阅读说明：本技术 一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品及制备方法 (Sterile instant undenatured natural collagen freeze-dried product and preparation method thereof ) 是由 鲍柳君 张灿 镇晓华 孙秀娟 于 2019-08-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品及其制备方法,制备方法步骤包括：(1)调制一定浓度的活性胶原原液,边搅拌边加入阻断剂,搅拌时间为0.5～2小时,反应温度为10～20℃,然后加入速溶剂,搅拌时间为0.5～2小时,反应温度为10～20℃,控制反应pH＝5～7；(2)反应结束后,进行灌装、冻干得速溶未变性天然胶原冻干品。本发明的胶原冻干品保留了天然未变性胶原的结构特性,未经酰化处理即能速溶于水(1～2min)；该胶原冻干品未添加增稠剂,用水溶解后即有稠的肤感,产品更安全；该胶原冻干品采用低剂量电子束辐照灭菌工艺进行终端灭菌,为无菌产品,灭菌后仍然保持胶原的天然活性。(The invention provides a sterile instant undenatured natural collagen freeze-dried product and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: (1) preparing an active collagen stock solution with a certain concentration, adding a blocking agent while stirring, wherein the stirring time is 0.5-2 hours, the reaction temperature is 10-20 ℃, then adding a quick-dissolving agent, the stirring time is 0.5-2 hours, the reaction temperature is 10-20 ℃, and controlling the reaction pH to be 5-7; (2) after the reaction is finished, filling and freeze-drying are carried out to obtain the instant undenatured natural collagen freeze-dried product. The freeze-dried collagen product disclosed by the invention keeps the structural characteristics of natural undenatured collagen, and can be quickly dissolved in water (1-2min) without acylation treatment; the freeze-dried collagen product is not added with a thickening agent, and has thick skin feel after being dissolved by water, so that the product is safer; the freeze-dried collagen product is sterilized by a low-dose electron beam irradiation sterilization process, is an aseptic product, and still maintains the natural activity of collagen after sterilization.)

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品及制备方法

技术领域

本发明涉及一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品及制备方法。

背景技术

胶原蛋白或称胶原，广泛分布于各类动物体内，是动物体主要的结构蛋白，约占体内总蛋白的30％。目前在脊椎动物体内已发现有28种胶原，其中I型胶原的含量最丰富，约占动物体内胶原总量的90％。胶原蛋白广泛存在于猪、牛、羊等哺乳动物的皮、骨、肌腱等***，为其大规模应用提供了可能。胶原独特的三股螺旋结构赋予其许多优异的性能，如具有较好的机械力学性能、低抗原性和良好的生物相容性，有利于细胞的存活和生长，还具有保湿性能和明显促进表皮细胞生长繁殖的优异性能。因而天然胶原作为一种优良的生物材料的原料可被广泛应用于组织工程、生物医药、整形和护肤等领域。

目前未变性天然胶原的获取主要有酸溶法和酸溶酶解法。用这两种方法提取的胶原是酸溶性胶原，且只有在酸性条件下才能稳定存在。如果将这种胶原冷冻干燥成固体物，也只能复溶于酸性溶液中，而且溶解时间很长，不能用作化妆品原料。

专利号为200410040487.2的中国专利文献，公开了将酸溶性胶原进行酰化反应，经过洗涤沉淀，冷冻干燥得到了水溶性未变性天然胶原。公开号CN105078783A的中国专利文献公开了利用乙酰化的胶原制备得到了速溶性胶原冻干球。以上文献所公开的方案均需要对胶原进行酰化反应，虽然没有改变胶原的天然结构，但是改变了胶原单链的分子组成，因此，酰化反应后的胶原结构稳定性降低，其冻干品在水溶液中能快速溶解。

胶原在溶液环境下，容易滋生细菌，必须加入防腐剂进行长期保存。但是，已有结果显示，防腐剂可引起皮肤异常增生、癌变；在日光的照射下相关成分发生化学变化，使人产生光敏感，皮肤发红、变黑、疼痛；引起人过敏，出现红、氧的症状；或是引起皮肤的烧伤。

在胶原复配的产品中，加入其他活性成分，如果是在溶液环境中长期保存，活性成分的效价有可能降低甚至消失，产品的有效性不能保证。

解决上述问题，可以将胶原产品进行冷冻干燥保存。但是随之产生两个问题，一是酸溶性胶原如果不发生酰化反应，溶于水是一个缓慢的过程，等待时间长(一般需12小时左右)，且pH值过低影响其使用。二是冷冻干燥后胶原产品含水量仍维持10％～20％。因为生产过程不是无菌，随着长时间保存，有滋生细菌、霉菌的风险。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法，既能获得天然未变性胶原冻干品，又能使该冻干品非常容易复溶，且能直接在饮用水环境中复溶，方便使用。为此，本发明采用以下技术方案：

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)调制一定浓度的活性胶原原液，边搅拌边加入阻断剂，搅拌时间为0.5～2小时，反应温度为10～20℃，然后加入速溶剂，搅拌时间为0.5～2小时，反应温度为10～20℃，控制反应pH＝5-7；

