阅读说明：本技术 一种鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体及其制备方法和应用 (Humanized avian influenza resistant neuraminidase monoclonal antibody and preparation method and application thereof ) 是由 秦爱建 王飞 王娅娟 林志娴 万志敏 钱琨 邵红霞 叶建强 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学技术领域,具体涉及一种鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体及其制备方法和应用。通过PCR方法小鼠特异性的Fab与鸡Fc片段拼接并克隆入哺乳动物表达载体中,获得表达重组重链的质粒。两质粒共转染哺乳动物细胞,即可获得分泌表达的鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体。本发明可广泛用于抗病毒、细菌单克隆抗体的鸡源化表达,获得的鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体既能够保持Fab识别、中和抗原的能力,又具备在体内呈递抗原的潜力。(The invention belongs to the technical field of biomedicine, and particularly relates to a humanized avian influenza resistant neuraminidase monoclonal antibody and a preparation method and application thereof. The specific Fab of the mouse and the Fc fragment of the chicken are spliced and cloned into a mammal expression vector by a PCR method to obtain a plasmid for expressing the recombinant heavy chain. The two plasmids co-transfect mammalian cells to obtain the secreted and expressed chicken-derived anti-avian influenza neuraminidase monoclonal antibody. The invention can be widely used for the chicken source expression of the anti-virus and bacterial monoclonal antibody, and the obtained chicken source anti-avian influenza neuraminidase monoclonal antibody can not only keep the capability of Fab in recognizing and neutralizing antigen, but also has the potential of presenting antigen in vivo.)

一种鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体及其制备方法，可广泛用于抗病毒、细菌单克隆抗体的鸡源化表达。

背景技术

单克隆抗体技术于1975年由英国科学家Milstein和Kohler所发明。将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。获得的杂交瘤所分泌的针对某个特定抗原表位抗体即单克隆抗体。此方法获得的单克隆抗体具有纯度高、特异性好、产量高的特点，可以应用于临床诊断试剂和治疗药物研发。

由于目前制备的抗体多为鼠源性，在临床上重复使用可使患者产生抗鼠抗体，从而减弱或失去抗体疗效，并引发超敏反应。因此，在80年代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体。但利用基因工程技术将鼠源单克隆抗体进行鸡源化，却鲜有报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体及其制备方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案为：

一种鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

一种鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

从分泌小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取、扩增单克隆抗体的轻链自信号肽起始密码子至终止密码子的全长基因并克隆入哺乳动物表达载体中，获得表达轻链的质粒；

从分泌小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取、扩增单克隆抗体的重链自信号肽起始密码子至CH1区末端的Fd片段序列，再从免疫鸡脾脏中提取扩增鸡IgY抗体自CH2 N端起始氨基酸密码子至终止密码子的Fc片段基因序列，将Fd片段与Fc片段拼接并克隆入哺乳动物表达载体中，获得表达重组重链的质粒；

上述两个质粒共转染到无血清培养的哺乳动物细胞，收集上清。

进一步的，所述的哺乳动物表达载体包括pCDNA3、pCDNA3.1、pCMV、pCAGGS、pIRES。

进一步的，所述的哺乳动物细胞包括293T细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、sp2/0细胞或CHO细胞。

进一步的，所述的鸡IgY抗体自CH2 N端起始氨基酸密码子至终止密码子的Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供编码所述抗体的核苷酸分子。

本发明还提供一种表达载体，所述表达载体含有编码所述的单克隆抗体的核苷酸分子。

本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的表达载体。

本发明还提供一种药物组合物，包括所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

本发明还提供一种试剂盒，包括所述的单克隆抗体。

本发明还提供所述鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体在体外识别抗原和/或中和病毒中的应用。

有益效果：

禽类IgY抗体的Fc片段受体广泛分布于DC细胞、B细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞表面，协助IgY在体液免疫中呈递抗原。此外，禽类IgY抗体的Fc片段受体还可以介导母源抗体进入鸡胚中。因此，本发明用鸡IgY抗体的Fc片段替换鼠源IgG抗体的Fc片段，构建鸡源化抗禽流感神经氨酸酶抗体，提供一种可应用于鸡被动免疫的鸡源化抗体。同时，利用该方法可以研制出类似的鸡源化抗其他病毒如鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒等的抗体，用于相应疫病的预防等。

附图说明

图1为表达抗体轻链质粒阳性克隆经Sac I和Nhe I双酶切产物电泳图；

图2为表达鸡源化抗禽流感神经氨酸酶抗体重组重链质粒阳性克隆经Sac I和NheI双酶切产物电泳图；

图3为共转染上清为一抗的IFA结果；

图4为鸡源化抗禽流感神经氨酸酶抗体FabchFc体外中和H9N2禽流感病毒的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

以下所有实施例均以抗H9N2禽流感病毒神经氨酸酶单克隆抗体1G8的Fab基因为嵌合抗体改造对象。

实施例1

一种鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)从分泌小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取、扩增单克隆抗体的轻链自信号肽起始密码子至终止密码子的全长基因并克隆入哺乳动物表达载体中，获得表达轻链的质粒；

所述的哺乳动物表达载体包括pCDNA3、pCDNA3.1、pCMV、pCAGGS、pIRES。

(2)从分泌小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取、扩增单克隆抗体的重链链自信号肽起始密码子至CH1区末端的Fd片段序列，再从免疫鸡脾脏中提取扩增鸡IgY抗体自CH2N端起始氨基酸密码子至终止密码子的Fc片段基因序列，利用Overlapping PCR方法将Fd片段与Fc片段拼接并克隆入哺乳动物表达载体中，获得表达重组重链的质粒。

