扩展器的放置。这可以允许产生贝塞尔光束，目的是在打印期间增加组织和混浊介质中的深度穿透，而不损失聚焦保真度。该特征可以提高通过混浊介质或已形成的组织的打印深度，而不损失功率。

在双重SLM或DMD组合之后，可以使用透镜来加宽或预聚焦激光。此外，可以在聚焦光学器件之前添加计算机控制的激光衰减器件或滤光轮，以控制在打印位点处输出的激光功率。

图4C图示了将激光束投影到光束收集器B上的激光源A。在离开光束收集器B后，激光束可以被引导至光学TAG或轴棱锥C，并进一步引导至可移动的单个SLM或DMD D，以进行2D的x,y片状投影以供在以给定的Z步长打印的细胞和所得结构周围进行胶原网打印打印。可以将激光束从SLM或DMD D引导至反射镜G中，然后反射到打印头光学器件H上。在该实例中，可以使用单个SLM产生二维(2D)投影，其具有与投影的帧速率匹配的z马达步进移动。Z堆栈切片的二维视频投影可以通过单个DMD或单个SLM(具有定时的z移动)来实现，使得每个步骤从上向下投影打印2D图像的不同图像。在另一实施方式中，可以使用多光子或替代性激光激发源从侧面、自下而上或不同的接合处并且逐个切片地、2D投影地和打印地投影复杂的结构。CAD图像F的来源可以从计算机E引导至系统中。该系统可以包括可以匹配步进率(毫秒至秒)和Z投影的步长大小的电动台I。步长大小可以在微米至纳米的数量级。在图4C中，1、2和3图示了平面投影构建步骤的实例。

图44图示了三维打印系统的实施方式的光学组件和光路。图44中所示的光学组件和光路可以提供可以不使用时间聚焦的三维打印系统。该三维打印系统可以包括能量源1000。能量源1000可以是相干光源。能量源1000可以是激光。能量源1000可以是飞秒脉冲激光器光源。能量源1000可以是第一激光源140a、第二激光源140b或第三激光源140c。能量源1000可以是多光子激光束120。能量源1000可以是双光子激光束。能量源1000可以由计算机系统1101控制。能量源1000可以由计算机系统1101调谐。计算机系统1101可以在打印过程之前或期间控制和/或设置能量源1000的能量波长。计算机系统1101可以通过设置能量源1000的波长来产生不同的激发波长。

能量源1000可以是脉冲的。能量源1000可以以约500千赫兹(kHz)的速率进行脉冲。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少10微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至20μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少40微焦耳(μJ)至80μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少120微焦耳(μJ)至160μJ或更大的脉冲能量(每包)。

能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约10μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约30μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约40μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约50μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约60μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约70μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约80μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约90μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约110μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约120μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约130μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约140μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约150μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约160μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约170μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约180μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约190μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约200μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约1,000,000μJ的脉冲能量(每包)。

能量源1000(例如，激光)可以提供具有约至少300nm至约5mm或更大的波长的能量束(例如，光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约至少600nm至约1500nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约至少350nm至约1800nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约至少1800nm至约5mm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1100nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1500nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约2000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约3000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约4000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约5000nm的波长的能量(例如，激光束)。

如图44所示，能量源1000可以通过快门1004投影激光束1002。一旦激光束1002离开快门1004，就可以将激光束1002引导通过旋转半波片1006。旋转半波片可以是具有特定双折射量的透明片，其可以主要用于操纵光束的偏振状态。旋转半波片可以具有慢轴和快轴(即，两个偏振方向)，其可以均垂直于激光束1002的方向。旋转半波片1006可以改变激光束1002的偏振状态，使得两个线性偏振方向之间的相位延迟的差异为π。相位延迟的差异可以对应于在λ/2的距离上的传播相移。其他类型的波片可以与本文公开的系统一起使用；例如，可以使用旋转四分之一波片。旋转半波片1006可以是真零级波片、低级波片或多级波片。旋转半波片1006可以由晶体石英(SiO₂)、方解石(CaCO₃)、氟化镁(MgF₂)、蓝宝石(Al₂O₃)、云母或双折射聚合物组成。

激光束1002可以离开旋转半波片1006，并且可以被引导通过偏振分束器1008。偏振分束器1008可以将激光束1002分成第一激光束1002a和第二激光束1002b。第一激光束1002a可以被引导至止光器1010。止光器1010是可以用于吸收激光束的杂散部分的光学元件。止光器1010可以吸收第一激光束1002a。第一激光束1002a可以是杂散激光束。止光器1010可以吸收第二激光束1002b。第二激光束1002b可以是杂散激光束。激光束1002可以整体上被引导至束流收集器1010中，因此可以用作打印系统的默认“关闭”状态。第二激光束1002b可以被引导至光束扩展器1012。光束扩展器1012可以扩展激光束1002b的大小。光束扩展器1012可以将输入的第二激光束1002b的直径增加到输出的扩展的激光束1054的较大直径。光束扩展器1012可以是棱柱形光束扩展器。光束扩展器1012可以是伸缩式光束扩展器。光束扩展器1012可以是多棱镜光束扩展器。光束扩展器1012可以是伽利略光束扩展器。光束扩展器1012可以提供约2X、3X、5X、10X、20X或40X的光束扩展器能力。光束扩展器1012可以提供约2X至约5X的光束扩展器能力。光束扩展器1012可以提供约2X至约5X的连续光束扩展。光束扩展器1012可以提供约5X至约10X的光束扩展器能力。光束扩展器1012可以提供约5X至约10X的连续光束扩展。扩展的激光束1054可以在离开光束扩展器1012时被准直。

在离开光束扩展器1012之后，可以将扩展的激光束1054引导至第一反射镜1014a，该第一反射镜1014a可以将扩展的激光束1054重引导至空间光调制器(SLM)1016。SLM 1016可以由计算机系统1101控制。SLM 1016可以被引导以使用本文公开的方法和系统来投影待打印的材料的特定图像或图像的特定部分。待打印的材料可以是生物材料。生物材料可以是三维生物材料。特定图像或图像的特定部分可以是一维、二维和/或三维的。SLM 1016可以被引导以在不同波长的光中同时投影至少一个图像。SLM 1016可以被引导以通过使用反射镜而不是使用计算机系统1101来投影待打印的材料的不同方面。在一些情况下，可以使用至少一个反射镜来重引导或者“关闭”或“开启”特定的光路或激光束，以便打印待打印材料的不同方面或部分。

在离开SLM 1016后，可以将扩展的激光束1054引导至f1透镜1018。f1透镜1018可以是聚焦透镜。在离开f1透镜1018后，可以将扩展的激光束1054引导至阻挡元件1020。阻挡元件1020可以是不可移动的。阻挡元件1020可以抑制来自零级斑的照明。零级可以是来自扩展的激光束1054的能量的一部分，其未发生衍射，并且行为遵循反射和折射的定律。在离开阻挡元件1020后，可以将扩展的激光束1054引导通过f2透镜1022。f2透镜可以是聚焦透镜。

在离开f2透镜1022后，可以将扩展的激光束1054引导至第二反射镜1014b上并且可以随后引导至第三反射镜1014c上。第三反射镜1014c可以将扩展的激光束1054重引导通过长通二向色镜1024。第一反射镜1014a、第二反射镜1014b和/或第三反射镜1014c可以包括红外(IR)涂层以改善反射率。第一反射镜1014a、第二反射镜1014b和/或第三反射镜1014c可以不包括红外(IR)涂层。IR涂层的非限制性实例包括基于保护的金的涂层和基于保护的银的涂层。第一反射镜1014a、第二反射镜1014b和/或第三反射镜1014c可以用计算机系统1101控制。计算机系统1101可以将第一反射镜1014a、第二反射镜1014b和/或第三反射镜1014c“开启”或“关闭”，以便根据需要重引导扩展的激光束1054。

二向色镜可以是短通二向色镜。长通二向色镜1024可以将扩展的激光束1054反射到聚焦物镜1032中。在一些情况下，可以使用光束组合器将扩展的激光束1054重引导至聚焦物镜1032中，而不是使用长通二向色镜1024。可以用计算机系统1101控制长通二向色镜1024以将扩展的激光束1054重引导至聚焦物镜1032中。聚焦物镜1032可以在扩展的激光束1054投影到打印室1034中时使其集中。打印室1034可以是介质室122。打印室1034可以包括含细胞的介质、多个细胞、细胞成分(例如，细胞器)和/或至少一种聚合物前体。

可以使用发光二极管(LED)准直器1040作为准直的LED光1056的来源。LED准直器1040可以包括准直透镜和LED发射器。LED可以是无机LED、高亮度LED、量子点LED或有机LED。LED可以是单色LED、双色LED或三色LED。LED可以是蓝光LED、紫外光LED、白光LED、红外光LED、红光LED、橙光LED、黄光LED、绿光LED、蓝紫光LED、粉红光LED或紫光LED。LED准直器1040可以将准直的LED光1056的光束投影通过f4透镜1038。f4透镜1038可以是聚焦透镜。一旦准直的LED光1056透射通过f4透镜1038，就可以将准直的LED光1056引导至聚光物镜1036中。聚光物镜1036可以将准直的LED光1056聚焦到打印室1034中。聚光物镜1036可以将准直的LED光1056聚焦到样品介质中。聚光物镜1036可以将准直的LED光1056聚焦到含细胞的介质中。准直的LED光1056可以透射通过打印室1034并进入聚焦物镜1032。一旦准直的LED光1056离开聚焦物镜1032，就可以将准直的LED光1056引导至长通二向色镜1024上。从长通二向色镜1024反射离开的准直的LED光1056可以是样品发射1026。长通二向色镜1024可以将样品发射1026重引导至f3透镜1028中。f3透镜1028可以是聚焦透镜。一旦样品发射1026透射通过f3透镜1028，则检测系统1030检测和/或收集样品发射1026以供成像。检测系统1030可以包括至少一个光电倍增管(PMT)。检测系统1030可以包括至少一个相机。相机可以是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机、科学级CMOS相机、电荷耦合器件(CCD)相机或电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD)。检测系统1030可以包括至少一个基于阵列的检测器。

图45图示了三维打印系统的又一实施方式的光学组件和光路。图45中所示的光学组件和光路提供可以使用时间聚焦的三维打印系统。三维打印系统可以包括能量源1100。能量源1100可以是相干光源。能量源1100可以是激光。能量源1100可以是飞秒脉冲激光器光源。能量源1100可以是第一激光源140a、第二激光源140b或第三激光源140c。能量源1100可以是多光子激光束120。能量源1100可以是双光子激光束。能量源1100可以由计算机系统1101控制。能量源1100可以由计算机系统1101调谐。计算机系统1101可以在打印过程之前或期间控制和/或设置能量源1100的能量波长。计算机系统1101可以通过设置能量源1100的波长来产生不同的激发波长。

能量源1100可以是脉冲的。能量源1100可以以约500千赫兹(kHz)的速率进行脉冲。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少10微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至20μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少40微焦耳(μJ)至80μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少120微焦耳(μJ)至160μJ或更大的脉冲能量(每包)。

能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约10μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约30μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约40μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约50μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约60μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约70μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约80μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约90μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约110μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约120μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约130μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约140μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约150μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约160μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约170μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约180μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约190μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约200μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有脉冲能量(每包)。

能量源1100(例如，激光)可以提供具有约300nm至5mm、600nm至1500nm、350nm至1800nm或1800nm至5mm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有至少约300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1mm、1.1mm、1.2、mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、3mm、4mm、5mm或更大的波长的能量(例如，激光束)。

如图45所示，能量源1100可以通过快门1104投影激光束1102。一旦激光束1102离开快门1104，就可以将激光束1102引导通过旋转半波片1106。旋转半波片1106可以改变激光束1102的偏振状态，使得两个线性偏振方向之间的相位延迟的差异为π。相位延迟的差异可以对应于在λ/2的距离上的传播相移。其他类型的波片可以与本文公开的系统一起使用；例如，可以使用旋转四分之一波片。旋转半波片1106可以是真零级波片、低级波片或多级波片。旋转半波片1106可以由晶体石英(SiO₂)、方解石(CaCO₃)、氟化镁(MgF₂)、蓝宝石(Al₂O₃)、云母或双折射聚合物组成。

激光束1102可以离开旋转半波片1106，并且可以被引导通过偏振分束器1108。偏振分束器1108可以将激光束1102分成第一激光束1102a和第二激光束1102b。第一激光束1102a可以被引导至止光器1110。止光器1110是可以用于吸收激光束的杂散部分的光学元件。止光器1110可以吸收第一激光束1102a。第一激光束1102a可以是杂散激光束。止光器1110可以吸收第二激光束1102b。第二激光束1102b可以是杂散激光束。激光束1102可以整体上被引导至束流收集器1110中，因此可以用作打印系统的默认“关闭”状态。第二激光束1102b可以被引导至光束扩展器1112。光束扩展器1112可以扩展第二激光束1102b的大小。光束扩展器1112可以将输入的第二激光束1102b的直径增加到输出的扩展的激光束1154的较大直径。光束扩展器1112可以是棱柱形光束扩展器。光束扩展器1112可以是伸缩式光束扩展器。光束扩展器1112可以是多棱镜光束扩展器。光束扩展器1112可以是伽利略光束扩展器。光束扩展器1112可以提供约2X、3X、5X、10X、20X或40X的光束扩展器能力。光束扩展器1112可以提供约2X至约5X的光束扩展器能力。光束扩展器1112可以提供约2X至约5X的连续光束扩展。光束扩展器1112可以提供约5X至约10X的光束扩展器能力。光束扩展器1112可以提供约5X至约10X的连续光束扩展。扩展的激光束1154可以在离开光束扩展器1112时被准直。

在离开光束扩展器1112之后，可以将扩展的激光束1154引导至第一反射镜1114a，第一反射镜1014a可以将扩展的激光束1154重引导至第一空间光调制器(SLM)1116a。在离开第一SLM 1116后，可以将扩展的激光束1154引导至f1透镜1118。f1透镜1118可以是聚焦透镜。在离开f1透镜后，可以将扩展的激光束1154引导至光栅1142。光栅1142可以是衍射激光分束器。光栅1142可以是全息光栅。光栅1142可以是刻划光栅。光栅1142可以是亚波长光栅。光栅1142可以将扩展的激光束1154***和/或衍射成多个扩展的激光束(在图45中未示出)。光栅1142可以充当色散元件。一旦扩展的激光束1154被光栅1142***、衍射和/或分散，则扩展的激光束1154可以透射通过f2透镜1122。f2透镜1122可以是聚焦透镜。在离开f2透镜1122后，可以将扩展的激光束1154引导至第二SLM 1116b。SLM(即，第一SLM 1116a和第二SLM 1116b)可以由计算机系统1101控制。如上所述的SLM可以执行图44中所示的SLM1016的所有功能。

在离开第二SLM 1116b后，可以将扩展的激光束1154引导至f3透镜1128。f3透镜1128可以是聚焦透镜。在离开f3透镜后，可以将扩展的激光束1154引导至阻挡元件1120。阻挡元件1120可以是不可移动的。阻挡元件1120可以用于抑制来自零级斑的照明。在离开阻挡元件1120后，可以将扩展的激光束1154引导通过f4透镜1138。f4透镜1138可以是聚焦透镜。在离开f4透镜1138后，可以将扩展的激光束1154引导至第二反射镜1114b上并且可以随后引导至第三反射镜1114c上。第三反射镜1114c可以将扩展的激光束1154重引导通过长通二向色镜1124。第一反射镜1114a、第二反射镜1114b和/或第三反射镜1114c可以用计算机系统1101控制。计算机系统1101可以将第一反射镜1114a、第二反射镜1114b和/或第三反射镜1114c“开启”或“关闭”，以便根据需要重引导扩展的激光束1154。二向色镜可以是短通二向色镜。长通二向色镜1124可以将扩展的激光束1154反射到聚焦物镜1132中。在一些情况下，可以使用光束组合器将扩展的激光束1154重引导至聚焦物镜1132中，而不是使用长通二向色镜1124。可以用计算机系统1101控制长通二向色镜1124以将扩展的激光束1154重引导至聚焦物镜1132中。聚焦物镜1132可以在扩展的激光束1154投影到打印室1134中时使其集中。打印室1134可以是介质室122。打印室1134可以包括含细胞的介质、多个细胞、细胞成分(例如，细胞器)和/或至少一种聚合物前体。

