阅读说明：本技术 一种慢性心衰急性加重型动物模型的制备方法 (Preparation method of acute aggravated animal model for chronic heart failure ) 是由 王维亭 郝春华 张珊 孙双勇 张蕊 徐向伟 赵专友 汤立达 于 2018-06-19 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,具体涉及一种慢性心衰急性加重型模型的制备方法。本发明构建的慢性心衰急性加重型模型,根据临床病因、诱因双重因素构建,一方面具备慢性心衰的病理疾病基础心肌梗死的病因,另一方面具备病因基础上体液负荷的诱因。该模型制备成功后,表现出心衰加重的两大特征,即在收缩功能已经减弱基础上的进一步下降、与临床症状相似的呼吸功能指标改变。该模型可用于新药有效性及新药作用机理等研究。(The invention belongs to the field of medicines, and particularly relates to a preparation method of an acute aggravation model of chronic heart failure. The acute aggravation model of the chronic heart failure is constructed according to dual factors of clinical etiology and inducement, so that the acute aggravation model of the chronic heart failure has the etiology of myocardial infarction based on pathological diseases of the chronic heart failure on one hand, and has the inducement of body fluid load based on the etiology on the other hand. After the model is successfully prepared, the model shows two characteristics of aggravation of heart failure, namely further decline on the basis of weakened contraction function and change of respiratory function indexes similar to clinical symptoms. The model can be used for the research on the effectiveness and the action mechanism of a new medicine and the like.)

一种慢性心衰急性加重型动物模型的制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种慢性心衰急性加重型动物模型的制备方法。

背景技术

急性心力衰竭(acute heart failure，AHF)是指继发于心脏功能异常而迅速发生或恶化的症状与体征，AHF包括新发AHF与慢性心衰急性失代偿或急性加重型(ADHF或AEHF)两种类型，其中AEHF更为多见，约占AHF的70%～80%。AHF预后很差，住院病死率为3%，6个月的再住院率约50%，5年病死率高达60%。AEHF本身具有心脏结构或功能损伤等疾病病因、病理生理基础，诱因包括感染、心律失常、高血压、不恰当地调整或停止药物(治疗依从性差)、钠盐过量摄入，过多或过快输注液体等等。根据临床病因、诱因，以及病理生理特征构建疾病动物模型，是药理、药效学科进行新药研发的重要手段与基础。

新发AHF的动物模型构建方法主要采用药物中毒诱发，包括维拉帕米法、***、戊巴比妥钠、普罗帕酮、阿霉素法、乙醇、丙咪嗪等等。也有研究者采用冠脉结扎、冠状动脉球囊堵塞导致急性心肌坏死和损伤方法。这些方法一般不具备AEHF长期、终末疾病的病理基础，不能作为AEHF模型来进行研究。采用阿霉素与脂多糖可诱发小鼠AEHF，但未见AEHF的体征、症状与血流动力学、呼吸困难相关性指标的研究。

段伟采用尾静脉注射阿霉素，每周每次5 mg/kg，连续6周，累积总剂量30 mg/kg，7周后尾静脉注射细菌脂多糖5 mg/kg，可建立ADHF动物模型。该ADHF模型小鼠死亡率增加，心肌细胞受损明显、间质水肿、炎性细胞侵润明显增多，与慢性心力衰竭组比较，脑钠肽、白细胞介素6、Bax蛋白的表达均明显增高，证实细菌脂多糖注射后炎性细胞因子明显增多，心肌细胞凋亡明显增多，心功能急性下降。该模型的特点是心肌毒性损伤病变为病因，感染为诱因。缺点是阿霉素毒性广泛，不仅具有心脏毒性，还具有骨髓抑制，肝脏毒性、胃肠道、皮肤等营养代谢系统损伤，与很多临床病人的基础病变特征有一些差异。