(3)上述两个质粒共转染到无血清培养的哺乳动物细胞，48h后开始收集上清。

所述的哺乳动物细胞包括293T细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、sp2/0细胞或CHO细胞。

实施例2

1.表达抗体轻链载体pCAGGS-LC的构建

从分泌小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞中常规提取RNA并反转录成cDNA，PCR扩增单克隆抗体的轻链自信号肽起始密码子至终止密码子的全长基因并利用Sac I和Nhe I两个酶切位点克隆入哺乳动物表达载体pCAGGS中，获得表达轻链的pCAGGS-LC质粒(阳性克隆质粒酶切结果见图1)。

2.表达重组重链载体pCAGGS-FdchFc的构建

PCR扩增单克隆抗体的重链链自信号肽起始密码子至CH1区末端的Fd片段序列。再从成年免疫鸡脾脏中提取RNA并反转录成cDNA，PCR扩增鸡IgY抗体自CH2恒定区N端起始氨基酸密码子至终止密码子的Fc片段基因序列，利用Overlapping PCR方法将Fd片段与Fc片段拼接并利用Sac I和Nhe I两个酶切位点克隆入哺乳动物表达载体pCAGGS中，获得表达重组重链的pCAGGS-FdchFc质粒(阳性克隆质粒酶切结果见图2)。

3.鸡源化抗禽流感神经氨酸酶抗体(FabchFc)在COS-1细胞中的表达

将生长状态良好的COS-1细胞经0.01％的胰酶消化后，每孔15万细胞上24孔板。铺板18-24h后，将0.2μg pCAGGS-LC和0.3μg pCAGGS-FdchFc混合加入50μL Opti-MEM中，再加入1.5μL的脂质体2000并混匀。室温孵育10min后，将孵育好的转染质粒加入细胞培养基中。同时转染空载体pCAGGS作阴性对照。于37℃，5％CO2培养箱培养48h后开始收集细胞上清。

4.IFA验证抗体的分泌表达

将pCAGGS-NA转染48h后的COS-1细胞固定作为检测原，PBS洗4遍后，加入收获的细胞上清作为为一抗孵育45min。PBS洗3遍后，加入200倍稀释的FITC羊抗鸡IgY(H+L)抗体。37℃孵育30min后，PBS洗3遍，加入50％甘油覆盖转染孔细胞。荧光显微镜下可以观察到以共转染上清为一抗的细胞孔中可以观察到绿色荧光(图3中A)，而空载体上清组无荧光(图3中B)。

5.体外中和实验

以含2μg/mL TPCK胰酶的Opti-MEM培养基将转染上清5倍稀释，与100个TCID50的H9N2禽流感病毒混合，37℃孵育30min后加入预先铺好MDCK细胞的6孔板中，同时以100倍稀释的1G8单抗腹水与100个TCID50的H9N2禽流感病毒混合作阳性对照，5倍稀释转染空载体上清与100个TCID50的H9N2禽流感病毒混合作阴性对照。于37℃培养箱培养72h后收取上清检测HA。HA结果显示，100倍稀释的1G8单抗腹水可以完全抑制病毒复制。共转染上清组较空载体上清组低2个HA滴度，说明共转染的上清中的FabchFc可以抑制H9N2禽流感病毒的复制(图4)。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种鸡源化抗禽流感神经氨酸酶单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Glu Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asp

20 25 30

Val Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Gly Thr Tyr Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Phe

85 90 95

Thr

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Tyr Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Phe Thr Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile His Tyr Asn Gly Asn Ser Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Glu Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys

<210> 3

<211> 978

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcaggtcc tccacccctc ctcctgcacc ccgagccaat ccgagtcggt ggagctgttg 60

tgtttggtga cggggttctc cccggcgtcg gcggaggtcg aatggttggt ggacggagtg 120

gggggacttt tggtggcctc ccaaagcccg gcggtccgca gcggatccac ctacagcctg 180

agcagccgcg tcaacgtcag cggcaccgat tggagggaag ggaagagtta cagctgtagg 240

gtgaggcacc ccgcaaccaa caccgtggtg gaggatcacg tcaagggatg cccggacggc 300

gctcagagct gcagccccat ccagctgtac gccatcccac ccagcccggg cgagctgtac 360

atcagcttag acgccaaact gaggtgcctg gtggtcaacc tgcccagcga ttccagcctc 420

agcgtcacct ggaccaggga gaagagtggg aacctccggc ccgacccgat ggtcctccaa 480

gaacacttca acggcaccta cagcgccagc agcgccgtcc ccgtcagcac ccaggattgg 540

ttatccgggg agaggttcac ctgcaccgtg cagcacgagg agctgcccct gccgctcagc 600

aagagcgtct acaggaacac gggacccacc accccacctc tgatctaccc cttcgccccc 660

cacccggaag agctgtccct ctcccgcgtc accctgagct gcctggtccg cggcttccgc 720

ccacgtgaca tcgagatccg gtggctccgc gaccaccgcg ccgttcccgc caccgaattc 780

gtcaccaccg ccgtcctccc ggaagagaga accgcaaacg gcgccggcgg tgacggcgac 840

accttcttcg tgtacagtaa gatgagcgtg gagaccgcca agtggaacgg cgggacggtg 900

ttcgcctgca tggcggtgca cgaggcgctg cccatgcgct tcagccagcg cacgctgcag 960

aaacaggctg gtaaataa 978