打印室1134可以安装在可移动台1146上。可移动台1146可以是xy台、z台和/或xyz台。可移动台1146可以手动定位。可移动台1146可以自动定位。可移动台1146可以是机动台。可移动台1146可以由计算机系统1101控制。计算机系统1101可以控制可移动台1146在x、y和/或z方向上的移动。计算机系统1101可以将可移动台1146自动定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约3μm的位置精度将可移动台1146定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约2μm的位置精度将可移动台1146定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约1μm的位置精度将可移动台1146定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以在三维打印之前或期间自动调整可移动台1146的位置。计算机系统1101可以包括压电式(压电)控制器，以提供计算机控制的z轴(即，垂直方向)定位和有源位置反馈。计算机系统1101可以包括操纵杆控制台，以使用户能够控制可移动台1146的位置。操纵杆控制台可以是z轴控制台和/或x轴和y轴控制台。可移动台1146可以包括打印室保持器。打印室保持器可以是托架、夹子和/或凹陷的样品保持器。可移动台1146可以包括多载玻片保持器、载玻片保持器和/或彼得里皿保持器。可移动台1146可以包括传感器以提供位置反馈。传感器可以是电容传感器。传感器可以是压阻传感器。可移动台1146可以包括移动(或定位)可移动台1146的至少一个致动器(例如，压电致动器)。

可以使用发光二极管(LED)准直器1140作为准直的LED光1156的来源。LED准直器1140可以包括准直透镜和LED发射器。LED可以是无机LED、高亮度LED、量子点LED或有机LED。LED可以是单色LED、双色LED或三色LED。LED可以是蓝光LED、紫外光LED、白光LED、红外光LED、红光LED、橙光LED、黄光LED、绿光LED、蓝紫光LED、粉红光LED或紫光LED。LED准直器1140可以将准直的LED光1156的光束投影通过f6透镜1148。f6透镜1148可以是聚焦透镜。一旦准直的LED光1156透射通过f6透镜1148，就可以将准直的LED光1156引导至聚光物镜1136中。聚光物镜1136可以将准直的LED光1156聚焦到打印室1134中。聚光物镜1136可以将准直的LED光1156聚焦到样品介质中。聚光物镜1136可以将准直的LED光1156聚焦到含细胞的介质中。准直的LED光1156可以透射通过打印室1134并进入聚焦物镜1132。一旦准直的LED光1156离开聚焦物镜1132，就可以将准直的LED光1156引导至长通二向色镜1124上。从长通二向色镜1124反射离开的准直的LED光1156可以是样品发射1126。长通二向色镜1124可以将样品发射1126重引导至f5透镜1144中。f5透镜1144可以是聚焦透镜。一旦样品发射1126透射通过f5透镜1144，则检测系统1130检测和/或收集样品发射1126以供成像。检测系统1130可以包括至少一个光电倍增管(PMT)。检测系统1130可以包括至少一个相机。相机可以是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机、科学级CMOS相机、电荷耦合器件(CCD)相机或电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD)。检测系统1130可以包括至少一个基于阵列的检测器。

图46图示了三维打印系统的另外的实施方式的光学组件和光路。图46中所示的光学组件和光路提供可以不使用时间聚焦的三维打印系统。该三维打印系统可以包括能量源1200。能量源1200可以是相干光源。能量源1200可以是激光。能量源1200可以是飞秒脉冲激光器光源。能量源1200可以是第一激光源140a、第二激光源140b或第三激光源140c。能量源1200可以是多光子激光束120。能量源1200可以由计算机系统1101控制。能量源1200可以由计算机系统1101调谐。计算机系统1101可以在打印过程之前或期间控制和/或设置能量源1200的能量波长。计算机系统1101可以通过设置能量源1200的波长来产生不同的激发波长。

能量源1200可以是脉冲的。能量源1200可以以约500千赫兹(kHz)的速率进行脉冲。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少10微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至20μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少40微焦耳(μJ)至80μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少120微焦耳(μJ)至160μJ或更大的脉冲能量(每包)。

能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约10μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约30μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约40μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约50μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约60μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约70μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约80μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约90μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约110μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约120μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约130μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约140μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约150μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约160μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约170μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约180μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约190μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约200μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有脉冲能量(每包)。

能量源1200(例如，激光)可以提供具有例如约至少300nm至约5mm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约至少600nm至约1500nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约至少350nm至约1800nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约至少1800nm至约5mm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1500nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约2000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约3000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约4000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约5000nm的波长的能量(例如，激光束)。

如图46所示，能量源1200可以通过快门1104投影激光束1202。一旦激光束1202离开快门1204，就可以将激光束1202引导通过旋转半波片1206。旋转半波片1206可以改变激光束1202的偏振状态，使得两个线性偏振方向之间的相位延迟的差异为π。相位延迟的差异可以对应于在λ/2的距离上的传播相移。其他类型的波片可以与本文公开的系统一起使用；例如，可以使用旋转四分之一波片。旋转半波片1206可以是真零级波片、低级波片或多级波片。旋转半波片1206可以由晶体石英(SiO₂)、方解石(CaCO₃)、氟化镁(MgF₂)、蓝宝石(Al₂O₃)、云母或双折射聚合物组成。

激光束1202可以离开旋转半波片1206，并且可以被引导通过偏振分束器1208。偏振分束器1208可以将激光束1202分成第一激光束1202a和第二激光束1202b。第一激光束1202a可以被引导至止光器1210。止光器1210是可以用于吸收激光束的杂散部分的光学元件。止光器1210可以吸收第一激光束1202a。第一激光束1202a可以是杂散激光束。止光器1210可以吸收第二激光束1202b。第二激光束1202b可以是杂散激光束。激光束1202可以整体上被引导至束流收集器1210中，因此可以用作打印系统的默认“关闭”状态。第二激光束1202b可以被引导至光束扩展器1212。光束扩展器1212可以扩展第二激光束1202b的大小。光束扩展器1212可以将输入的第二激光束1202b的直径增加到输出的扩展的激光束1254的较大直径。光束扩展器1212可以是棱柱形光束扩展器。光束扩展器1212可以是伸缩式光束扩展器。光束扩展器1212可以是多棱镜光束扩展器。光束扩展器1212可以是伽利略光束扩展器。光束扩展器1212可以提供约2X、3X、5X、10X、20X或40X的光束扩展器能力。光束扩展器1212可以提供约2X至约5X的光束扩展器能力。光束扩展器1212可以提供约2X至约5X的连续光束扩展。光束扩展器1212可以提供约5X至约10X的光束扩展器能力。光束扩展器1212可以提供约5X至约10X的连续光束扩展。扩展的激光束1254可以在离开光束扩展器1212时被准直。

在离开光束扩展器1212之后，可以将扩展的激光束1254引导至第一反射镜1214a，第一反射镜1014a可以将扩展的激光束1254重引导至第一空间光调制器(SLM)1216a。在离开第一SLM 1216后，可以将扩展的激光束1254引导至f1透镜1218。f1透镜1218可以是聚焦透镜。在离开f1透镜后，可以将扩展的激光束1254引导至具有阻挡元件的反射镜1250。具有阻挡元件的反射镜1250可以用于抑制来自零级斑的照明。

一旦扩展的激光束1254被具有阻挡元件的反射镜1250反射，则扩展的激光束1254可以透射通过f2透镜1222。f2透镜1222可以是聚焦透镜。在离开f2透镜1222后，可以将扩展的激光束1254引导至第二SLM 1216b。SLM(即，第一SLM 1216a和第二SLM 1216b)可以由计算机系统1101控制。如上所述的SLM可以执行图44和图45中分别所示的SLM 1016和SLM1116的所有功能。

在离开第二SLM 1216b后，可以将扩展的激光束1254引导至f3透镜1228。在离开f3透镜后，可以将扩展的激光束1254引导至阻挡元件1220。阻挡元件1220可以是不可移动的。阻挡元件1220可以用于抑制来自零级斑的照明。在离开阻挡元件1220后，可以将扩展的激光束1254引导通过f4透镜1238。f4透镜1238可以是聚焦透镜。在离开f4透镜1238后，可以将扩展的激光束1254引导至第二反射镜1214b上并且可以随后引导至第三反射镜1214c上。第三反射镜1214c可以将扩展的激光束1254重引导通过长通二向色镜1224。第一反射镜1214a、第二反射镜1214b和/或第三反射镜1214c可以用计算机系统1101控制。计算机系统1101可以将第一反射镜1214a、第二反射镜1214b和/或第三反射镜1214c“开启”或“关闭”，以便根据需要重引导扩展的激光束1254。二向色镜可以是短通二向色镜。长通二向色镜1224可以将扩展的激光束1254反射到聚焦物镜1232中。在一些情况下，可以使用光束组合器将扩展的激光束1254重引导至聚焦物镜1232中，而不是使用长通二向色镜1224。可以用计算机系统1101控制长通二向色镜1224以将扩展的激光束1254重引导至聚焦物镜1232中。聚焦物镜1232可以在扩展的激光束1254投影到打印室1234中时使其集中。打印室1234可以是介质室122。打印室1234可以包括含细胞的介质、多个细胞、细胞成分(例如，细胞器)和/或至少一种聚合物前体。

打印室1234可以安装在可移动台1246上。可移动台1246可以是xy台、z台和/或xyz台。可移动台1246可以手动定位。可移动台1246可以自动定位。可移动台1246可以是机动台。可移动台1246可以由计算机系统1101控制。计算机系统1101可以控制可移动台1246在x、y和/或z方向上的移动。计算机系统1101可以将可移动台1246自动定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约3μm的位置精度将可移动台1246定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约2μm的位置精度将可移动台1246定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约1μm的位置精度将可移动台1246定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以在三维打印之前或期间自动调整可移动台1246的位置。计算机系统1101可以包括压电控制器，以提供计算机控制的z轴(即，垂直方向)定位和有源位置反馈。计算机系统1101可以包括操纵杆控制台，以使用户能够控制可移动台1246的位置。操纵杆控制台可以是z轴控制台和/或x轴和y轴控制台。可移动台1246可以包括打印室保持器。打印室保持器可以是托架、夹子和/或凹陷的样品保持器。可移动台1246可以包括多载玻片保持器、载玻片保持器和/或彼得里皿保持器。可移动台1246可以包括传感器以提供位置反馈。传感器可以是电容传感器。传感器可以是压阻传感器。可移动台1246可以包括移动(或定位)可移动台1246的至少一个致动器(例如，压电致动器)。

可以使用发光二极管(LED)准直器1240作为准直的LED光1256的来源。LED准直器1240可以包括准直透镜和LED发射器。LED可以是无机LED、高亮度LED、量子点LED或有机LED。LED可以是单色LED、双色LED或三色LED。LED可以是蓝光LED、紫外光LED、白光LED、红外光LED、红光LED、橙光LED、黄光LED、绿光LED、蓝紫光LED、粉红光LED或紫光LED。LED准直器1240可以将准直的LED光1256的光束投影通过f6透镜1248。f6透镜1248可以是聚焦透镜。一旦准直的LED光1256透射通过f6透镜1248，就可以将准直的LED光1156引导至聚光物镜1236中。聚光物镜1236可以将准直的LED光1256聚焦到打印室1234中。聚光物镜1236可以将准直的LED光1256聚焦到样品介质中。聚光物镜1236可以将准直的LED光1256聚焦到含细胞的介质中。准直的LED光1256可以透射通过打印室1234并进入聚焦物镜1232。一旦准直的LED光1256离开聚焦物镜1232，就可以将准直的LED光1256引导至长通二向色镜1224上。从长通二向色镜1224反射离开的准直的LED光1256可以是样品发射1226。长通二向色镜1224可以将样品发射1226重引导至f5透镜1244中。f5透镜可以是聚焦透镜。一旦样品发射1226透射通过f5透镜1244，则检测系统1230检测和/或收集样品发射1226以供成像。检测系统1230可以包括至少一个光电倍增管(PMT)。检测系统1230可以包括至少一个相机。相机可以是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机、科学级CMOS相机、电荷耦合器件(CCD)相机或电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD)。检测系统1230可以包括至少一个基于阵列的检测器。

图47图示了光检测系统1330。光检测系统1330可以包括多个串联布置的长通二向色镜。光检测系统1330可以包括多个并联布置的长通二向色镜。光检测系统1330可以包括多个串联和并联布置的长通二向色镜。如图44-图46所示，光路可以包括LED准直器，其将准直的LED光1356的光束投影到聚焦物镜上。一旦从第一长通二向色镜1324a反射了准直的LED光1356，就可以将准直的LED光1356转换为样品发射1326。可以将样品发射1326引导通过f5透镜1344。f5透镜1344可以是聚焦透镜。在样品发射1326离开f5透镜1344之后，可以将样品发射1326引导至一系列长通二向色镜，包括第二长通二向色镜1324b、第三长通二向色镜1324c、第四长通二向色镜1324d和第五长通二向色镜1324e，如图47所示。样品发射1326可以被反射离开第二长通二向色镜1324b并反射到第一光检测器1352a上。样品发射1326可以被反射离开第三长通二向色镜1324c并反射到第二光检测器1352b上。样品发射1326可以被反射离开第四长通二向色镜1324d并反射到第三光检测器1352c上。样品发射1326可以被反射离开第五长通二向色镜1324e并反射到第四光检测器1352d上。样品发射1326可以被反射离开第五长通二向色镜1324e并反射到第五光检测器1352e上。光检测器可以是光电倍增管(PMT)。光检测器可以是相机。光检测器可以是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机、科学级CMOS相机、电荷耦合器件(CCD)相机或电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD)。光检测器可以是基于阵列的检测器。光检测系统1330可以包括具有逐渐红移的截止波长的多个长通二向色镜。在一些情况下，第二长通二向色镜1324b可以具有约460nm的截止波长，第三长通二向色镜1324c可以具有约500nm的截止波长，第四长通二向色镜1324d可以具有约540nm的截止波长，第五长通二向色镜1324e可以具有约570nm的截止波长。

光检测系统1330可以由计算机系统1101控制。计算机系统1101可以收集和/或处理由第一光检测器1352a、第二光检测器1352b、第三光检测器1352c和第四光检测器1352d获得的信号。计算机系统1101可以基于光检测系统1330的光检测器信号向三维打印系统提供控制反馈，该信号可以由计算机系统1101收集和/或处理。计算机系统1101可以具有对图44-图46中描述的光路的任何光学组件和/或硬件的控制反馈。计算机系统1101可以具有对图47中所示的光检测系统1330的任何光学组件和/或硬件的控制反馈。计算机系统1101可以响应于来自光检测系统1330的信号控制例如SLM、快门、可移动台、反射镜、透镜、聚焦物镜、光束扩展器、LED准直器、光栅和/或阻挡元件。

图5A图示了多光子组织打印头118的实施方式。多光子打印头118可以接收来自激光系统116的多光子激光束120(包括一种或多种波长)，并且可以将光束120聚焦通过由最终光学器件组成的最终光路，该最终光学器件由可选的扫描头、用于收集和记录反向散射光的长通镜和聚焦物镜200组成，从而将光束120投影到介质室122中。可以通过与用于打印的同一物镜收集光，然后将其经由长通镜分流到单个或一排PMT或者CCD相机。

在一些设计中，光学器件可以发送激光通过纤维光缆，以更容易地控制光在组织打印器皿中的沉积位置。

本文公开的系统可以利用一定范围的聚焦物镜，例如，放大倍数逐渐降低；视场可能会逐渐增大。在一些情况下，视场可以是在单个投影区域中显微镜能够使用的打印区域。在一些情况下，可以采用5x、10x或20x的物镜。在一些情况下，可以采用具有在至少约0.6至约1.2之间或更大的高数值孔径的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数在例如约1x至约100x范围内的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约1x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约2x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约3x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约4x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约10x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约20x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约40x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约60x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约100x的物镜。

为了维持打印组织的结构保真度，水浸没式物镜可能是理想的，以便与含细胞的液体生物凝胶介质126内的入射角基本上匹配。校正了折射率变化的水浸没式物镜可以用于在液体介质中进行的打印，该液体介质具有与空气的折射率明显不同的折射率。

图5B图示了包括第一物镜200a和第二物镜200b的打印头118。图5B图示了用于成像结构的倒置光学器件。在该实施方式中，可以通过倒置光学器件收集光并且将其传送至如图5B所示的CCD相机、单个PMT，或一排PMT以创建多色图像。在一些实施方式中，第二物镜头可以被倒置并且可以从组织的底侧收集图像，并且通过PMT借助一系列长通镜或带通镜来读取入射光。

为了使基于多光子的打印机从打印模式切换到成像模式，可以进行x,y光栅扫描，并且可以绕过DMD或SLM路径，或者将器件置于关闭或不活动的位置，或者将它们从光路移除，使得只有单条激光线撞击x,y扫描光学器件。在一些情况下，DMD或SLM路径也可以用于成像。