本模型基于临床病因、诱因双重因素构建，一方面具备慢性心衰的病理疾病基础心肌梗死的病因，另一方面具备病因基础上体液负荷的诱因，可弥补现有模型的不足。

发明内容

有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种新的慢性心衰急性加重型动物模型的制备方法。 本发明所述制备方法制备的慢性心衰急性加重型模型，具备临床病因、诱因双重因素，一方面具备慢性心衰的病理疾病基础心肌梗死的病因，另一方面具备病因基础上体液负荷的诱因。该模型表现出心衰加重的两大特征，即在收缩功能已经减弱基础上的进一步下降、与临床症状相似的呼吸功能指标改变。

为实现本发明的目的， 本发明采用如下技术方案 ：

SD大鼠麻醉后，以Vevo 770^TM-120 多普勒超声仪17.5 MHz探头测量超声心动图，在左室短轴解剖位获取M模式图像并储存，通过离线工作站软件测定术前缩短分数(FS)。

大鼠胸部前外侧手术野常规消毒。平行胸骨方向，切开皮肤与肌层，环肌层行荷包缝合，切断左侧第四肋，以止血钳扩开胸腔，用环形钩将心脏拉出。在左心耳下方3～4 mm处冠脉前降支位置，以6/0无损伤丝线穿线，结扎冠状动脉前降支。将心脏放回胸腔，抽出胸腔内空气，关闭胸腔。假手术组（Normal）动物仅在相应冠脉位置穿线，不进行结扎,其它手术过程与结扎动物相同。

8周后，测定术后FS，选取FS较术前下降50%以上的大鼠，按FS心衰程度随机分为3组，每组10只。

采用生理盐水（NS）作为容量负荷方式，按容量负荷程度分为轻度（1 ml/kg，即HF+轻度组）、中度（2 ml/kg，即HF+中度组）、重度（3 ml/kg，即HF+重度组）三种负荷模式，输注速度1 ml/min。Normal组采用生理盐水负荷模式与重度负荷模式相同。

生理盐水负荷后，采用SPR-320NR(2F)Millar压力导管，经右侧颈动脉，逆向插管至左心室测定左室舒张末期压(LVEDP)、左室压最大上升速率(+LVdp/dtmax)、左室压最大下降速率(-LVdp/dtmax)、左室舒张末期压(LVEDP)。采用液体压力传感换能器，右侧颈外静脉插管法，测定中心静脉压（CVP）。采用呼吸压力换能器，固定于前胸，通过呼吸波测定呼吸频率（R）。由ECG II导联测定心率（HR），各种信号以MP150多导生理信号系统采集记录。模型制备成功。

目前用于制备慢性心衰急性加重型动物模型的动物主要为SD大鼠。 其中， 在一些实施方案中， 本发明所述的SD大鼠可以为其他种属大鼠、犬、猫、猪、兔、豚鼠动物所代替。

目前用于制备慢性心衰急性加重型动物模型的病因主要为冠脉前降支结扎导致的心肌梗死。 其中， 在一些实施方案中， 本发明所述病因可以为其他如冠状动脉粥样硬化、冠脉血栓形成、化学法冠脉损伤、药物及毒物诱发的病因所代替。

目前用于制备慢性心衰急性加重型动物模型的诱因主要为生理盐水（NS）负荷。其中， 在一些实施方案中， 本发明所述诱因可以为其他如血浆、高分子右旋糖酐等液体，以及活动增加、耗氧增加、缺氧、升压药物、心率影响药物所代替。

本发明的有益效果是，构建的慢性心衰急性加重型模型，根据临床病因、诱因双重因素构建，一方面具备慢性心衰的病理疾病基础心肌梗死的病因，另一方面具备病因基础上体液负荷的诱因。该模型制备成功后，表现出心衰加重的两大特征，即在收缩功能已经减弱基础上的进一步下降、与临床症状相似的呼吸功能指标改变。该模型可用于新药有效性及新药作用机理等研究。

附图说明

图1示例实施例容量负荷后心脏收缩功能+LVdp/dt _max变化，n=10，与Normal组比较，^*P<0.05,^**P<0.01.横坐标为负荷后60min时间段，纵坐标为+LVdp/dt _max变化百分数。○为normal，□为HF+轻度，●为HF+中度，△为HF+重度。