(2)反应结束后，进行灌装、冻干得速溶未变性天然胶原冻干品

在上述技术方案的基础上，所述速溶未变性胶原冻干品再进行电子束灭菌辐照，剂量为6kGy～10kGy，即得无菌速溶未变性天然胶原冻干品。低剂量不会使胶原变性或交联，但可使产品达到无菌级别，更安全。

进一步地，活性胶原原液与阻断剂的质量比例为25％～30％：25％～30％，所述速溶剂的加入量与活性胶原原液的质量比例为25％～30％：25％～30％。

所述阻断剂为糖醇类化合物。所述糖醇类化合物的选择范围包括山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇。这些糖醇类化合物具有分子量小且带有羟基的特点。

所述速溶剂选择范围包括氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、柠檬酸钠、碳酸钠。低浓度的盐溶液有助于胶原的溶解。

进一步地，在步骤(1)中，可以根据不同的产品功效，加入相应的生物活性物质。

进一步地，在灌装和冻干时，可以根据不同得要求而冻成贴剂、球状、柱状、心形等。

本发明还提了一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品，它采用上述方法制备。

本发明采用的胶原为天然未变性胶原，冻干品中的胶原未经酰化反应，保证了天然胶原最原始的三螺旋结构，且胶原的单链成分不发生改变。天然胶原具有三股螺旋结构，分子量为300kDa，是一种棒状生物大分子，能够在溶液中发生自组装形成微纤维，然后成聚集态结构，直接冻干会形成海绵样多孔网状结构。本发明加入分子量较小的含羟基糖醇类化合物作为阻断剂，会阻断天然胶原分子的自组装行为，改变天然胶原冻干后的结构，更有利于吸水。

糖醇现在已成为国际食品和卫生组织批准的无须限量使用的食品，因此是一种非常安全的成分，且糖醇类化合物可以作为保湿剂使用。酰化反应后的胶原结构稳定性降低，冻干后的产品形态不丰满，需联合加入其他成分如甘露糖醇(30-56％)、海藻糖(10-15％)等作为填充剂，使冻干球变成绒球。相同浓度条件下，与天然未变性胶原相比，酰化反应后的胶原在溶解后的粘度降低，因此需加入增稠剂如普鲁兰多糖(10-15％)增加终产品的粘度。

本发明中，因为天然未变性胶原本身即可形成海绵状结构，只需加入一定量的阻断剂即可达到阻断胶原分子的自组装行为的目的，且不需要添加填充剂和增稠剂即可达到产品溶解时的饱满状态。

本发明中胶原冻干产品用饮用水即可溶解，可直接与人体组织接触。

综上，本发明建立了一种无菌速溶未变性天然胶原冻干产品及其制备方法。该胶原冻干品保留了天然未变性胶原的结构特性，而且未经酰化处理，该胶原冻干品采用低剂量电子束辐照灭菌工艺进行终端灭菌，能速溶于水(1-2min)，保持胶原不变性的天然活性，无需添加增稠剂即可使用，产品更安全，且为无菌产品。

附图说明

图1为实施例1-6电泳结果图。

图2实施例7-8电泳结果图。

具体实施方式

实施例1：

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法如下：

1.调制质量百分比0.1％浓度的活性胶原原液100g，边搅拌边加入甘露糖醇0.1g，搅拌时间为1小时，反应温度为10℃，然后加入磷酸氢二钠0.1g，搅拌时间为0.5小时，反应温度为10℃。控制反应pH为5.0左右。

2.停止搅拌，取样，测试pH值，进行微生物检测，合格后进行灌装至球形模具、冻干即得速溶未变性天然胶原冻干球。

3.将冻干球进行电子束灭菌辐照，剂量为6kGy。即得无菌速溶未变性天然胶原冻干品。

实施例2：

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法如下：

1.调制质量百分比0.2％浓度的活性胶原原液100g，边搅拌边加入甘露糖醇0.2g，搅拌时间为1.5小时，反应温度为15℃，然后加入磷酸氢二钠0.2g，搅拌时间为1小时，反应温度为15℃。控制反应pH为6.0左右。

2.停止搅拌，取样，测试pH值，进行微生物检测，合格后进行灌装至球形模具、冻干即得速溶未变性天然胶原冻干球。

3.将冻干球进行电子束灭菌辐照，剂量为8kGy。即得无菌速溶未变性天然胶原冻干品。

实施例3：

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法如下：

1.调制质量百分比0.3％浓度的活性胶原原液100g，边搅拌边加入甘露糖醇0.3g，搅拌时间为2小时，反应温度为20℃，然后加入磷酸氢二钠0.3g，搅拌时间为2小时，反应温度为20℃。控制反应pH为7左右。

2.停止搅拌，取样，测试pH值，进行微生物检测，合格后进行灌装至球形模具、冻干即得速溶未变性天然胶原冻干球。

3.将冻干球进行电子束灭菌辐照，剂量为10kGy。即得无菌速溶未变性天然胶原冻干品。

实施例4：

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法如下：

1.调制质量百分比0.2％浓度的活性胶原原液100g，边搅拌边加入山梨糖醇0.2g，搅拌时间为1.5小时，反应温度为15℃，然后加入磷酸氢二钠0.2g，搅拌时间为1小时，反应温度为15℃。控制反应pH为6.0左右。