在打印期间，切换到成像模式可能有多种用途：1)成像可用于监测胶原生成速率，因为胶原经由二次谐波发生而自然产生发射，这是在整个结构上扫描双光子激发时的过程，2)使用成像模式可以找到打印组织的边缘，从而促进沿投影空间边缘的血管和其他组织结构的正确连接，3)可以实时验证打印的组织结构的结构完整性和对投影图像的保真度，以及4)如果使用临时标记的细胞，它们可以位于打印的组织内，以进行过程验证或监视。可以理解，以上实施方式的激光系统116可以具有各种软件控制的点，其包括但不限于：可以通过硬连线到SLM和/或DMD器件的更改进行编程来投影CAD图像；如果使用TAG透镜产生贝塞尔光束，则用于在TAG透镜中诱导可调谐声梯度(TAG)所生成的电流可以受到计算机软件的控制；可以通过计算机软件来控制引导单光束实体中的激光激发并可以充当多激光器设计的关闭/开启开关的反射镜；可以通过软件输入来控制经由衰减轮的激光强度和不同频率的调谐；显微镜台的移动可以由软件控制；显微镜物镜或相关光纤光学的移动可以由软件控制；通过移动或打开/关闭状态对倒置物镜的边缘找寻、照明和控制可以由软件控制；任何成像或光路控制件(反射镜、快门、扫描光学器件、SLM、DMD等)均可以由软件控制。

为了适应快速打印，物镜200可以配备有纤维光缆。图6A图示了可移除和可附接的纤维光缆附件250的实施方式。在该实施方式中，附件250可以包括纤维光缆252和配件(图6A-图6B中未示出)，该配件可附接到多光子组织打印打印头(图6A-图6B中未示出)。如图6B所示，随后可以将纤维光缆252定位在介质室122的介质126内。因此，多光子激光束120可以穿过物镜200和纤维光缆252以将激光能量递送至介质126，从而产生期望的复杂组织结构260。为了在打印期间避免移动打印显微镜物镜或包含精妙组织结构的打印器皿，如果需要打印较大的组织区域，可以移动纤维光缆本身。在一些情况下，附件250可以被消毒或更换，使得直接***介质126不损害无菌性或交叉污染打印的细胞。

根据输入到纤维光缆的功率，多光子激光器可能能够引起对纤维光缆内芯的不可逆损坏。因此，在一些情况下，可以通过有效分散光子以延长激光脉冲来提供由群延迟色散(GDD)诱导的波长啁啾，以最大程度地减小该潜在损坏。这可用于最大程度地减少对打印介质中细胞的损坏或延长纤维光缆的寿命。在这样的情况下，可以在SLM或DMD之后并在进入打印头光学器件118之前，在激光系统116中提供GDD器件。

在一些情况下，可以用单个物镜200或具有附接的光纤附件250的物镜200来执行期望组织的三维打印，其中一至三个不同的配置，每个配置均与不同的激光线相关联并表示可以通过同一物镜200进行脉冲的组织的不同形状或部分。在这样的情况下，可以安装定时快门系统，使得投影的图像之间没有干扰或干扰最小。因此，可以采用激光复用以允许在利用组织结构的相同CAD模型的同时在多个点处同时生成组织结构的部分。同样，激光复用可以利用不同但相邻的基于CAD的组织模型，从而使较大结构打印所需的移动最少，同时进一步减少总体打印时间。例如，脉管床可以具有内部结构，如防止正常循环中静脉回流的较大血管中的瓣膜。这些瓣膜结构可以与血管壁同时打印。在这样的情况下，与瓣膜结构和/或血管壁相关联的支架可能难以单独打印。

在一轮打印期间，可以在整个打印空间中重复瞬时形成的三维结构。在生物系统中，小单元通常可以在整个结构中重复。因此，在一轮打印中重复生成相同结构可能对生成功能性组织有用。可以产生来自相同细胞打印材料的另外的非重复性的精细特征结构和后续结构，这些结构与所打印的第一个结构对齐或连接。

在一些实施方式中，多光子组织打印打印头118可以包括经由第一激光物镜200a、第二激光物镜200b和第三激光物镜200c的多个打印“头”或多光子激发源，如图7-图8所示。图7图示了实施方式，其中多光子组织打印打印头118可以包括第一激光物镜200a、第二激光物镜200b和第三激光物镜200c，其中第一激光物镜200a可以包括第一纤维光缆附件250a，第二激光物镜200b可以包括第二纤维光缆附件250b，并且第三激光物镜200c可以包括第三纤维光缆附件250c。可以将第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b和第三纤维光缆附件250c引导至单个介质室122中。介质室122可以具有开放的顶部或密封的顶部，其具有由每个附件纤维光缆附件(即，经由第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b和第三纤维光缆附件250c)的端口访问。该布置可以提高大型、快速的组织打印的速度，同时维持对最终组织结构的控制。在一些情况下，第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b和第三纤维光缆附件250c可以递送相同组织结构的投影。在其他情况下，第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b和第三纤维光缆附件250c中的每一个可以分别递送不同组织结构的第一激光束投影120a、第二激光束投影120b和第三激光束投影120c。鉴于多个激光物镜的灵活布置以及将纤维光缆引导至介质室122内的相同区域的能力，可以同时打印组织结构。所得的组织结构可以连接在一起或不连接在一起。借助于运动限制的一些考虑以及待考虑的每个另外的激发源的考虑因素，给定组织结构的打印时间可能与激光传输元件的数目具有反比关系。

图8图示了实施方式，其中多光子组织打印打印头118可以包括第一物镜200a、第二物镜200b、第三物镜200c、第四物镜200d、第五物镜200e和第六物镜200f，其中每个物镜可以分别包括分别被引导至单独的第一介质室122a、第二介质室122b、第三介质室122c、第四介质室122d、第五介质室122e和第六介质室122f的第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b、第三纤维光缆附件250c、第四纤维光缆附件250d、第五纤维光缆附件250e和第六纤维光缆附件250f。多个介质室可以是多孔板，其中多孔板的每个孔是单独的单个介质室。在一些情况下，第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b、第三纤维光缆附件250c、第四纤维光缆附件250d、第五纤维光缆附件250e和第六纤维光缆附件250f可以递送相同组织结构的至少一个投影。这同时提供了组织结构的多个拷贝。在其他情况下，第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b、第三纤维光缆附件250c、第四纤维光缆附件250d、第五纤维光缆附件250e和第六纤维光缆附件250f可以递送不同组织结构的第一多光子激光束投影120a、第二多光子激光束投影120b和第三多光子激光束投影120c。在一些情况下，由于同时产生多个拷贝的能力，可以大大减少打印时间。

在一些实施方式中，多光子组织打印打印头118可以包括物镜的连续阵列，包括第一物镜200a、第二物镜200b和第三物镜200c，如图9所示。在该实施方式中，每个物镜均可以与单独的介质室对准。例如，第一物镜200a可以与第一介质室122a对准，第二物镜200b可以与第二介质室122b对准，第三物镜200c可以与第三介质室122c对准。在一些情况下，多个介质室可以是多孔板300的孔。在一些实施方式中，第一物镜200a、第二物镜200b和第三物镜200c可以递送相同组织结构的投影。在其他情况下，每个孔的激光束投影可能不同。第一物镜200a、第二物镜200b(图10中未示出)和第三物镜200c(图10中未示出)可以被编程用于在x和y方向上在多孔板300上方移动，如图10所示，以将激光束投影递送到每个孔中。替代地，可以理解，物镜可以在多孔板300在x和y方向上移动的同时保持静止。因此，例如，具有三个物镜的连续阵列可以以以下两步在六孔板中打印组织：同时打印三个组织结构，然后同时打印另三个组织结构。可以理解，可以使用具有任何数目的孔的板，其包括但不限于至少约96个孔至约394个孔，或更多。多孔板300可以包括至少第一介质室122a。多孔板300可以包括至少1个孔。多孔板300可以包括至少4个孔。多孔板300可以包括至少6个孔。多孔板300可以包括至少8个孔。多孔板300可以包括至少12个孔。多孔板300可以包括至少16个孔。多孔板300可以包括至少24个孔。多孔板300可以包括至少48个孔。多孔板300可以包括至少96个孔。多孔板300可以包括至少384个孔。多孔板300可以包括至少1536个孔。

可以理解，在本文所述的实施方式中，显微镜台可以能够移动，显微镜头可以能够移动，和/或附接到打印物镜的相关联的纤维光缆可以能够移动，以便打印更大的空间。

3D打印方法

在一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的方法。可以在使用本文提供的方法的同时对x、y和z维度进行同时访问。生物材料可以是生物功能性组织。生物材料可以发育成生物功能性组织。生物材料可以包括完全成形的打印的脉管系统、微脉管系统、多孔网络、管网络和/或孔架构，其可以提供可有助于防止坏死的足够浓度的营养物和氧气的递送和/或扩散。生物材料可以包括可以允许生物学功能的打印的淋巴网络、淋巴脉管系统和/或淋巴微脉管系统，该生物学功能包括但不限于间质液稳态、免疫系统的调节、循环系统的调节、炎症的调节和脂质吸收。生物材料可以包括以与尝试复制的天然组织类似的结构和/或架构布置的细胞；因此，允许与该天然组织的生物学功能类似的生物学功能。可以产生超精细组织结构的打印，该超精细组织结构诸如但不限于精细血管如毛细血管、组织的单细胞层以及具有骨、软骨和/或腱的机械性质的硬和/或软组织层。

该方法可以包括在计算机存储器中接收3D生物材料的计算机模型。计算机模型可以是计算机辅助设计(CAD)模型。CAD模型可以是3D线框、诸如参数模型和直接或显式模型的3D实体模型(和/或自由曲面模型。在使用诸如3D扫描仪、计算机断层成像(CT)扫描设备、结构光3D扫描仪、调制光3D扫描仪、激光扫描仪、显微镜或磁共振成像(MRI)设备等设备对物理原型进行扫描和/或成像后，可以通过计算机生成CAD模型。在一些情况下，通过使用将原型图像或扫描转换为表面模型、网状模型或体积模型的算法，将原型图像或扫描转换为CAD模型。该方法可以包括接收包括3D生物材料部分3D结构和/或完整3D结构的计算机模型。

随后，该方法可以包括提供包含介质的介质室，该介质包含多个细胞以及一种或多种聚合物前体。介质可以包含细胞成分(例如，细胞器)。介质还可以包含谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。多个细胞可以包括至少两种不同类型的细胞。该方法还可以包括使多个细胞的至少子集的至少一部分经历分化以形成该至少两种不同类型的细胞。多个细胞的至少子集可以包括至少两种不同类型的细胞。多个细胞可以包括该至少两种不同类型的细胞。

介质室可以是多孔板、室载玻片、组织培养载玻片、容器、烧瓶、生物反应器室、器皿、如细胞培养袋的袋、彼得里皿、滚瓶或定制制造的孔。介质室可以由聚苯乙烯、玻璃、石英、聚丙烯、环烯烃或聚氯乙烯(PVC)组成。介质室可以进行表面处理。表面处理的非限制性实例包括等离子体表面处理，用羧基基团、羟基基团、游离氨基基团和/或聚-D-赖氨酸涂覆以促进细胞附接，以及/或者用亲水的和带中性电荷的水凝胶层涂覆以抑制细胞附接。介质室可以包括例如至少约1μl至约30L范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约5L范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约1L范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约0.5L范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约250ml范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约100ml范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约50ml范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约25ml范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约10ml范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约5ml范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约1ml范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约500μl范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约100μl范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约50μl范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约25μl范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约10μl范围内的体积。介质室可以包括例如至少约1μl至约5μl范围内的体积。

介质室可以包括约1μl的体积。介质室可以包括约10μl的体积。介质室可以包括约100μl的体积。介质室可以包括约1000μl的体积。介质室可以包括约5ml的体积。介质室可以包括约10ml的体积。介质室可以包括约20ml的体积。介质室可以包括约30ml的体积。介质室可以包括约40ml的体积。介质室可以包括约50ml的体积。介质室可以包括约60ml的体积。介质室可以包括约70ml的体积。介质室可以包括约5ml的体积。介质室可以包括约80ml的体积。介质室可以包括约90ml的体积。介质室可以包括约100ml的体积。介质室可以包括约200ml的体积。介质室可以包括约300ml的体积。介质室可以包括约400ml的体积。介质室可以包括约500ml的体积。介质室可以包括约600ml的体积。介质室可以包括约700ml的体积。介质室可以包括约800ml的体积。介质室可以包括约900ml的体积。介质室可以包括约1000ml的体积。介质室可以包括约2L的体积。介质室可以包括约3L的体积。介质室可以包括约4L的体积。介质室可以包括约5L的体积。介质室可以包括约6L的体积。介质室可以包括约7L的体积。介质室可以包括约8L的体积。介质室可以包括约9L的体积。介质室可以包括约10L的体积。介质室可以包括约20L的体积。介质室可以包括约30L的体积。介质室可以包括约40L的体积。介质室可以包括约50L的体积。介质室可以包括约60L的体积。介质室可以包括约70L的体积。介质室可以包括约80L的体积。介质室可以包括约90L的体积。介质室可以包括约100L或更大的体积。

介质可以包含多个细胞、一种或多种聚合物前体、细胞成分(例如细胞器)和/或细胞培养基。聚合物前体可以包含至少两种不同的聚合物前体。聚合物前体可以是可聚合材料。聚合物前体可以包含胶原。介质中的胶原类型的非限制性实例包括纤维状胶原如I型、II型、III型、V型和XI型胶原，具有中断三重螺旋的原纤维相关胶原(FACIT)胶原如IX型、XII型和XIV型胶原，短链胶原如VIII型和X型胶原，基底膜胶原如IV型胶原、VI型胶原、VII型胶原、XIII型胶原或其任何组合。聚合物前体可以包括细胞外基质组分，其包括但不限于蛋白聚糖如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角质素，非蛋白聚糖多糖如透明质酸，以及弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白，或其任何组合。在一些情况下，聚合物前体可以包括聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、藻酸盐、聚氧化乙烯、聚乙二醇、聚氧化丙烯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、壳聚糖、纤维蛋白、纤维蛋白原、聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚(富马酸丙二醇酯)(PPF)、聚己内酯(PCL)、聚(β-氨基酯)、明胶、右旋糖、硫酸软骨素或其任何组合。细胞培养基的非限制性实例包括Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)、无血清细胞培养基、RPMI 1640培养基、最小必需培养基(MEM)、Iscove的改良Dulbecco培养基(IMDM)和Opti-MEM^TMI减少血清培养基。

介质还可以包含多个珠子。在一些情况下，形成的3D生物材料的至少一部分可以包括多个珠子。形成的3D生物材料的至少一部分可以包括多个微球和/或颗粒。珠子、微球和/或颗粒的大小范围可以为约1纳米至约200微米。珠子、微球和/或颗粒可以是化学惰性的。该珠子、微球和/或颗粒可以是中空的。珠子、微球和/或颗粒可以是固体。珠子、微球和/或颗粒可以包括核和壳。珠子、微球和/或颗粒可以是聚合物的、磁性的、多孔的、金属的、荧光的、染色的、水凝胶、脂质或其任何组合。珠子、微球和/或颗粒可以包含胶乳、至少一种类型的细胞外基质蛋白、细胞、药物、生物聚合物、脂质、生物相容性聚合物、小分子或其任何组合。生物聚合物的非限制性实例包括纤维蛋白、纤维蛋白原、壳聚糖、纤维素、右旋糖、几丁质、明胶、胶原、糖原、淀粉和木质素。生物相容性聚合物的非限制性实例包括胶原、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸、藻酸盐、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、聚氧化丙烯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、壳聚糖、纤维蛋白、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)共聚物或其任何组合。

珠子还可以包含信号传导分子或蛋白质。信号传导分子或蛋白质可以促进3D生物材料的形成以允许器官功能。可以用蛋白质、核酸和/或染料将珠子、微球和/或颗粒功能化。可以用链霉亲和素将珠子、微球和/或颗粒功能化。珠子、微球和/或颗粒的表面可以涂覆有至少一个信号传导分子、诸如抗体的蛋白质、诸如DNA和/或RNA分子的核酸、聚合物、小分子和/或染料。珠子、微球和/或颗粒可以封装有效负载，诸如例如，细胞、药物、信号传导分子、蛋白质、核酸、小分子、染料和/或聚合物如生物聚合物。可生物降解的珠子、微球和/或颗粒可以具有有效负载的受控释放。珠子、微球和/或颗粒可以是可生物降解的。可生物降解的珠子、微球和/或颗粒可以具有受控的和/或可定制的降解速率。珠子、微球和/或颗粒可以是不可生物降解的。珠子、微球和/或颗粒所包含的信号传导分子、蛋白质、核酸和/或任何其他材料可以促进3D生物材料的形成以允许器官功能。可能具有激动剂、拮抗剂、生长和/或细胞分化活性的信号传导分子、小分子和蛋白质如抗体的非限制性实例包括：转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)如FGF-1和FGF-2、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素1(Ang1)、Ang2、基质金属蛋白酶(MMP)、δ样配体4(Dll4)、3类脑信号蛋白、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、转化生长因子(TGF)、激活蛋白A、视黄酸(RA)、表皮生长因子(EGF)、thiazovivin。