图2示例实施例容量负荷后心脏收缩功能-LVdp/dt _max变化，n=10，与Normal组比较，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001. 横坐标为负荷后60min时间段，纵坐标为-LVdp/dt _max变化百分数。○为normal，□为HF+轻度，●为HF+中度，△为HF+重度。

图3示例实施例容量负荷后R频率变化，n=10，与Normal组比较，^*P<0.05,^**P<0.01.横坐标为负荷后60min时间段，纵坐标为R频率变化百分数。○为normal，□为HF+轻度，●为HF+中度，△为HF+重度。

图4示例实施例容量负荷后HR变化，n=10，与Normal组比较，^*P<0.05,^**P<0.01. 横坐标为负荷后60min时间段，纵坐标为HR变化百分数。○为normal，□为HF+轻度，●为HF+中度，△为HF+重度。

图5示例实施例容量负荷后CVP变化，n=10，与Normal组比较，^*P<0.05,^**P<0.01.横坐标为负荷后60min时间段，纵坐标为CVP变化百分数。○为normal，□为HF+轻度，●为HF+中度，△为HF+重度。

图6示例实施例容量负荷后LVEDP变化，n=10，与Normal组比较，^*P<0.05,^**P<0.01.横坐标为负荷后60min时间段，纵坐标为LVEDP变化百分数。○为normal，□为HF+轻度，●为HF+中度，△为HF+重度。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例仅为解释性的，绝不意味以任何方式限制本发明的范围。

下面将结合本发明实施例， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 如无特别说明， 本发明所使用的实验材料均为市售产品， 可通过商业渠道购买得到。

实施例 1

慢性心衰急性加重型动物模型的制备

1 材料

1.1 实验动物

SD大鼠，SPF级，雄性，287.9±13.1（270～310） g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(京)2016-0011。

1.2仪器

Vevo 770^TM-120 多普勒超声仪，Visual Sonics公司产品。SPR-320NR(2F)Millar压力导管，美国Millar产品。MP150多导生理信号采集系统，美国Biopac system Inc产品。Pump11 Pico Plus Elite输注泵，Harvard Apparatus产品。

2 方法

2.1 模型制备

大鼠，经腹腔注射3%戊巴比妥钠60 mg/kg麻醉后，胸部前外侧手术野区域，经脱毛膏脱毛，以多普勒超声仪测定术前左室缩短分数(FS)。

胸部前外侧手术野常规消毒。平行胸骨方向，切开皮肤与肌层，环肌层行荷包缝合，切断左侧第四肋，以止血钳扩开胸腔，用环形钩将心脏拉出。在左心耳下方3～4 mm 处冠脉前降支位置，以6/0无损伤丝线穿线，结扎冠状动脉前降支。将心脏放回胸腔，抽出胸腔内空气，关闭胸腔。假手术组（Normal）动物仅在相应冠脉位置穿线，不进行结扎,其它手术过程与结扎动物相同。逐层缝合，回笼饲养。冠脉结扎8周后，以多普勒超声仪测定造型后左室缩短分数(FS)。选取与术前比较FS下降50%以上动物用于实验。

2.2 动物分组与容量负荷干预

慢性心衰形成后，按FS程度随机分为3组，每组10只。采用生理盐水作为容量负荷方式，按容量负荷程度分为轻度（1 ml/kg，即HF+轻度组）、中度（2 ml/kg，即HF+中度组）、重度（3ml/kg，即HF+重度组）三种负荷模式，输注速度1 ml/min。Normal组采用生理盐水方式与重度负荷模式相同。

2.3 多普勒超声仪FS测定

以Vevo 770^TM-120 多普勒超声仪17.5 MHz探头测量超声心动图，在左室短轴解剖位获取M模式图像并储存，通过离线工作站软件测定缩短分数(FS)。

2.4左室压最大上升/下降速率（±LVdp/dt _max)测定

采用SPR-320NR(2F)Millar压力导管，经右侧颈动脉，逆向插管至左心室测定左室舒张末期压(LVEDP)、左室压最大上升速率(+LVdp/dt _max)、左室压最大下降速率(-LVdp/dt _max)。