2.停止搅拌，取样，测试pH值，进行微生物检测，合格后进行灌装至球形模具、冻干即得速溶未变性天然胶原冻干球。

3.将冻干球进行电子束灭菌辐照，剂量为8kGy。即得无菌速溶未变性天然胶原冻干品。

实施例5：

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法如下：

1.调制质量百分比0.2％浓度的活性胶原原液100g，边搅拌边加入山梨糖醇0.2g，搅拌时间为1.5小时，反应温度为15℃，然后加入磷酸氢二钠0.2g，搅拌时间为1小时，反应温度为15℃。控制反应pH为6.0左右。

2.停止搅拌，取样，测试pH值，进行微生物检测，合格后进行灌装至球形模具、冻干即得速溶未变性天然胶原冻干球。

3.将冻干球进行电子束灭菌辐照，剂量为8kGy。即得无菌速溶未变性天然胶原冻干品。

实施例6：

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法如下：

1.调制质量百分比0.2％浓度的活性胶原原液100g，边搅拌边加入山梨糖醇0.2g，搅拌时间为1.5小时，反应温度为15℃，然后加入氯化钠0.2g，搅拌时间为1小时，反应温度为15℃。控制反应pH为6.0左右。

2.停止搅拌，取样，测试pH值，进行微生物检测，合格后进行灌装至球形模具、冻干即得速溶未变性天然胶原冻干球。

3.将冻干球进行电子束灭菌辐照，剂量为8kGy。即得无菌速溶未变性天然胶原冻干品。

实施例7：

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法如下：

1.调制质量百分比0.2％浓度的活性胶原原液100g，边搅拌边加入麦芽糖醇0.2g，搅拌时间为1.5小时，反应温度为15℃，然后加入柠檬酸钠0.2g，搅拌时间为1小时，反应温度为15℃。控制反应pH为6.0左右。

2.停止搅拌，取样，测试pH值，进行微生物检测，合格后进行灌装至球形模具、冻干即得速溶未变性天然胶原冻干球。

3.将冻干球进行电子束灭菌辐照，剂量为8kGy。即得无菌速溶未变性天然胶原冻干品。

实施例8：

一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品的制备方法如下：

1.调制质量百分比0.2％浓度的活性胶原原液100g，边搅拌边加入赤藓糖醇0.2g，搅拌时间为1.5小时，反应温度为15℃，然后加入碳酸钠0.2g，搅拌时间为1小时，反应温度为15℃。控制反应pH为6.0左右。

2.停止搅拌，取样，测试pH值，进行微生物检测，合格后进行灌装至球形模具、冻干即得速溶未变性天然胶原冻干球。

3.将冻干球进行电子束灭菌辐照，剂量为8kGy。即得无菌速溶未变性天然胶原冻干品。

对实施例制备的无菌速溶未变性天然胶原冻干品进行以下试验：

(1)溶解效果测试

将上述实施例制备的冻干球放于手心，加入1ml纯化水，开始计时，冻干球完全溶解所需时间见表1。

表1.溶解时间

实施例	1	2	3	4	5	6	7	8
									溶解时间(s)	50	42	65	45	52	45	40	72

(2)将上述实施例制备的冻干球放于手心，加入1ml纯化水，溶解完全后进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果见图1和图2，说明本发明制备的无菌速溶未变性天然胶原冻干品中的胶原具有良好的生物活性和纯度，三螺旋结构完整。

(3)无菌检测

将上述实施例制备的冻干球，按照《中华人民共和国药典》(2015年版)四部通则1101规定的方法测定，结果显示无菌。

(4)粘度测试

将上述实施例制备的冻干球放于手心，加入1ml纯化水(市售活性胶原冻干球加入3.6ml纯化水)，溶解完全后，在20℃水浴锅中孵育1小时，然后用粘度计进行检测，检测结果见表2。

市售活性胶原冻干球质量为18mg/个，其中胶原占14％-20％，以20％计算，加入3.6ml纯化水，即得0.1％浓度胶原溶液。该胶原为酰化胶原。

表2.粘度

通过对比实施例1(胶原浓度为0.1％)和市售活性胶原冻干球(0.1％浓度酰化胶原)发现，两者的粘度差异较大，0.1％浓度酰化胶原粘度接近水的粘度，和溶解后的肤感一致，0.1％浓度酰化胶原几乎没有粘度，因此需要加入增稠剂等化学成分保持一定的肤感，有安全性的风险，且于环保不利。而实施例2(胶原浓度为0.2％)和实施例3(胶原浓度为0.3％)的胶原粘度已很明显，肤感已经达到较稠和稠的程度，完全满足护肤品中稠度的要求，无需添加其他成分即可满足使用者对于肤感的要求，安全环保。

以上所述仅为发明的具体实施案例，本发明的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的保护范围之中。