随后，该方法可以包括根据计算机存储器中用于打印3D生物材料的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以形成3D生物材料的至少一部分。3D生物材料的一部分可以包括多个细胞的至少子集和由一种或多种聚合物前体形成的聚合物。3D生物材料的至少一部分可以包括微脉管系统，以向多个细胞提供一种或多种营养物。微脉管系统可以是血液微脉管系统、淋巴微脉管系统或其任何组合。微脉管系统可以具有约1微米(μm)至约20μm的横截面。3D生物材料可以具有约100μm至约5厘米(cm)的厚度或直径。

该方法可以包括根据3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至该介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分。该方法可以包括根据3D生物材料的部分3D结构和/或完整3D结构的计算机模型，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至该介质室中的介质。

该方法还可以包括沿着一个或多个另外的能量束路径将至少一个能量束引导至该介质室中的介质，从而形成该3D生物材料的至少另一部分。该方法还可以包括根据计算机指令，沿着至少两个能量束路径将至少两个能量束引导至该介质室中的介质，以允许该介质室中的介质的多个部分同时形成3D生物材料的至少一部分。该至少两个能量束可以具有相同的波长。该至少两个能量束可以具有不同的波长。

该计算机指令可以包括对应于3D生物材料的图像的集合。该计算机指令可以引导至少以下的调整：根据3D生物材料形成期间的时间的至少一个能量束的一个或多个参数，和/或3D生物材料形成于其上的台的位置。

可以通过沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至该介质室中的介质来将该3D生物材料的至少另一部分与形成的3D生物材料链接。可以通过沿着一个或多个另外的能量束路径将至少一个能量束引导至该介质室中的介质来将该3D生物材料的至少另一部分与形成的3D生物材料链接。可以不通过沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至该介质室中的介质来将该3D生物材料的至少另一部分与形成的3D生物材料链接。可以不通过沿着一个或多个另外的能量束路径将至少一个能量束引导至该介质室中的介质来将该3D生物材料的至少另一部分与形成的3D生物材料链接。

该能量束可以是多光子激光束120。至少一个能量束可以包括相干光。至少一个能量束可以由激光器生成。至少一个能量束可以是相位调制的。能量束可以被极化和/或与其他束重新组合。作为替代，该能量束可以是非相干光。至少一个能量束可以是多光子能量束。该多光子能量束可以是双光子能量束。能量束源(例如，激光)可以提供具有例如约300nm至约5mm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有例如约350nm至约1800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有例如约1800nm至约5mm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约1000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约1300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约1400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约1500nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约1600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约1700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约1800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约1900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约2000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约3000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约4000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量束(例如，激光)可以提供具有约5000nm的波长的能量(例如，激光束)。

随后，该方法可以包括在计算机存储器中生成3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示。该方法可以在将至少一个能量束引导至该介质室中的介质之前生成这样的表示。该方法可以使用点云表示或基于线的表示来生成计算机指令。点云表示或所述基于线的表示可以包括对应于3D生物材料的多维结构元件。点云表示或基于线的表示可以包括二维的结构元件。点云表示或基于线的表示可以包括三维的结构元件。点云表示或基于线的表示可以包括二维和三维的结构元件。结构元件可以与组织功能和/或细胞分离相关联。该结构元件可以是血管、***、脉管系统、微脉管系统、肌肉、韧带、腱、骨基质、软骨基质、***基质、细胞外基质、神经网络、支架或其任何组合。该结构元件可以是胶原纤维、网状纤维、弹性纤维、神经纤维、聚合物纤维、通道、微通道或其任何组合。

点云表示是由x、y和z坐标在x、y和z平面中定义的数据点的集合，该坐标表示物体(即原型)的外表面。点云表示可以由3D建模程序生成以产生CAD文件或任何线图集。在一些实例(例如，打印塑料或金属部件)中，可以使用3D扫描仪来生成物体的3D模型。3D扫描技术的非限制性实例包括激光三角测量3D扫描、结构光3D扫描、摄影测量、基于接触的3D扫描以及激光脉冲或飞行时间3D扫描。激光三角3D扫描技术涉及将激光束投影到物体表面上，并通过传感器测量激光射线的变形。基于激光射线的变形和三角学三角测量，激光三角系统计算特定的偏角。所计算的偏角直接与物体到扫描仪的距离相联系。当激光三角3D扫描仪收集到足够的距离时，其能够绘制物体的表面并创建3D扫描。结构光3D扫描技术测量物体表面上光图案的变形，以生成物体表面的3D扫描。结构光3D扫描也使用三角学三角测量，但依赖于一系列线性图案的投影而不是激光束的投影。然后，结构光3D扫描系统能够检查图案中每条线的边缘，并计算从扫描仪到物体表面的距离。摄影测量，也称为摄影术的3D扫描，使用计算几何算法以3D形式重构在2D图像中捕获的躯体。摄影测量的原理是分析静态物体从不同视角拍摄的几张照片，并自动检测与同一物理点相对应的像素。要求用户的数据输入是相机的参数，如焦距和透镜畸变。计算几何算法然后计算坐标之间的距离并输出物体的3D图像重构。基于接触的3D扫描或数字化可以依赖于物体表面上的几个点的采样，通过探头的变形来测量。接触3D扫描仪通过物理触摸探测物体，同时物体被牢固地固定到位。接触探头在物体的表面上移动以记录3D信息。有时将探头附接到能够收集其所有相应配置和角度的关节臂以更加精确。基于激光脉冲的3D扫描或飞行时间3D扫描可以基于激光束的飞行时间。在基于激光脉冲的3D扫描中，激光束投影在表面上并由传感器收集。激光束的发射和接收之间的传播时间提供了物体表面的几何信息。

本公开内容的方法和系统可以通过至少一种或多种算法来实现。可以在由中央处理单元1105执行时通过软件来实现算法。该算法可以例如基于计算机模型产生全息图或全息图像。该算法可以产生部分全息图。可以通过应用Gerchberg-Saxton算法或加权Gerchberg-Saxton算法在一个或多个SLM上实现光的脉冲整形，来产生结构元件的二元全息图像，然后可以将其投影以在一个、两个和/或三个维度中重新产生图像。在波前整形中可能有用的其他算法包括但不限于Lohmann、III型Lohmann和混合区域振幅自由度(mixed-region amplitude freedom，MRAF)算法。可能发生图像的其他预处理和后处理以适应不同类型的期望结构打印、对入射光脉冲的不同打印介质响应以及光学系统或细胞活力或投影系统变化的任何限制。数据处理中的这些变化可以包括但不限于傅立叶变换、导致像素去除的选择性掩模和/或用于在不同平面上同时打印以产生3D全息图的覆盖全息图。另外，这些过程可能需要对全息数据进行额外的切片或重新分配。

3D生物材料的计算机模型的基于线的表示形式可以定义为各种大小的线、顶点、边缘、表面、点或连接点的集合以及/或者定义3D形状的面的集合。面可以包括三角形(三角形网)、四边形、凸多边形、凹多边形和/或带孔的多边形。计算机存储器中的3D生物材料的计算机模型的基于线的表示的非限制性示例可以包括3D线图、2D线图、多边形网和自由曲面模型。多边形网是顶点、边缘和面的集合，其定义3D计算机建模中物体的形状。自由曲面模型描述了3D物体的表面。可以通过构造3D表面随后从其扫过的曲线并通过定义表面形状的极点或控制点操纵表面来产生自由曲面模型。

在生成3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示之后，该方法还可以包括将该点云表示或基于线的表示转换为图像。图像可以是全息图或全息图像。图像可以是部分全息图。图像可以以全息方式投影。图像可以被投影为部分全息图。在以全息方式投影之前可以对图像进行解构和重构。

该方法还可以包括沿着一个或多个另外的能量束路径提供又一个包含介质的介质室，该介质包括包含至少两种不同类型的细胞的多个细胞以及一种或多种聚合物前体，以形成3D生物材料的至少另一部分。3D生物材料的另一部分可以与形成的第一3D生物材料链接。3D生物材料的另一部分可以与形成的第一3D生物材料化学交联。3D生物材料的另一部分可以与形成的第一3D生物材料机械连接。机械耦合的非限制性实例包括接头、铰链、锁定接头和铰链、Velcro样元件、弹簧、线圈、拉伸点、互锁环、承窝、齿轮、棘轮、螺钉和链节。3D生物材料的另一部分可以与形成的第一3D生物材料粘结耦合。3D生物材料的另一部分可以经由使用3D全息打印的打印和活性沉积、细胞、细胞沉积的细胞外基质和/或由其他非生物方法形成的预先存在的结构而与第一3D生物材料链接。3D生物材料的另一部分可以与形成的第一3D生物材料聚合。3D生物材料的另一部分可以不与形成的第一3D生物材料链接。

该方法可以包括引导3D生物材料与其他组织的链接，该连接根据计算机模型。该方法可以包括将3D打印材料与已打印的结构直接连接、合并、结合或焊接，该连接根据计算机模型。在一些情况下，该方法可以提供将3D生物材料与其他组织连接，这可能涉及化学交联、机械连接和/或粘结耦合。

该方法还可以包括根据3D生物材料的计算机模型，沿着至少两个能量束路径将至少两个能量束引导至介质室中的介质，以允许介质室中的介质的多个部分同时形成3D生物材料的至少一部分。该至少两个能量束可以具有相同的波长。该两个能量束可以具有不同的波长。

该3D生物材料的一部分可以包括微脉管系统，用于向多个细胞提供一种或多种营养物。微脉管系统可以是血液微脉管系统、淋巴微脉管系统或其任何组合。微脉管系统可以具有例如约1μm至约20μm的横截面。该横截面可以是例如约1μm至约10μm。3D生物材料可以具有例如约100μm至约5厘米(cm)的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约200μm至约3cm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约300μm至约1cm的厚度或直径。

3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约10cm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约5cm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约4cm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约3cm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约2cm。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约1cm的厚度或直径。

3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约9mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约8mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约7mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约6mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约5mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约4mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约3mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约2mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约1mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约0.5mm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约0.1mm的厚度或直径。

3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约90μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约80μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约70μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约60μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约50μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约40μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约30μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约20μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约10μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约5μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约4μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约3μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约2μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约1μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约0.75μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约0.5μm的厚度或直径。3D生物材料可以具有例如约0.1μm至约0.25μm的厚度或直径。

3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约700小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约600小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约500小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约400小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约350小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约300小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约250小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约200小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约150小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约100小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约72小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约48小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约36小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约24小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约12小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约6小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约3小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约2小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约1小时的时间段内打印。3D生物材料可以在例如至少约0.01小时至约0.5小时的时间段内打印。

3D生物材料(或物体)可以在至多约350小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约300小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约250小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约200小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约150小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约100小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约72小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约48小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约36小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约24小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约12小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约6小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约2小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约1小时的时间段内打印。

3D生物材料的至少一部分可以包括含细胞的支架。含细胞的支架可以包括多个细胞的至少子集。3D生物材料可以包括含细胞的支架，该含细胞的支架可以包括多个细胞的至少子集。形成的3D生物材料可以包括多个含细胞的支架。3D生物材料可以包括含细胞的支架。多个含细胞的支架可以耦合在一起。含细胞的支架可以粘结地或机械地耦合在一起。含细胞的支架可以是空的、多孔的和/或中空的。含细胞的支架可以充当完整的元件或支撑结构、集合管或脉管元件的一部分。多个含细胞的支架可以粘结地耦合在一起。多个含细胞的支架可以机械地耦合在一起。多个含细胞的支架可以通过选自以下的一种或多种构件机械地耦合在一起：接头、铰链、锁定接头和铰链、Velcro样元件、弹簧、线圈、拉伸点、互锁环、承窝、齿轮、棘轮、螺钉和链节。

含细胞的支架可以包括网络。网络可以包括多条绞线。多条绞线可以形成网状结构。多条绞线可以形成网格结构。多条绞线可以形成片状结构。多条绞线可以形成管状结构。多条绞线可以形成孔网络。多条绞线可以形成圆柱形结构。多条绞线可以形成矩形结构。多条绞线可以形成正方形结构。多条绞线可以形成层叠或分层结构。多条绞线可以形成晶格结构。多条绞线可以形成多孔结构。多条绞线可以形成类似网的结构。多条绞线可以形成互联结构。多条绞线可以形成通道化结构。多条绞线可以形成六角形结构。多条绞线可以形成笼状结构。多条绞线可以形成球体。多条绞线可以形成多边形。

多条绞线中的单条绞线可以具有约0.1纳米(nm)至约5cm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约10cm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约5cm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约4cm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约3cm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约2cm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约1cm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约0.5cm的厚度。

多条绞线可以具有例如约0.1nm至约1000μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约900μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约800μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约700μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约600μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约500μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约400μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约300μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约200μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约100μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约50μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约25μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约10μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约1μm的厚度。

多条绞线可以具有例如约0.1nm至约900nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约800nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约700nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约600nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约500nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约400nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约300nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约200nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约100nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约50nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约25nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约10nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约1nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约0.5nm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约0.25nm的厚度。

多条绞线可以具有例如约0.1nm至约800μm的厚度。多条绞线可以具有例如约0.1nm至约1μm的厚度。多条绞线可以具有例如约1μm至约100μm的厚度。多条绞线可以具有例如约1毫米(mm)至约100mm的厚度。多条绞线可以具有例如约1cm至约5cm的厚度。

该方法可以包括可以在3D生物材料的至少一部分内形成的3D生物材料的至少另一部分。

该方法可以包括在首先将至少一个能量束引导至介质室中的介质之后，在首先形成的3D生物材料的一部分内形成3D生物材料的另一部分。该方法可以包括在先前打印的3D物体内打印3D物体。该方法可以包括在先前打印的3D生物材料内打印3D物体。先前打印的结构可以是3D物体，其可以由聚合物材料、金属、金属合金、复合材料或其任何组合形成。3D物体可以由聚合物材料形成，在一些情况下该聚合物材料包括生物材料(例如，一个或多个细胞或细胞组件)。通过精确打印和在x、y和z平面上的精确能量束激发，可以在先前打印的3D物体内打印3D物体。

该方法可以包括通过使用具有在近红外光谱中的波长的至少一个能量束在先前打印的3D结构内打印3D物体。近红外波长可以穿透组织和结构。该方法可以包括将具有在近红外光谱中的波长的至少一个能量束作为对应于3D物体的3D投影引导至介质中，可以允许3D投影穿透先前打印的3D物体。该方法可以包括将具有在近红外光谱中的波长的至少一个能量束作为对应于3D生物材料的3D投影引导至介质中，可以允许3D投影穿透先前打印的3D生物材料。该3D投影可以是全息图。该3D投影可以是部分全息图。具有在近红外光谱中的波长的能量束可以具有最小的散射或不具有散射。当将其作为3D投影引导至介质中时，具有在近红外光谱中的波长的能量束可以在组织或先前打印的3D物体、结构和/或生物材料内合并为全息图打印。

近红外光谱的范围可以为约650纳米(nm)至1毫米(mm)。在近红外光谱内，近红外(NIR)窗口(即，光学窗口或治疗窗口)定义了例如约650至1350nm的波长范围，在该范围内的光在组织中具有其最大的穿透深度。此外，远红光谱的范围可以为约710nm至约850nm。在本文公开的方法中使用的能量束可以是具有在NIR光谱中的波长的NIR能量束。在本文公开的方法中使用的能量束可以是具有在NIR窗口光谱中的波长的NIR能量束。在本文公开的方法中使用的能量束可以是具有在远红光谱中的波长的NIR能量束。

NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约650nm至约1mm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约710nm至约850nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约650nm至约1350nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约650nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约700nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约710nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约750nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约800nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约850nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约900nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约950nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约1000nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约1300nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约1350nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约1500nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约2000nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约2500nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约3000nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约3500nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约4000nm的波长的能量(例如，激光束)。NIR能量束(例如，激光)可以提供具有约5000nm的波长的能量(例如，激光束)。