2.5左室舒张末期压(LVEDP)测定

采用SPR-320NR(2F)Millar压力导管，经右侧颈动脉，逆向插管至左心室，测定左室舒张末期压(LVEDP)。

2.6 中心静脉压（CVP）测定

采用液体压力传感换能器，右侧颈外静脉插管法，测定中心静脉压（CVP）。

2.7呼吸频率（R）测定

采用呼吸压力换能器，固定于前胸，通过呼吸波测定呼吸频率（R）。

2.8心率（HR）测定

由ECG II导联测定。

±LVdp/dt _max、CVP、R、HR测定信号以MP150多导生理信号系统采集记录，通过AcqKnowledge v.3.9.1软件进行数据测量。

2.9统计学处理

所有数据均以均数±标准差(±s)表示，组间差异性采用单因素方差分析，正态性、方差齐性资料采用单因素方差分析组间差异性，两组间比较采用LSD法；非正态、方差不齐资料采用Kruskalwallis非参数检验；率的比较采用等级资料的卡方检验。P<0.05 表示组间差异具有统计学意义。

3. 实验结果

3.1 ±LVdp/dt _max变化

假手术组（Normal）心脏收缩功能+LVdp/dt _max未出现恶化，且出现一过性增加现象，平均最高增加可达4.5%。心衰大鼠给予不同容量负荷，+LVdp/dt _max出现不同程度降低，轻、中、重负荷心脏收缩功能恶化百分率分别可达40%、80%、100%；随负荷程度加重，心功能降低加重分级更加明显。轻度负荷+LVdp/dt _max平均最高降低出现在20min，幅度可达9.7%，而中、重负荷出现在5～10min，幅度分别可达24.8%、30.8%。结果见表1，图1.。

表1 心脏收缩功能（+LVdp/dt _max）降低加重分级变化

与Normal组比较，^*P<0.05,^***P<0.001.

Normal组心脏舒张心功能（-LVdp/dt _max）未出现恶化，且出现一过性增加现象，平均最高增加可达7.6%。心衰大鼠给予不同容量负荷，可使心脏-LVdp/dt _max出现不同程度降低，轻、中、重负荷心脏舒张功能恶化百分率分别可达40%、90%、100%。轻度负荷-LVdp/dt _max平均最高降低出现在20min，幅度可达5.5%，而中、重度负荷出现在10～15min，幅度分别可达18.1%、23.1%。结果见图2.。

3.2 R频率变化

Normal大鼠给予负荷后呼吸频率缓慢增加，HF大鼠给予负荷后，随着负荷加重，呼吸频率减低百分率逐渐增多，重度负荷可达到100%。轻度负荷变化轻微，中、重度负荷呼吸频率10～20min降至最低，最大可分别降低20.0%、22.8%。结果见表2，图3.。

表2 呼吸（R）频率变化

注：与Normal组比较，^**P<0.01,^***P<0.001.

3.3 HR变化

Normal大鼠组HR稍有升高，升高最大幅度为8.1%。与Normal大鼠组比较，心衰大鼠给予不同容量负荷后，HR显著降低，轻、中、重度负荷，降低幅度最大可达3.5%,7.5%,8.4%，其中中、重度负荷组5-45min差异性显著。结果见图4.。

3.4中心静脉压（CVP）变化

Normal大鼠组CVP一过性升高，升高幅度小于10%，5min内达峰值，15min内基本恢复至初始水平。与Normal大鼠组比较，心衰大鼠给予不同容量负荷后，CVP显著升高，轻、中、重度负荷，升高幅度最大可达23.7%,31.1%,51.5%，其中中、重度负荷组5～15min差异性显著。结果见图5.。

3.5 左室舒张末期压（LVEDP）变化

Normal大鼠组LVEDP一过性升高，然后有降低趋势，变化幅度小于1.0 mmHg。与Normal大鼠组比较，心衰大鼠给予不同容量负荷后，LVEDP显著升高，轻、中、重度负荷，升高幅度最大可达2.5 mmHg,5.7 mmHg,10.3 mmHg，其中中、重度负荷组5～20 min差异性显著。在中/重度负荷下，峰值出现在5min。结果见图6.。