可以根据3D生物材料的点云表示、基于线的表示、部分3D结构、完整3D结构或3D投影(即全息图或部分全息图)，沿着至少一个能量束路径将具有在NIR光谱中的波长的能量束引导至介质室中的介质。在一些实例中，将部分或完整3D结构同时投影到介质中。具有在NIR光谱中的波长的能量束可以穿透介质室内的先前形成的结构。具有在NIR光谱中的波长的能量束可以穿透介质室内的先前形成的含细胞的支架。具有在NIR光谱中的波长的能量束可以穿透位于介质室内的先前形成的3D生物材料。被引导至介质室中介质的具有在NIR光谱中的波长的能量束可以使聚合物前体的至少一部分经历在3D生物材料的先前形成的部分内形成3D生物材料的至少一部分。被引导至介质室中介质的具有在NIR光谱中的波长的能量束可以使聚合物前体的至少一部分经历在3D物体的先前形成的部分内形成3D物体的至少一部分。在本文提供的方法中使用的能量束的特定NIR波长可以通过根据3D生物材料的3D投影(即全息图或部分全息图)沿着至少一个能量束路径穿透先前形成的结构来实现在先前形成的结构内打印3D生物材料。

在另一方面，本公开内容提供了打印三维(3D)生物材料的另外的方法。该方法可以包括在计算机存储器中接收3D生物材料的计算机模型。

随后，该方法可以包括在计算机存储器中生成3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示。

随后，该方法可以包括提供包含第一介质的介质室，其中该第一介质包含第一多个细胞和第一聚合物前体。第一介质可以包含谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。

随后，该方法可以根据计算机存储器中用于打印3D生物材料的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第一介质，以使介质室中的第一介质的至少一部分形成3D生物材料的第一部分。

随后，该方法可以包括在介质室中提供第二介质，其中该第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中该第二多个细胞与第一多个细胞是不同的类型。第二介质可以包含谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。

随后，该方法可以包括根据计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D生物材料的至少第二部分。

该方法还可以包括在从介质室去除剩余的第一介质，以将3D生物材料的第一部分留在介质室中。留在介质室中的3D生物材料的第一部分可以被可移除地固定到介质室。

该方法还可以包括在计算机存储器中生成3D生物材料的点云表示或基于线的表示。该方法还可以使用点云表示或基于线的表示来生成计算机指令。该方法还可以包括将点云表示或基于线的表示转换为图像或图像集合，该图像或图像集合可以用于在空间上调制入射的相干光源，使得生物结构可以以一维投影。该方法还可以包括将该点云表示或基于线的表示转换为图像或图像集合，该图像或图像集合可以用于在空间上调制入射的相干光源，使得生物结构可以以二维投影。该方法还可以包括将点云表示或基于线的表示转换为图像或图像集合，该图像或图像集合可以用于在空间上调制入射的相干光源，使得生物结构可以以三维投影。该方法还可以包括将点云表示或基于线的表示转换为图像或图像集合，该图像或图像集合可以用于在空间上调制至少一种入射的相干光源，使得生物结构可以以一维、二维和/或三维结构的混合投影。该方法的图像或图像集合可以以全息方式投影。可以在以全息方式投影之前将图像或图像集合进行解构和重构为部分元件或代表性结构。点云表示或所述基于线的表示可以包括对应于3D生物材料的多维结构元件。点云表示或基于线的表示可以包括二维的结构元件。结构元件可以与组织功能和/或细胞分离相关联。点云表示或基于线的表示可以包括三维的结构元件，其中该结构元件可以与组织功能和/或细胞分离相关联。

至少一个能量束可以包括相干光。至少一个能量束可以由激光器生成。至少一个能量束可以是相位调制的。可以在整个样品介质中对至少一个能量束进行相位调制和光栅扫描。3D生物材料的至少一部分可以包括微脉管系统，以向多个细胞提供一种或多种营养物。介质还可以包含多个珠子。形成的3D生物材料的至少一部分可以包括多个珠子。3D生物材料可以在至多约350小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约72小时的时间段内打印。3D生物材料可以在至多约12小时的时间段内打印。该方法可以包括可以在3D生物材料的第一部分和/或3D生物材料的第二部分内形成的3D生物材料的至少另一部分。

使用快速多光子打印系统100可以生成多种组织结构，诸如厚的复杂的组织层，其包括血管、淋巴脉管系统、***网络、细胞小生境或细胞弹性结构，等等。在许多情况下，可以由天然组织结构的扫描或映射生成计算机生成的三维模型的三维投影，这允许精确地复制天然组织。这样的组织可以由多种不同的细胞类型组成，每种都以特定方式进行组织以便生成特定结构或提供特定功能。例如，血管如动脉和静脉可以由内皮细胞、基底层(细胞外基质的层)、***和平滑肌细胞层组成。含血管的组织还可以包括形成血管四周的组织的细胞。例如，肝组织还可以包括肝细胞。肝细胞可以在肝中分组为相似的功能单元，并且外观相似，但根据其位置可能表达不同的基因。这种区室化可以允许肝在不同位置执行肝的多种功能。每个细胞可不参与蛋白质的氧化、活性氧类的解毒和胆汁产生。根据它们在肝中的位置，可以将这些任务给予不同组的肝细胞。肝中的其余细胞(统称为非实质细胞)可发现于大量肝细胞之间的区室中。因此，当打印肝组织时，可以适当地布置与血管形成有关的细胞类型，以促进和支持这些细胞的组织进入血管；并且可以同样适当地布置肝细胞和非实质细胞以形成期望的最终结果组织。这样的布置可以通过在三个维度上打印临时细胞组织的组织内的打印网和其他结构的层来实现。大多数器官的结构可能需要将多种细胞类型分层并分组为功能性单元，其中一些细胞如上所述支持这些单元的功能，而一些细胞是实际的功能性元件。可以使器官血管化以维持组成整个器官的这些功能性单元内的细胞健康。在免疫系统功能的情况下，***的高度组织化结构可能有助于细胞对感染剂的适当应答的能力。为了适当地应答感染，多种细胞类型可以彼此接触，以通过细胞表面接触来交换有关引起免疫应答的病原体或药剂的信息。这些接触可以通过释放细胞信号传导分子来精心安排，并具有模式和接触时序。细胞-细胞相互作用的破坏或淋巴组织的错构(其中细胞分散在或不在其在组织内的正常区域中)可能是免疫系统无法适当应答或无法发育对抗体的高度选择性的原因或者与之相关联。因此，诸如此类的用于移植或药物开发目的的组织重构不仅可以受益于滋养且支撑细胞的微脉管系统的放置，而且可以受益于细胞本身的放置，使得它们可以被组织为相互作用并产生必需信号以执行组织功能，这是在对感染剂应答期间在***内所必需的。

在一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)物体的方法。该方法可以包括将至少一个能量束引导至包含一种或多种前体的介质中以生成3D物体。3D物体可以包括由一种或多种前体形成的材料。一种或多种前体可以是聚合物前体。一种或多种前体可以包括一种或多种金属。一种或多种前体可以包括玻璃或砂前体。一种或多种前体可以是粉末。材料可以是聚合物材料。材料可以包括至少一种金属。材料可以包括玻璃或砂(例如，绿砂)。材料可以包括聚合物前体、金属前体和/或玻璃前体的混合物。例如，材料可以是alumide(即，聚酰胺和铝的混合物)、聚酰胺和玻璃的混合物和/或尼龙和玻璃的混合物。聚合物材料可以是粉末。聚合物材料可以包含在制造粉末床中。聚合物材料的非限制性实例可以包括尼龙、聚苯乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚苯乙烯、聚醚醚酮(PEEK)、聚丙烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、热塑性聚氨酯、热塑性弹性体和聚氧代亚甲基。尼龙材料可以是玻璃纤维填充尼龙、纤维填充尼龙或耐用尼龙。聚酰胺可以是阻燃聚酰胺。金属的非限制性实例可以包括钢、钛、金属合金混合物和铝。金属合金混合物可以包括镍铬和钴铬合金。

随后，可以将至少一个能量束作为3D投影引导至介质中。3D投影可以对应于3D物体。3D投影可以是全息图。3D投影可以是部分全息图。3D投影可以是全息图像。全息图或全息图像可以是一维、二维和/或三维图像。该方法可以包括在计算机存储器中接收3D物体的计算机模型。计算机模型可以是计算机辅助设计(CAD)模型。CAD模型可以是3D线框、3D实体模型(如参数模型和直接或显式模型)和/或自由曲面模型。在使用诸如3D扫描仪、计算机断层成像(CT)扫描设备、结构光3D扫描仪、调制光3D扫描仪、激光扫描仪、显微镜或磁共振成像(MRI)设备等设备对物理原型进行扫描和/或成像后，可以通过计算机生成CAD模型。在一些情况下，通过使用将原型图像或扫描转换为表面模型、网状模型或体积模型的算法，将原型图像或扫描转换为CAD模型。该方法可以包括接收包括3D物体的部分3D结构和/或完整3D结构的计算机模型。本文公开的用于打印3D生物材料的系统可以与用于打印3D物体的系统相同。

介质可以包含细胞或细胞成分。细胞成分可以包括但不限于细胞器，如线粒体、核、核糖体、囊泡、高尔基体、细胞骨架组分、光面内质网、液泡和叶绿体；磷脂；和细胞膜。

在一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的方法。该方法可以包括将至少第一能量束引导至包括第一介质的介质室中。第一介质可以包含第一多个细胞和第一聚合物前体以生成3D生物材料的第一部分。该方法可以包括将至少第二能量束引导至包括第二介质的介质室中。第二介质可以包含第二多个细胞和第二聚合物前体以生成3D生物材料的第二部分。3D生物材料的第二部分可以邻近于3D生物材料的第一部分。

至少第一能量束和至少第二能量束可以来自相同的能量源。至少第一能量束和至少第二能量束可以是激光束。第一多个细胞中的细胞和第二多个细胞中的细胞可以是不同类型。第一多个细胞中的细胞和第二多个细胞中的细胞可以是相同类型。第一聚合物前体和第二聚合物前体可以不同。第一聚合物前体和第二聚合物前体可以相同。

网产生

可以通过使可聚合材料以为了在细胞间产生期望的网结构500的图案和方式聚合，在介质126内产生网结构。图11图示了由可聚合材料形成的网结构500的实例。在该实例中，网结构500可以具有由网链502形成的网格形状。网链502可以具有例如至少约0.0001微米至约100微米的厚度。图12A图示了由具有约0.1微米的厚度的链502组成的网结构500，并且图12B图示了由具有至少约5微米的厚度的链502组成的网结构500。不同大小的链可用于产生不同大小和密度的网状网络，以促进细胞-细胞通信，从而允许细胞运动被促进或阻止，或支持组织性质，使得可以存在与不同的网状网结构相关联的弹性、强度或压缩力的差异。如图11所示，在一些情况下，网结构500可以具有孔504，其大小被设计成允许特定的细胞506穿过并限制其他细胞通过。在一些情况下，孔504的大小范围可以为例如至少约3微米至约100微米。图11图示了具有孔504的网结构500，孔504的大小和配置被设计为防止大小为至少约4微米(诸如例如，约4微米至约100微米)的任何细胞506从其通过。当生成网结构500时，这可以将细胞506临时捕获在网结构500内。可以理解，网结构可以具有任何几何形状诸如圆形、六边形、八边形或正方形的多种孔504。

在一些情况下，可以将这些细胞大小特定网设计成隔离特定类型的圆形细胞。细胞的圆形化可能由环境的化学变化或温度变化诱导，并且在打印期间可以使用这些变化的组合。在某些生理条件下，圆形细胞可能不移动或行进，但可能会悬浮在原位。图13图示了暂时捕获在网500内的圆形细胞506。在该实例中，孔504在悬浮于介质126中时可以小于细胞类型的圆形直径，但大于细胞核的估计直径。在一些情况下，孔504可以具有与细胞核相同的大小或比细胞核小约1微米。可以选择这些大小以产生特定细胞506的临时限制。细胞可以穿过比细胞核大的孔，但可以被较小的孔限制。在该实施方式中，可以在使细胞506圆形化以便被网500捕获的条件下打印网500。一旦打印材料恢复到生理条件，则细胞506可能不再是圆形，并且可以能够行进并移动通过孔504，如图14所示。图14示出了彼此靠近安设的第一网和第二网，使得细胞506可以能够移动通过孔504并在生理条件下接合，从而允许细胞-细胞接触，重新排序和自然增殖，同时维持总结构安排和支撑。由第一网结构500a和第二网结构500b产生的细胞层和小生境可以一起形成含细胞元件的超结构，该含细胞元件被设计用于三维组织在培养中发育期间促进细胞-细胞接触和移动。

然后，可以通过组织发育的最终阶段安设、重新吸收、降解或以其他方式损失第一网结构500a和第二网结构500b。在一些情况下，通过由表达基质金属蛋白酶的细胞进行酶消化或其他方法损失第一网结构500a和第二网结构500b可以。

网特征

网可以包括多种特征以协助产生多种类型的组织和组织结构。这样的特征可以包括但不限于厚度、密度和结构设计的变化以影响网结构500内的细胞的移动和/或影响网结构500的总体形状。另外的特征可以包括但不限于多种机械元件，以协助总体网500的成形，诸如将网的一部分连接至其自身或其他网，并进一步影响最终组织结构的形式。这些和其他网特征描述于本文。

在一些情况下，可以通过改变投影在介质126内的各个位点处的多光子激光束120的强度、延长其暴露时间或重复其暴露来产生具有多种结构特征的网。在一些情况下，在介质126中某些关键点处的强度变化或延长暴露可以在网结构中产生可影响所沉积的细胞的密度的特征。这可导致在这些点处可用于组织构造的机械差异。图15A-图15C图示了在网结构500内产生这样的结构特征的区域的方法。图15A示出了通过将来自多光子组织打印打印头118的光学器件的多光子激光束120投影到介质126中来生成网结构500。图15B图示了来自靶向网结构500内特定坐标520的激光束的多光子激光束120’的第二投影。在该实施方式中，特定坐标520可以与网结构500的网链502的预定相交处重合。第二投影120’可以与第一投影150处于相同或不同的波长。多光子激光束120’的该第二投影可以提高特定坐标520处网材料的密度。图15C图示了最终的网结构500，其在网链502的预定相交处具有多种增强点。

图16A-图16C图示了在网结构500内产生这样的结构特征的区域的另一方法。图16A示出了通过将来自多光子组织打印打印头118的光学器件的多光子激光束120投影到介质126中来生成网结构500。图16B图示了靶向网结构500内特定坐标520的多光子激光束的第二投影120’。在该实施方式中，特定坐标可以与各个网链重合，这些网链一起形成具有Z字形的结构特征530。多光子激光束120’的第二投影可以与多光子激光束120的第一投影处于相同或不同的波长。多光子激光束120’的该第二投影可以提高特定坐标520处网材料的密度。图16C图示了具有增强的Z字形结构特征530的最终网结构500。类似于平行管的支撑和线性毛细管的加固，许多管具有可以被支撑的分支。在一个实例中，可以将用于增强组织和细胞网的Z字形用于平行打印增强中，以支撑打印的组织中分支的毛细管结构。在另一实施方式中，Z字形的层可以响应于垂直压缩力和平行剪切力而提供结构支撑。

在细胞网内具有高密度的线或区域允许细胞按照某些准则使组织变形。结构用途的一个这样的证明可以是成纤维细胞的组织化，以在旨在形成血管的血管上皮细胞周围形成组织。简单的成纤维细胞片可会导致不支撑毛细管的管结构的变形，并因此损害打印的毛细管结构的功能和结构。相反，较厚的网区域如平行线增强可以以支撑期望组织结构如血管内皮细胞的管的方式引导结构变形，如图16D所示。

在一些实施方式中，使用沿着网结构500的增加的厚度区域来影响细胞以参与高压相互作用。这样的相互作用可能导致总体网结构500形成折叠或褶皱，这对于最终的组织结构可能是期望的。图17A-图17B和图18A-图18B图示了由于在培养中的三维组织发育期间的细胞-细胞接触和移动，网内的结构特征的使用，导致组织结构以特定方式折叠或褶皱。图17A图示了形成在介质126内的网结构500，其中网结构500包括沿特定网链的结构增强540以及其间的网的第一未增强部分503a和第二未增强部分503b。在一些实施方式中，通过用具有不同直径的网链构造网结构500来制造这样的结构增强540。在图17A的实施方式中，第一网链502a和第二网链502b具有比网结构500内的其他链更大的直径，并且间隔一定距离地彼此平行布置。较大的直径充当增强。第三网链502c具有小于第一网链502a和第二网链502b的直径，并且平行于第一网链502a和第二网链502b位于其间布置。第三网链502c也被增强到较小的程度。剩余的网部分是未增强的，并且驻留于被增强的第一网链502a、第二网链502b与第三网链502c之间，如图所示。细胞506如成纤维细胞被捕获在网结构500内，在网结构500的第一未增强部分503a与第二未增强部分503b之中，在增强的第一网链502a、第二网链502b与第三网链502c之间。细胞506然后开始细胞相互作用和细胞移动的过程。由于细胞506可以在网结构500的第一未增强部分503a和第二未增强部分503b内自由地通信，因此由细胞-细胞相互作用产生张力。这将第一网链502a和第二网链502b拉向彼此，如图17B所示。第三网链502c使开始折叠或褶皱的第一未增强部分503a和第二未增强部分503b保持分离。由于第三链502c被增强到较小程度，因此沿褶皱的细胞506能够在第三网链502c上方和周围相互作用，从而进一步稳定折叠形状。图18A-图18B从侧视图图示了图17A-图17B的网结构500的实施方式。图18A图示了当细胞移动和通信时细胞506的向下运动(由箭头指示)以形成折叠。图18B图示了已经在第一网链502a、第二网链502b与第三网链502c之间形成折叠的细胞506，并且第三网链502c将第一网链502a和第二网链502b拉向彼此。

图19A-图19C图示了网结构500的另一实施方式，其具有增加的厚度区域以影响或迫使细胞参与高压相互作用，从而导致折叠或褶皱。图19A图示了在介质126内形成的网结构500，其中网结构500包括沿着特定网链的第一结构增强540a、第二结构增强540b和第三结构增强540c以及其间的网的未增强部分。更具体地，第一结构增强540a、第二结构增强540b和第三结构增强540c具有以平行方式定位的线或细长区域的形状，使得网结构500的第一未增强部分503a和第二未增强部分503b的部分驻留于其间。细胞506如成纤维细胞被捕获在网结构500内，第一未增强部分503a与第二未增强部分503b之中，并且在第一结构增强540a、第二结构增强504b与第三结构增强504c之间。细胞506然后开始细胞相互作用和细胞移动的过程。由于细胞506可以在网结构500的第一未增强部分503a和第二未增强部分503b内自由地通信，因此由细胞-细胞相互作用产生张力。这将第一网链502a和第二网链502b拉向彼此，如图19B所示。增强使开始折叠或褶皱的第一未增强部分503a和第二未增强部分503b保持分离。图19C提供了组织的侧视图，示出第一未增强部分503a、第二未增强部分503b和第三未增强部分503cb被拉在一起，从而形成折叠或褶皱。

在一些实施方式中，网结构500的密度的变化指导细胞506的移动和相互作用。图20图示了具有由低密度网区域162包围的高密度网区域560的网结构500的实例。高密度网区域560由孔组成，该孔小于低密度网区域562的孔。因此，与低密度网区域562相比，高密度区域560具有更高数目的孔。高密度网区域560较小的孔大小阻止细胞506移动穿过其中。因此，当细胞506移动并相互作用时，细胞506避开高密度网区域560，从而在高密度网区域560周围或四周产生组织结构。因此，一旦网结构500溶解、降解或以其他方式被去除，则孔或通道保留在高密度网区域560的位置。当多个网分层使得高密度网区域对准时，可以形成穿过细胞506四周的主体的内腔。这是可以在单个打印结构中完成细胞的低密度区域同时在其他区域集中细胞的一种方式。

在一些情况下，高密度网区域560可以包含抑制细胞迁移、粘附和/或牵引的信号传导分子、细胞因子、蛋白质、表面涂层、聚合物如亲水性聚合物和/或表面处理如等离子体处理。在一些情况下，低密度网区域562可以包含促进细胞迁移、粘附和/或牵引的信号传导分子、细胞因子、蛋白质、表面涂层、聚合物如疏水性聚合物和/或表面处理。

图21图示了另一实施方式，其中网结构500的密度变化指导细胞506的移动和相互作用。在该实施方式中，网结构500包括第一网部分570和第二网部分572，其中高密度网区域574驻留于其间。另外，梯子576由延伸穿过高密度网区域560的较低密度网区域形成，桥接第一网部分570和第二网部分572。因此，被捕获在第一网部分570和/或第二网部分572中的细胞506能够沿着梯子576移动，同时避开高密度网区域560。这在预定方向上指导细胞506，并允许细胞506根据预定形状形成组织结构。可以理解，在其他实施方式中，不存在高密度网区域560，其中不存在网材料。这也沿着梯子576指导细胞506，特别是当梯子576包含促进细胞粘附或吸引的特征时。

图22图示了另一实施方式，其中网结构500的密度变化指导细胞506的移动和相互作用，从而形成三维组织结构。在该实施方式中，网结构500包括第一网部分570和第二网部分572，其中高密度网区域560驻留于其间。因此，被捕获在第一网部分570和/或第二网部分572中的细胞506由于高密度网区域560而无法移动。这在预定方向上指导细胞506，并允许细胞506根据预定形状形成组织结构。

图23A-图23E、图24A-图24B、图25图示了沿着网链502的纹理化元件600，其促进细胞粘附、吸引和/或相互作用。纹理化元件可以被构造有凹坑(divot)、凸起的刻痕、粗糙边缘，或用于细胞粘附和/或细胞与表面相互作用的目的而故意产生的非完全光滑的表面的任何元件。

细胞网可以与作为天然结构材料的一部分的特定酶切割位点一起形成，使得可以鼓励基质金属蛋白酶的天然活性来重塑打印的结构，从而允许细胞移动、流动和/或细胞-细胞相互作用。表2中给出了基于蛋白质的结构内这样的酶切割位点的非限制性实例的列表。

表2.基于蛋白质的结构内酶切割位点的实例。

细胞表达实例	酶	底物实例
			成纤维细胞	MMP1	胶原
上皮细胞	MMP9	明胶、胶原
			巨噬细胞	MMP12	弹性蛋白

图26图示了具有切割位点610的网结构500的实施方式。因此，网结构500包括不可切割的聚合物链和可切割的聚合物链。在该实施方式中，网结构500包括成纤维细胞活化蛋白(FAP)，其允许细胞506从中穿过。在打印期间聚合以产生含细胞的生物凝胶的单体也可以掺入具有基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的蛋白质，以允许细胞参与沉积结构的功能性重塑。可掺入打印介质或用于聚合成特定结构的MMP反应蛋白包括但不限于蛋白质；胶原蛋白I、II、III、VII、VIII、X，明胶，纤连蛋白和弹性蛋白。

在一些实施方式中，网包括打印的机械元件，其被设计用于在组织结构内提供特定功能或协助将各种组织结构结合在一起。这样的机械元件包括接头、铰链、锁定接头和铰链、Velcro样元件、弹簧、线圈、拉伸点、互锁环、承窝、齿轮、棘轮、螺钉和链节，等等。可以打印机械元件以便将其嵌入在网内、沿着网的表面(诸如沿着平坦表面或沿着边缘)安设，或者放置在某个位置以协助将网的两个部分或两个单独的网结合或连接在一起。因此，在一些实施方式中，通过使用机械元件将单个网连接在一起而形成分层的组织结构。在其他实施方式中，将未连接的结构小生境嵌入在打印的脉管网络内。当小生境被打印为未连接的近侧结构或具有附接到先前打印的结构的连接的新结构时，这些含细胞的网形成由移动细胞和被设计用于在培养中的组织发育期间促进细胞-细胞接触和移动的附加元件组成的半自主的、主动的结构。

可以理解，许多机械元件由可配合在一起的单个部分如铰链的两个可接合部分或两个互锁环组成。在这样的实施方式中，可以以配合的配置打印机械元件的部分打印。在其他实施方式中，该部分可以在打印后配合，因为具有可配合单元的片或边缘可以在组织移动期间响应于细胞发育和其中施加的力或者响应于外力如沿气道或脉管系统的压力而紧密接近。在一些实施方式中，机械元件被打印成使得第一部分附接到第一网并且第二部分附接到第二网。在配合时，第一网和第二网能够在机械元件的位置处相对于彼此移动。这可以协助将各种网结构结合在一起以产生复杂的三维组织结构，特别是以受益于发育期间的相关移动的方式。可以理解，机械元件可以替代地或附加地被打印成使得第一部分附接到网的第一部分，并且第二部分附接到同一网的第二部分，其中网的部分在机械元件的位置处相对于彼此移动。这可以在发育期间协助包裹、成环、扭曲或网内的其他期望的移动。

图27A-图27B图示了包括枢轴接头700的机械元件的实施方式。在该实施方式中，如图27A所示，枢轴接头700包括具有带有圆形表面705的第一头部704的第一突起702和具有带有凹陷表面709的第二头部708的第二突起706。凹陷表面709可与圆形表面705配合，使得第一头部704能够抵靠凹陷表面709在单个方向上(如以摇摆运动)枢转。在一些实施方式中，接头700被打印成使得第一突起702附接到第一网结构500a并且第二突起706附接到第二网结构500b，如图27B所示。在配合时，第一网结构500a和第二网结构500b能够在枢轴接头700的位置处相对于彼此枢转。

图28A-图28B图示了包括球窝接头720的机械元件的实施方式。在该实施方式中，如图28A中的横截面图所示，球窝接头720包括具有圆形球头724的第一突起702和具有凹陷窝头728的第二突起706。凹陷窝头728可与圆形球头724配合，使得圆形球头724能够在凹陷窝头728内以类似于解剖学球窝关节的方式旋转。在一些实施方式中，球窝接头720被打印成使得第一突起702附接到第一网结构500a并且第二突起706附接到第二网结构500b，如图28B所示。在配合时，第一网结构500a和第二网结构500b能够在球窝接头720的位置处在多个方向上相对于彼此旋转。

图29A-图29B图示了包括鞍形接头740的机械元件的实施方式。在该实施方式中，如图29A所示，鞍形接头740包括具有带有鞍形压痕745的第一头部704的第一突起702和具有带有对应的第二鞍形压痕749的第二头部708的第二突起706。第一头部704和第二头部706可以以90度的偏移定向，使得第一压痕745和第二压痕749如图所示是可配合的。因此，第一头部704和第二头部706能够在单个方向上绕彼此旋转。在一些实施方式中，鞍形接头740被打印成使得第一突起702附接到第一网结构500a并且第二突起706附接到第二网结构500b，如图29B所示。在配合时，第一网结构500a和第二网结构500b能够在鞍形接头740的位置处在单个方向上相对于彼此枢转。

图30-图31图示了包括承窝接头760的机械元件的实施方式。在该实施方式中，如图30所示，承窝接头760包括具有带有承窝形腔765的第一头部704的第一突起702和具有形状被设计成装配在承窝形腔765内的第二头部708的第二突起706。在该实施方式中，承窝形腔765是管形形状，并且第二头部708是圆柱形形状的，以便可***承窝形腔765中。第二头部708能够在承窝形腔765内纵向滑动和旋转。在一些实施方式中，承窝接头760被打印成使得第一突起702附接到第一网结构500a并且第二突起706附接到第二网结构500b，如图31所示。在配合时，第一网结构500a和第二网结构500b能够在承窝接头760的位置处相对于彼此滑动和旋转。

图32-图33图示了包括螺纹接头770的机械元件的实施方式。在该实施方式中，如图32所示，螺纹接头770包括具有带有承窝形腔765的第一头部704的第一突起702，承窝形腔765具有第一凹槽777a、第二凹槽777b、第三凹槽777c，以及具有带有第一螺纹779a、第二螺纹779b和第三螺纹779c的第二头部708的第二突起706。其中第二头部708的形状被设计成装配在承窝形腔765内，使得第一螺纹779a、第二螺纹779b和第三螺纹779c以螺钉型方式与第一凹槽777a、第二凹槽777b和第三凹槽777c配合。在一些实施方式中，螺纹接头770被打印成使得第一突起702附接到第一网结构500a并且第二突起706附接到第二网结构500b，如图33所示。在配合时，第一网结构500a和第二网结构500b能够在螺纹接头770的位置处相对于彼此旋转，由于螺纹而抵抗纵向滑动。

图34A-图34B图示了包括线圈或弹簧800的机械元件的实施方式。在该实施方式中，如图34A所示，弹簧800具有第一端部802、第二端部804以及其间的盘绕或螺旋配置，以便在第一端部802与第二端部804之间提供弹簧张力。在一些实施方式中，弹簧800被打印成使得第一端部802附接到第一网结构500a并且第二端部804附接到第二网结构500b，如图34B所示。因此，第一网结构500a和第二网结构500b能够相对于彼此移动，同时弹簧800保持连接。

图35A-图35B图示了包括链810的机械元件的实施方式。在该实施方式中，如图35A所示，链810具有第一端部802、第二端部804以及其间处于链状配置的第一链节816a、第二链节816b、第三链节816c和第四链节816d，以便将第一端部802和第二端部804连接在一起。在一些实施方式中，链810被打印成使得第一端部802附接到第一网结构500a并且第二端部804附接到第二网结构500b，如图35B所示。因此，第一网结构500a和第二网结构500b能够相对于彼此移动，同时链810保持连接。

图36A-图36B图示了包括挂钩接头820的机械元件的实施方式。在该实施方式中，如图36A所示，挂钩接头820包括具有弯曲形状的第一钩822和同样具有弯曲形状的第二钩824。第一钩822和第二钩824是可配合的，使得弯曲形状钩在一起，如图所示。在一些实施方式中，挂钩接头820被打印成使得第一钩822附接到第一网结构500a并且第二钩824附接到第二网结构500b，如图36B所示，其中示出了多个挂钩接头(即，第一挂钩接头820a、第二挂钩接头820b、第三挂钩接头820c和第四挂钩接头820d)。因此，第一网结构500a和第二网结构500b能够相对于彼此移动，同时第一挂钩接头820a、第二挂钩接头820b、第三挂钩接头820c和第四挂钩接头820d保持连接。

图37A-图37C图示了包括钩环接头830的机械元件的实施方式，钩环接头830以类似于的方式工作。在该实施方式中，钩环接头830包括具有多个小钩的钩表面832和具有多个小环的环表面834。钩表面832与环表面834是可配合的，其中小钩与小环接合，如图37A所示，从而将钩表面832和环表面834保持在一起。然而，可以通过将钩表面832与环表面834拉离彼此而使钩表面832与环表面834脱离，如图37B所示。在一些实施方式中，钩环接头830被打印成使得钩表面832附接到第一网结构500a并且环表面834附接到第二网结构500b，如图37C所示。因此，第一网结构500a和第二网结构500b通过钩表面832和环表面834的相互作用而相对于彼此结合和保持，但可以以足够的拉力使其脱离。

图38A-图38C图示了包括铰链840的机械元件的实施方式。在一些实施方式中，如图38A所示，铰链840包括具有带有穿过其中的第一托架开口846的第一托架突起844的第一托架842和具有带有穿过其中的第二托架开口852的第二托架突起850的第二托架848。铰链840还包括杆854，其大小和配置被设计成延伸穿过第一托架开口846和第二托架开口852。图38B图示了第一托架842和第二托架848，使得杆854延伸穿过第一托架开口846和第二托架开口852，以将第一托架842和第二托架848结合在一起，同时允许第一托架842和第二托架848彼此回转和旋转，朝向或远离彼此移动。在一些实施方式中，铰链840被打印成使得第一托架842附接到第一网结构500a并且第二托架848附接到第二网结构500b，如图38C所示。因此，第一网结构500a和第二网结构500b通过铰链840相对于彼此结合和保持，但可以相对于彼此回转和倾斜。

如前所述，机械元件提供多种功能，诸如将网的部分和/或各种网结构结合在一起以产生复杂的三维组织结构，特别是以受益于发育期间的相关移动的方式。这可以在发育期间协助包裹、成环、扭曲或网内其他期望的移动。图39图示了由捕获在网结构500中的细胞506组成的组织结构的实施方式，其中网结构500由于机械元件的存在而成环。相似地，图40图示了由捕获在网结构500中的细胞506组成的组织结构的实施方式，其中网结构500由于机械元件的存在而扭转。

在其他实施方式中，网通过保持紧密接近的细胞506连接或结合在一起。

图41A-图41B图示了被设计用于诱导位于两个单独的网结构中的两个单独的细胞组之间的细胞-细胞相互作用的实施方式。图41A图示了具有第一边缘900的第一网结构500a和具有第二边缘902的第二网结构500b，其中第一边缘900和第二边缘902紧密接近。第一网结构500a和第二网结构500b被打印成具有在第一边缘900边界的第一低密度区域562a和在第二边缘902边界的第二低密度区域562b。此外，第一网结构500a和第二网结构500b被打印成具有在第一低密度区域562a边界的第一高密度区域560a和在第二低密度区域562b边界的第二低密度区域562b。第一低密度区域562a和第二低密度区域562b的大小被设计用于捕获特定的细胞506。与第一低密度区域562a和第二低密度区域562b相邻的第一高密度区域560a和第二低密度区域562b的大小被设计用于排除细胞506。因此，细胞506沿着第一边缘900和第二边缘902保持，并且有利于彼此之间的细胞-细胞相互作用，如图41B所示。这将第一边缘900和第二边缘902结合在一起，从而连接或结合第一网结构500a和第二网结构500b。

在其他实施方式中，可以使用可变密度网生成细胞链，如图42A-图42B所示。例如，如图42A所示，在一些实施方式中，网结构500被打印成具有纵向区域，其中第一孔504的大小被设计用于捕获特定细胞506，而四周的第二孔504’的大小被设计用于排除细胞506。在这样的实施方式中，细胞506在纵向区域内保持紧密接近，并且有利于彼此之间的细胞-细胞相互作用，从而产生纵向的细胞链，如图42B所示。

可以理解，在一些实施方式中，网结构包括促进自组装的元件，或允许压缩而没有初级结构变形或其他力吸收的结构元件，拉伸元件，以限制、促进或允许细胞片、链、网络、群体或单个细胞移动通过允许细胞“挤压”和细胞质流动的结构。同样，一些网允许细胞响应于压力、张力或者压力、拉伸或组织张力的机械力的进行性或脉冲性局部转变而成形或分化。在一些情况下，发育组织内的移动、环境响应性和细胞-细胞接触对于功能性器官、组织和细胞发育至关重要。这些的非限制性实例包括：单个细胞-细胞相互作用，其可能是或可能不是较大网络的一部分。细胞在协调网络中的移动可以包括二维或三维的细胞片流动、折叠、包裹、变形或扭曲或者链形成、多层球体形成或对于功能性组织发育和形态发生所必需的连接。

可以打印含有结合的或分泌的信号传导分子、受体和/或刺激性或阻断性抗体的珠子，以促进定向或局部自组装。这样的信号传导分子的非限制性实例包括VEGF，以促进脉管生长和分支；VEGF-C，以促进淋巴脉管系统的生长和发育；GDNF，以促进神经发育或肾中的输尿管芽分支；或者SHH，以促进组织依赖性发育图式形成。这样的信号传导分子珠子还可以用于引导轴突寻路。在正常的神经发育中，发育中的轴突的生长锥响应于吸引性线索，其经由包含轴突的细胞骨架肌动蛋白的组装来促进轴突延伸；以及排斥性线索，其通过抑制肌动蛋白组装和/或促进肌动蛋白分解来防止轴突延伸。吸引性和排斥性线索对于正确寻路均至关重要。吸引性线索包括肝配蛋白B和导蛋白；排斥性线索包括肝配蛋白A、脑信号蛋白和Slit。在期望位置处的信号传导珠内打印吸引性和排斥性线索提供了促进和控制来自打印的神经祖细胞的轴突生长的机制。

打印介质和打印条件

如前所述，介质室122含有由细胞、可聚合材料和培养基组成的介质。可聚合材料包含生物相容的、可溶解的以及生物惰性的可聚合单体单元。单体单元响应于多光子激光激发120而聚合、交联或反应，从而产生特异于待生成的组织的含细胞的结构，诸如细胞基质和基底膜结构。介质室可以包含含有谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)的介质。

在一些实施方式中，介质包括包含光活化剂或无光活化剂的可聚合单元的溶液，例如粘度为至少约0.2mPa·s至约10Pa·s。溶液可以掺杂有具有或没有表达的化学或生物活性的另外的化学和/或生物组分，以改变溶液行为，使其为非牛顿性的。这样的行为在剪切稀化性质(其中介质在受到剪切力时变得粘性较小)或触变介质(其中介质在振动或摇动时变得粘性较小)的情况下特别有用；这样的介质可以在介质置换期间表现出改善的、更好的受控排出。可以添加到含细胞打印介质的这样的组分的非限制性实例包括细胞外基质蛋白混合物，其包含多种量的透明质酸、硫酸肝素、I型至X型胶原、弹性蛋白和纤维蛋白原。可以将另外的有机或非有机元件引入含细胞的打印介质，以诱导雪崩电离的速率增加。这些颗粒的非限制性实例包括无毒纳米颗粒，具有大量可自由获得的电子的元件物质如硒或锂适度增加。

在一些情况下，在打印过程期间可以使用特定条件，以使用网结构500及其中的组件的多光子打印促进多个细胞层的构建。这样的条件提供了减少的细胞呼吸、细胞圆化、迁移最小化、细胞损伤最小化等等。在一些情况下，可能期望细胞圆化和粘附减少，以将细胞捕获在网中并有效去除未捕获在网中的细胞。这可以通过将包含可聚合单元的打印介质或不包含另外的细胞或可聚合单体的介质的温度维持在例如约1℃至约36℃的范围内。该温度范围可能抑制细胞呼吸，可能鼓励细胞“圆化”，可能减少激光诱导的温度效应，并且可能使细胞迁移最小。温度可以通过主动或被动冷却机制进行控制。具体地，可以通过具有用于细胞打印的热交换平台或通过在冷却的环境温度如冷室中打印来冷却用于产生生物凝胶的介质或打印介质。

通常，用于多光子打印的红外光子可以是漫射的和/或可以由短的、密集的、在时间上不同的光子包组成。然而，这些光子包在焦点附近可能变得越来越密集，从而导致红外(IR)辐射的浓度局部增加。因此，打印过程可以将热量给予焦平面之外的四周的介质，这是与激光功率增加直接相关的增加的问题。因此，根据红外辐射的热量与多光子波长本身直接相关，或作为非辐射衰减的一部分(在光子发射之前受激发电子的能量损失)可给予可损坏细胞的大量热量。冷打印介质可能降低这种潜在热毒性。

在一些情况下，高度局部化增加的热量由于与焦点附近的高强度光子吸收相关的能量可能导致一些材料不期望的聚合或氧化。冷却的介质可以协助扩散通常的红外、焦点和近焦点的热量生成，从而降低对活细胞的潜在热毒性。除了降低来自红外辐射的热毒性外，冷却介质可以改善许多聚合材料的结构刚度，并可以增加打印介质的粘度，使得细胞保持不均匀分布。在低温下结构刚度的这种增加和灵活性的降低可以允许改善含细胞介质交换的速率，以进行另外的打印轮次，而不损坏沉积的结构。

在一些情况下，高度局部化增加的热量由于与焦点附近的高强度光子吸收相关的能量可能导致一些材料的聚合或氧化。在一些包含单体和细胞的打印材料的制剂中，高度局部化增加的热量可能是期望的，因为许多生物相容性单体可以聚合成链以产生细胞网。可以通过使用不同波长的辐射热发射来调谐该过程，并且单体的聚合可能仅对热辐射具有特异性。在一些制剂中，这可以通过使用在其他方面对光子吸收、光诱导的打印和/或光聚合无反应的热聚合化合物来实现。

通过添加螯合剂去除阳离子如钙和/或镁，可以减少细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的蛋白质-蛋白质相互作用，从而减少迁移，促进细胞圆化以及暂时减慢或加速细胞分化进展。因此，在一些情况下，打印生物凝胶和介质可以保持在例如至少约0至约1.8纳摩尔(nM)钙浓度的范围内。可以使用天然的较低钙浓度介质，或者可以将钙螯合剂的添加掺入到含细胞的打印介质的中。在一些情况下，可以添加用于降低阳离子的摩尔浓度的阳离子螯合剂包括但不限于钙、镁和/或钠。螯合剂的非限制性实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)和1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸(BAPTA)。在一些情况下，将天然存在的小分子和由细胞释放的化学物质添加到特定的打印介质制剂以促进减少细胞呼吸、促进细胞呼吸恢复或通过淬灭打印期间生成的自由基。非限制性实例包括硫化氢(H₂S)、硫氢化钠(NaHS)、一氧化二氮、谷胱甘肽、磷酸盐、β-甘油磷酸盐、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、碳基糖、微量营养物、混合的人血清蛋白和生长因子、代谢效应因子(胰岛素)、细胞因子、趋化因子以及与内部细胞途径如Rho/Rac途径、PI3激酶途径相互作用的化合物或者泛素酶抑制剂及其他替代物。一旦打印过程完成或部分完成，新打印的结构四周的介质就可以恢复到生理条件，以允许细胞恢复到正常的体内稳态功能和积极的运动性。

在一些情况下，可以将谷胱甘肽或其功能变体(或其衍生物)添加至打印介质的制剂(即，添加至介质)。谷胱甘肽(GSH)是活生物体中重要的抗氧化剂；其为促进细胞健康的自由基清除剂。谷胱甘肽可以预防由活性氧类引起的细胞损伤，该活性氧类诸如但不限于自由基、过氧化物、脂质过氧化物和/或重金属。谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)可用于制造过程和/或打印过程中。谷胱甘肽是可以用于包括细胞的制造过程和/或打印过程中的自由基抑制剂。谷胱甘肽或功能变体(或衍生物)可以用于使用细胞的制造过程和/或打印过程中。在一些情况下，谷胱甘肽或其功能变体(或其衍生物)可以淬灭由3D全息打印过程生成的自由基。谷胱甘肽或其功能变体(或其衍生物)可以通过淬灭自由基反应来抑制期望的打印区域之外的任何另外的聚合。本文提供的方法和系统可以使用谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)用于在3D全息打印过程期间控制聚合反应，以实现组织工程化所必需的超精细结构的打印。谷胱甘肽的功能变体和/或衍生物可以包括但不限于丙酮酸钠和L-谷氨酰胺。

介质还可以包含谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.1毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.01毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.05毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.5毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约1毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约5毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约10毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约20毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约30毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约40毫摩尔(mM)至约50mM或更多的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。

介质可以包含至少约0.01mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.02mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.03mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.04mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.05mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.06mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.07mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.08mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.09mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.1mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.2mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.3mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.4mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.5mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.6mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.7mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.8mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约0.9mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约1mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约2mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约3mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约4mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约5mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约6mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约7mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约8mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约9mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约10mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约15mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约20mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约25mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约30mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约35mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约40mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约45mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含约50mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)或更多。介质可以包含至少约75mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。介质可以包含至少约100mM的谷胱甘肽或其功能变体(或衍生物)。

总之，低钙和低温可能对细胞行为、代谢过程以及对其可能对多层组织打印至关重要的环境的生理反应具有重要影响。这些可能包括但不限于：i)细胞维持在较低钙(Ca²⁺)浓度和较冷介质中，呈圆形形状并收回突起；ii)细胞的较低钙(Ca²⁺)和较冷介质条件功能性地改变整联蛋白、黏蛋白(和功能性地改变的其他蛋白质)。较低Ca²⁺浓度可能改变物理蛋白质构象，使得细胞粘附如果不完全缺乏也会显著降低。另外，低温可能降低蛋白质-蛋白质相互作用的准确性。iii)较低Ca²⁺、较冷介质可能终止与外部细胞-细胞相互作用相关联的信号传导以及与环境反应和遗传变化相关联的固有细胞信号传导；以及iv)降低的细胞-细胞相互作用的倾向可能允许高密度的单细胞悬浮，伴有较低的或无细胞聚集体形成。细胞聚集体形成的减少或最小化对于受限结构内的均匀细胞分布和放置可能至关重要。

总之，这些条件可引起重要的生理变化，即圆化和减少的基质-细胞和细胞-细胞相互作用、减少的细胞呼吸以及通过CO₂缓冲作用对细胞呼吸功能的生化支持。可以通过将多种小分子或药剂添加至含细胞的打印介质来实现CO₂缓冲作用。

另外，pH的变化可以显著改变粘度、细胞存活或打印介质性质。因此，含细胞的介质、生物凝胶或打印材料的pH的改变或稳定可以受添加各种pH缓冲液的影响。在一些情况下，打印介质的pH可能对打印过程期间以及恢复期期间细胞的健康和功能至关重要。因此，在一些情况下，介质中可以包含协助控制细胞打印介质的pH的缓冲液。可以添加这样的pH缓冲液以减少与打印过程、细胞呼吸或可能添加至打印介质的其他组分有关的pH变化或波动。细胞相容性和打印相容性的pH缓冲液的非限制性实例包括：2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ADA)、2-(氨基甲酰基甲基氨基)乙磺酸(ACES)、1,3-双(三(羟甲基)甲氨基)丙烷(BIS-TRIS PROPANE)、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、2-羟基-3-吗啉-4-基丙烷-1-磺酸(MOPSO)、氯化胆胺、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、4-(N-吗啉代)丁烷磺酸(MOBS)、2-羟基-3-[三(羟甲基)甲氨基]-1-丙磺酸(TAPSO)、乙酰氨基甘氨酸、三-乙酸盐-乙二胺四乙酸(TAE)、哌嗪-1,4-双(2-羟丙磺酸)二水合物(POPSO)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(HEPPS)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(TRIZMA)、甘氨酰胺、甘氨酰甘氨酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)(HEPBS)、N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)、3-{[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基}丙烷-1-磺酸(TAPS)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液(AMPB)、2-(环己氨基)乙磺酸(CHES)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、3-(环己氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、3-(环己氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、4-(环己氨基)-1-丁磺酸(CABS)。

提供另外的方法以通过与多光子激发的三维投影有关的围绕细胞的基于光子的和热诱导的聚合过程来增强打印聚合物的过程。首先，生物相容性或生物惰性的电子给体可以增强电子级联现象，这可以增加基于多光子的聚合的速率。在一些情况下，可以通过使用生物凝胶或打印具有特定性质的含细胞的材料来利用该现象，该特定性质诸如具有接近能态的电子层以易于在基态与激发态之间进行跃迁。可以通过将其他元素至生物凝胶来充当系统中现成电子给体，从而增强电子级联起始的效应或可能性。

在一些情况下，用于生成电子级联事件的目的，可以通过掺杂细胞相容性电子供体作为活化剂来提高生物打印组织的速度，从而调谐光聚合的动态范围或选择进行光聚合的多光子波长。这些电子给体可以包括染料、纳米粒子或具有生物活性的电子给体，其包括但不限于离子如锂，硒、碘，或者较大的有机分子如烟酸和核黄素。掺杂生物凝胶还可以扩大基于光子的聚合的敏感性范围，使得可能由于从用作掺杂剂以诱导聚合的颗粒、分子或化合物的能量转移而发生聚合。在双光子聚合的情况下，也可以使用光子级联，其中可以选择掺杂颗粒基于朝向基态的随机和替代的路径释放不同波长的光的能力。

此外，在一些情况下，调谐用于聚合的动态范围可以允许仅通过改变激发的持续时间或激发的强度(两者均增加体素大小)来向细胞网添加附加的结构性质，其包括聚合物密度区域的相对增加或减少。可以通过仅在三维图像的某些部分或组分上投影或者间歇闪烁来实现在同一打印通道内密度或厚度的这种增加，使得结构中特定选择的斑点或区域经历延长的激光照射暴露时间，从而允许引入各种结构元件。

总之，这些特征可以允许延长的打印时间同时打印更大或更多的结构，悬浮液中更持久和更均匀的细胞分散和分布，同时对细胞的损害最小。此外，这些条件可以促进在多层打印过程期间更完全地去除未固定在细胞网中的细胞。总之，这些打印介质条件可以允许对细胞更受控的放置和提高的细胞存活率，并有利于在多轮含细胞结构沉积所需的延长的时间段内进行移除。

计算机控制系统

本发明提供了被编程用于实现本公开内容的方法的计算机控制系统。图43示出了计算机系统1101，其被编程或以其他方式配置用于：在计算机存储器中接收3D生物材料的计算机模型；在计算机存储器中生成3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示；以及引导至少一个能量源，以根据3D生物材料的计算机模型沿着至少一个能量束路径将能量束引导至介质室中的介质，并使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分。计算机系统1101可以调节本公开内容的计算机模型生成和设计、图像生成、全息投影和光调制的各个方面，诸如例如接收或生成待打印的期望三维(3D)生物材料结构的计算机辅助设计(CAD)模型。计算机系统1101可以将CAD模型或任何其他类型的计算机模型如点云模型或将基于线的模型转换为待打印的期望三维(3D)生物材料结构的图像。计算机系统1101可以全息地投影期望的三维(3D)生物材料结构的图像。计算机系统1101可以调制光源、能量源或能量束，使得由计算机系统1101产生光路或能量束路径。计算机系统1101可以沿着光路或能量束路径引导光源、能量源或能量束。计算机系统1101可以是用户的电子设备或者是相对于该电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。

计算机系统1101包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1105，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统1101还包括存储器或存储位置1110(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1115(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1120(例如，网络适配器)以及***设备1125，诸如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1110、存储单元1115、接口1120和***设备1125通过通信总线(实线)如主板与CPU 1105相通信。存储单元1115可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统1101可以借助于通信接口1120可操作地耦合至计算机网络(“网络”)1130。网络1130可以是因特网、互联网和/或外联网，或与因特网相通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络1130为电信和/或数据网络。网络1130可以包括一个或多个计算机服务器，该计算机服务器可以实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，网络1130可以借助于计算机系统1101实现对等网络，这可以使与计算机系统1101耦合的设备能够起到客户端或服务器的作用。

CPU 1105可以执行一系列机器可读指令，该机器可读指令可以体现在程序或软件中。该指令可以存储在存储位置如存储器1110中。指令可以针对CPU 1105，该指令随后可以编程或以其他方式配置CPU1105以实现本公开内容的方法。由CPU 1105执行的操作的实例可以包括提取、解码、执行和回写。

CPU 1105可以是电路如集成电路的一部分。系统1101的一个或多个其他组件可以包含在电路中。在一些情况下，该电路为专用集成电路(ASIC)。

存储单元1115可以存储文件，诸如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1115可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1101可以包括一个或多个附加数据存储单元，该附加数据存储单元位于计算机系统1101外部，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统1101相通信的远程服务器上。

计算机系统1101可以通过网络1130与一个或多个远程计算机系统相通信。例如，计算机系统1101可以与用户的远程计算机系统相通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板型PC(例如，iPad、GalaxyTab)、电话、智能电话(例如，iPhone、支持Android的设备、)基于云的计算服务(例如，Amazon Web Services)或个人数字助理。用户可以经由网络1130访问计算机系统1101。

如本文所述的方法可以通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现，该机器可执行代码存储在计算机系统1101的电子存储位置上，例如存储器1110或电子存储单元1115上。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，该代码可以由处理器1105执行。在一些情况下，可以从存储单元1115检索该代码并将其存储于存储器1110上以备处理器1105迅速存取。在一些情况下，可以排除电子存储单元1115，而将机器可执行指令存储于存储器1110上。

该代码可以被预编译并被配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或可以在运行期间被编译。该代码可以以编程语言提供，可以选择编程语言以使该代码能够以预编译或即时编译(as-compiled)的方式执行。

本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统1101，可以在编程中体现。本技术的各个方面可被认为是“产品”或“制品”，其一般为在一种类型的机器可读介质上携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据的形式。机器可执行代码可以存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘的电子存储单元上。“存储”型介质可以包括计算机的任何或全部有形存储器、处理器等，或其相关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。该软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。这样的通信，例如，可以使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路而使用的。携载这类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用的，除非限于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，诸如计算机可执行代码等机器可读介质可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如可以用于实现如附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴缆线；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些电信号或电磁信号或者声波或光波。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带至处理器以供执行。

计算机系统1101可以包括电子显示器1135或与之通信，电子显示器1135包含用户界面(UI)1140，其用于提供例如打印过程的状态(例如，在完成过程之前显示表示打印的3D组织部分的3D生物材料的图示)、能量束的手动控制(例如，控制能量束的开启/关闭状态的紧急停止按钮)和被设计用于例如远程显示介质室内的氧气、二氧化碳、湿度和温度测量的显示指示器。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。

实施例

实施例1-使用本文所述的方法和系统进行生物功能性主动脉瓣的全息打印

在实例中，患者表现出诸如呼吸短促、胸痛和心脏杂音等症状。医师诊断出该患者患有主动脉瓣狭窄，并推荐主动脉瓣置换手术。该患者经历主动脉瓣的计算机断层成像(CT)扫描。然后将主动脉瓣的CT扫描转换成计算机辅助设计(CAD)模型，该模型由本文公开的系统的计算机处理器接收。计算机处理器在计算机存储器中生成主动脉瓣CAD模型的点云表示。计算机处理器还将主动脉瓣的点云表示转换成诸如三维图像的图像。该系统还对三维图像进行解构和重构，并将其以全息方式投影到介质室中。介质室包括细胞，如成纤维细胞、支撑软骨的软骨细胞和部分分化的间充质干细胞；细胞培养基，如心肌细胞维持培养基；可聚合材料(例如，2mg/mL甲基丙烯酸胶原和50％w/v聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA))；以及光引发剂(例如，曙红Y)。随后，该系统根据患者主动脉瓣的点云表示沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室，以使可聚合材料形成3D的生物功能性主动脉瓣。3D打印的生物功能性主动脉瓣随后在组织培养基条件下生长，评估其功能和结构性质，并最终将其用于在主动脉瓣置换手术期间置换患者患病的主动脉瓣。

实施例2-脉管化的三维皮肤移植物的全息打印

在另一实例中，医师为患者治疗严重的皮肤病症或烧伤，并且需要置换组织。根据初始细胞数目的要求，医师从患者或该患者的遗传匹配者的健康皮肤部分获取约3mm至10cm的皮肤活检。该医师将皮肤活检发送给Prellis Biologics。Prellis Biologics使皮肤分离；即Prellis Biologics从皮肤生长并扩充几种不同的细胞类型，诸如但不限于角质形成细胞、成纤维细胞、上皮细胞和各种分化状态的干细胞，直至获得足够数目的细胞以打印新的脉管化皮肤。将脉管化皮肤的模型和分层打印的顺序加载到计算机系统中，该计算机系统控制将激光或能量束指导至发生新皮肤的3D打印的介质室的光学元件。确定待打印的细胞的顺序，例如，首先打印脉管细胞。使用本文所述的方法和系统打印较小血管。含细胞的介质包含内皮细胞，以及1mg/mL甲基丙烯酸胶原和50％w/v聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的混合物。含细胞的介质可以是生物墨水。一旦打印了脉管系统，就从含细胞的介质移除打印的结构并将其维持在生理条件下，直至脉管系统稳定。随后，通过流体流动测试来验证打印的脉管系统的稳定性，并将存在于皮肤层中的剩余细胞类型(诸如但不限于角质形成细胞、上皮细胞、干细胞和/或成纤维细胞)打印在现有的打印血管周围，以形成真皮层和表皮层。还使用本文所述的方法和系统打印剩余的细胞类型。使用包含上皮干细胞的含细胞介质将皮内结构(诸如但不限于毛囊和皮脂腺)打印在先前打印的三维结构周围；因此，形成打印的三维皮肤结构。然后将打印的三维皮肤结构返回到细胞培养系统提供的生理条件。经由将富含营养物的氧化介质和/或血液替代物泵送通过血管系统的多个内腔，为三维打印的皮肤结构提供其自身的灌注系统。通过偶然的活检来监测三维打印的皮肤结构的分化和生长，并且当达到足够的发育状态时，将三维打印的皮肤结构返回给医师以供移植。与其他解决方案相比，本文所述的脉管化的、三维的、打印的皮肤移植物具有许多优势，其包括但不限于组织存活的事实，以及血管与患者自身的循环系统的外科手术吻合或连接允许移植物的功能性掺入。

实施例3-三维的功能性打印的肾的全息打印

在另一实例中，表现出肾衰竭的患者每周经历三次透析，以去除来自血液的废物和多余液体。医师从该患者或匹配的健康供体肾脏获取肾活检，然后将肾活检提供给Prellis Biologics。Prellis Biologics在体外培养从肾活检提取的细胞并扩充成年型肾祖细胞群，其包括但不限于间充质干细胞和去分化的小管上皮细胞。使用激光引发的包含内皮细胞的含细胞的介质以及1mg/mL甲基丙烯酸胶原和50％w/v聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的混合物的聚合，从成年型肾脉管系统的CAD模型打印肾毛细血管系统。使用内皮细胞培养基将打印的脉管系统维持在生理条件下，直至证明功能性脉管系统。一旦证明了功能性脉管系统，就使用包含间充质干细胞、小管上皮细胞和光敏性细胞外基质(ECM)组分的含细胞介质，在脉管系统内部和周围打印肾单位的小管结构。ECM组件被打印到具有多个可灌注的开放内腔的3D曲小管结构中。间充质干细胞和小管上皮细胞在ECM支架周围形成汇合的上皮单层。与打印的小管的独特3D几何结构结合的形态发生素和生长因子的受控灌注引导分化为成熟的、极化的肾上皮细胞，从而形成功能性肾单位的各个组分。功能性打印的肾包含至少200,000个肾单位单元。在移植到患者体内之前对功能和组织活力进行测试。将三维的功能性打印肾返回给医师，以供移植到患者体内。

实施例4-细胞化的三维(3D)不可渗透微脉管系统结构的全息打印

在另一实例中，使用本文提供的3D打印方法和系统来打印细胞化的、3D的、不可渗透的微脉管系统结构，如图48A-图48E所示。图48A示出了在打印的初始步骤之一中的3D微脉管系统结构的俯视图。使用多光子能量束120将3D微脉管系统结构的全息图投影(以自上向下的方式)到介质中。介质包含细胞培养基、甲基丙烯酸胶原、PEGDA、曙红Y和细胞506。细胞506包括内皮细胞。3D微脉管系统结构的内管104具有约10微米(μm)的直径，并在3D打印过程的早期步骤中完成，如图48A所示。图48B示出了3D微脉管系统结构的外管102在其于过程后期开始形成时的俯视图。外管102具有约50μm的直径。完整的3D血管结构在原位聚合，从而在外管102内形成内管104，同时在其结构周围捕获细胞506，如图48C所示。全息打印的最终管长度的范围为约250至300μm长。图48D是包含内管104和外管102的三个微脉管系统结构的荧光图像。三个3D打印的微脉管系统结构示出被捕获微脉管系统结构内的荧光标记的细胞506。图48E示出了包含细胞506的三个3D打印的微脉管系统结构的明场像。在全息打印后的第5天将三个3D打印的微脉管系统结构置于生理细胞培养条件下，并打印在明场中成像。培养5天后的3D微脉管系统结构包含染料(图48E所示的较暗区域)，从而指示3D微脉管系统结构对小分子不可渗透并且整个细胞保留在打印的微脉管系统结构内部。

实施例5-使用全息打印生成含细胞的结构

在另一实例中，使用本文提供的3D打印方法和系统来打印含细胞的结构，如图49A-图49H所示。图49A示出了含细胞结构的计算机生成的三维(3D)图像。然后，对计算机处理器进行编程以生成图49B中所示的含细胞＝结构的3D图像的点云表示。计算机处理器还通过本文提供的算法进行编程，以将点云表示转换为图49C所示的全息图。点云表示和全息图用于生成用于打印包含3D细胞的结构的计算机指令打印；这些计算机指令被中继到图49D所示的计算机打印系统。将激光束引导至包含悬浮在液体打印介质126中的活细胞506的簇的介质室(图49中未示出)，打印介质126包含至少一种聚合物前体，如图49E所示。图49F示出了在三维打印点云表示之后相同的活细胞506的簇。在该实例中的打印场由用户集中在细胞簇上。图49G示出了显示打印的3D含细胞结构内的细胞506的切面图像。图49H示出了完整打印的3D含细胞结构的代表性图像。整个含细胞的结构在约7秒内被打印。

实施例6-3D“斯坦福兔子”的全息打印

在另一实例中，使用本文提供的3D打印方法和系统来打印三维(3D)“斯坦福兔子”结构，如图50A-图50C所示。“斯坦福兔子”是常见的计算机图形3D测试模型。图50A示出了“斯坦福兔子”的计算机生成的三维(3D)图像。图50B示出了“斯坦福兔子”的计算机生成的3D图像的俯视图。计算机处理器被编程以生成“斯坦福兔子”的3D图像的点云表示，并将该点云表示转换为全息图。激光束被引导到包含含有至少一种聚合物前体(图50中未示出)的液体打印介质的介质室中。图50C示出了如使用明场显微镜成像的“斯坦福兔子”的代表性3D打印。整个“斯坦福兔子”的3D结构在约60秒内被打印。

实施例7-作为双光子依赖性过程的全息打印的证明

在另一实例中，图51A-图51B示出了对应于两种不同制剂的全息打印的双光子激光束曝光时间(毫秒)—激光功率(瓦)的图表。双光子吸收是二阶过程，其中吸收相同或不同频率的两个光子以将分子从一种状态激发到更高的电子态。图51A-图51B证明了作为双光子依赖性过程的全息打印的过程；其中通过计算机处理器控制对打印样品的双光子激光曝光时间，该计算机处理器指示激光快门的快速打开和关闭以匹配打印的所述时间段和打印阈值。按照标准的双光子吸收过程，打印所需的曝光时间与固有的打印材料性质除以功率平方成正比。图51A示出了在制剂A中打印的阈值，制剂A包含至少约30％的PEG-DA、0.5％的曙红Y和1mg/mL的二丙烯酸胶原。如图51A的右图所示，对数刻度的原始数据点的外推拟合线性衰减。对数刻度图中所示的制剂A的线性衰减与二阶过程所期望的线性衰减模型相匹配。图51B示出了在制剂B中打印的阈值，制剂B包含至少约45％的PEG-DA、0.5％的曙红Y和1mg/mL的二丙烯酸胶原。如图51B的右图所示，对数刻度的制剂B的原始数据点的外推拟合线性衰减。对数刻度图中所示的制剂B的线性衰减对应于二阶过程所期望的线性衰减模型。

实施例8-使用全息打印的靶向单细胞封装

在另一实例中，使用本文提供的3D打印方法和系统来执行靶向单细胞封装，如图52A-图52C所示。图52A示出了悬浮在包含至少一种聚合物前体的打印介质中的多个封装的细胞和未封装的细胞。例如，图52A示出了第一封装细胞142a、第二封装细胞142b、第三封装细胞142c、第一未封装细胞144a、第二未封装细胞144b和第三未封装细胞144c。图52B示出了第一封装细胞142a、第二封装细胞142b和第三封装细胞142c的放大图像。这些细胞被使用本文提供的方法和系统全息打印的直径为约25微米(μm)的3D聚合物球体封装。图52C示出了第一未封装细胞144a、第二未封装细胞144b和第三未封装细胞144c的放大图像。未封装细胞不经历其周围的3D球体的全息打印。每个封装事件将3D全息图投影到单个细胞上(例如，投影到第一封装细胞142a上)至多约50毫秒(ms)。

实施例9-扩展的激光束投影全息图像

在另一实例中，图53示出了3D打印系统的代表性图像；特别地，示出了投影全息图像的扩展激光束。图53示出了作为扩展激光束被投影的具有1035nm的波长(即，远红光谱中的波长)的激光束，该扩展激光束以全息形式被图案化到打印头的后孔上。在该实施方式中，打印头是标准生理级显微镜物镜。当红外检测激光卡运行贯穿光路以照亮可见范围内的光路时，使用长曝光获取图53中所示的图像。

实施例10-多种激光打印模式

在另一实例中，图54A-图54D图示了基于单光子和多光子打印过程的光学器件的不同激光打印模式以及预期的结构结果。图54A图示了单光子激光束投影到包含光敏打印介质的介质室中。图54A示出了单光子激光束投影，未掩盖或隔离预期的聚焦平面，可以预期这会留下整个光锥形状的打印结构。图54B示出了多光子吸收过程，其中光子密度仅在聚焦点处足够高，从而在包含光敏打印介质的介质室中仅留下精确结构。图54C示出了产生全息图的波前整形的代表性图形，该波前整形中多光子吸收过程在x、y和z平面中的多个焦点处发生。在该实施方式中，可以使用完整结构的3D投影全息图部分之间的快速切换来构建完整结构。图54D图示了在多个平面上的完整图像投影(即，3D全息图)，其允许全息打印复杂结构。作为实例，图54D所示的复杂结构是具有内管和外管的微脉管系统结构。

实施例11-先前打印的3D微脉管系统结构内球体的全息打印

在另一实例中，使用本文提供的3D打印方法和系统来打印先前打印的3D微脉管系统结构内的球体，如图55A-图55F所示。图55A图示了包括中空管结构的打印的微脉管系统结构，并且对应于图55B所示的图像。图55B示出了在打印球体之前打印的微脉管系统结构的图像。如图55C-图55D所示，使用具有近红外波长的多光子能量束120将球体的全息图投影到微脉管系统结构的中空管的中心。将微脉管系统结构悬浮在包含甲基丙烯酸胶原、PEGDA和曙红Y的介质中。图55F示出了将球体(由虚线圆表示)沉积在微脉管系统结构的内腔中而不破坏它。图55E图示了图55F所示的图像。该球体至多在约5毫秒(ms)内被全息打印。

实施例12-3D微脉管系统床的全息打印

图56A-图56B示出了使用本文提供的方法和系统打印的聚合物微脉管系统床的图像。图56A示出了在全息打印期间的脉管系统床的图像。照亮区域对应于将3D微脉管系统床的全息图投影到介质上的多光子激光束。介质包含聚合物前体和光引发剂。图56B示出了全息打印过程完成后的3D微脉管系统床的明场图像。

尽管本文已经示出并描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员容易理解的是，这样的实施方式仅以示例的方式提供。并非旨在通过说明书中提供的具体实例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但对本文实施方式的描述和说明并不意味着以限制性的意义来解释。本领域技术人员在不偏离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于多个条件和变量。应当理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代方案均可用于实践本发明。因此，可以设想，本发明还应当涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同项。旨在以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。