阅读说明：本技术 米曲霉固态发酵生产壳寡糖的方法 (Method for producing chitosan oligosaccharide by solid state fermentation of aspergillus oryzae ) 是由 孙建安 毛相朝 赵甜宇 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种米曲霉固态发酵生产壳寡糖的方法。该方法首先将保存在试管中的米曲霉菌种活化,转移至锥形瓶,然后接种到固态培养基中,在发酵温度为30℃的培养条件下对米曲霉进行固态发酵培养,发酵4d后终止发酵,获得含壳寡糖的发酵产物。本发明对固态培养基初始含水量、接种量、底物添加量、发酵温度、发酵时间、底物处理6项条件进行了优化,并以壳寡糖产量、壳聚糖酶活为指标判定最优条件,最终得到在培养基初始含水量为50％,接种量为15％,底物添加量为2％,发酵温度为30℃且发酵四天时得到的壳寡糖产量最高。本发明的方法适合工业化生产高含量壳寡糖。(The invention discloses a method for producing chitosan oligosaccharide by solid state fermentation of aspergillus oryzae. The method comprises the steps of firstly activating Aspergillus oryzae strains stored in a test tube, transferring the activated Aspergillus oryzae strains to an erlenmeyer flask, then inoculating the activated Aspergillus oryzae strains to a solid culture medium, carrying out solid fermentation culture on the Aspergillus oryzae under the culture condition that the fermentation temperature is 30 ℃, and terminating the fermentation after 4 days of fermentation to obtain a fermentation product containing the chitosan oligosaccharide. The method optimizes 6 conditions of initial water content, inoculation amount, substrate addition amount, fermentation temperature, fermentation time and substrate treatment of the solid culture medium, and judges the optimal conditions by taking the chitosan oligosaccharide yield and the chitosan enzyme activity as indexes to finally obtain the chitosan oligosaccharide with the highest yield when the initial water content of the culture medium is 50%, the inoculation amount is 15%, the substrate addition amount is 2%, the fermentation temperature is 30 ℃ and the fermentation is carried out for four days. The method of the invention is suitable for industrial production of high-content chitosan oligosaccharide.)

米曲霉固态发酵生产壳寡糖的方法

技术领域

本发明属于米曲霉发酵技术领域，具体涉及米曲霉固态发酵生产壳寡糖的方法。

背景技术

米曲霉(Aspergillus oryzae)属于子囊菌门，散囊菌目，散囊菌科，曲霉菌属，黄曲霉群，是在酿酒和发酵业应用很广的一类霉菌。它具有蛋白质分解能力较强的蛋白酶酶系和淀粉糖化能力也较强的糖化酶系等多种酶系统。米曲霉易于培养，又不产生黄曲霉素，是一类有较高利用价值的霉菌。米曲霉是美国食品与药品管理局认可的使用安全的菌种之一。米曲霉在食品业、农业、畜牧业、生物技术等方面都得到了广泛的应用。近期研究发现米曲霉发酵可产生壳聚糖降解的产物-壳寡糖。对于壳聚糖的降解，有专一性酶和非专一性酶降解两种形式。专一性酶即壳聚糖酶，另外脂肪酶、纤维素酶等非专一性酶也可降解壳聚糖。

尽管壳聚糖具有重要的生物活性，但溶解度低，不能溶于水和有机溶剂，因此限制了其在食品、药品、化工制品中的应用。而壳聚糖的水解产物壳寡糖由于分子链长较短和D-氨基葡萄糖中游离的氨基而具有很好的水溶性，得以被广泛应用于食品、农业、生物医药等领域。在食品行业中，壳寡糖是一种良好的天然防腐剂，安全性高且无毒副作用，壳寡糖还可被用作天然保鲜剂，特殊结构可以锁住食品中的水分，对人体矿物质的吸收也有促进作用。在饲料业中，壳寡糖相对于其他饲料添加剂具有不产生耐药性、无药物残留、不对有益菌产生破坏和杀灭等优势。它的理化性质稳定，在胃肠道中不被分解，可被动物直接吸收入血作用于靶细胞，能够持续稳定的提高动物的免疫力。壳寡糖作为免疫增强剂添加到水产饲料中已有许多成功的案例。农业上，壳寡糖可用作生物农药发挥抗虫害作用以提高植物抗病性，加速植株生长发育，且使用过程中无残留，更加绿色环保。

以虾、蟹壳等甲壳素含量丰富的物质为主原料，经过碱处理脱去其中蛋白质成分，酸处理脱去钙质，再脱去乙酰基制得壳聚糖。然后通过水解将壳聚糖转化为壳寡糖，并且可以通过化学、物理、酶促方法完成降解。化学方法包括使用HCl等强酸进行的酸水解，以及H₂O₂等物质完成的氧化降解。化学法都是通过断裂β-1,4糖苷键而得到低分子量的聚合物，反应速度快，产量高，但较难控制反应条件，转化效率低，难以得到较纯的产物，且产物以氨基葡萄糖单糖为主。化学法由于使用大量化学试剂，对环境易造成污染破坏，产生有毒有害物质，反应剧烈较难控制。物理方法简单方便、易于操作，包括超声降解、微波降解和γ射线降解。然而，此方法收率较低，产品分子量难以控制，很难获得相同分子量的产品。酶解法是较化学法相对温和的一种降解方法，反应高效可控，操作简单方便，产品转化率高，产量大，不会改变产物结构，副产物少，且不会造成环境污染，安全性更高。壳聚糖可以被各种类型的酶水解。包括非专一性酶类：脂肪酶、溶菌酶、纤维素酶等，专一性酶即为壳聚糖酶。两类酶在降解中产生的作用效果并不相同，非专一性酶水解较不彻底，产物活性低，反应速度慢，产物复杂难以控制条件得到特定分子量的产品。通过比较可知，各种方法中，壳聚糖酶法的效果较其他方法更优，产物更易控制。然而，壳聚糖酶法生产壳聚糖的产率低，需要优化发酵条件。

发明内容

本发明的目的在于提供一种米曲霉固态发酵生产壳寡糖的方法，提高壳寡糖的产率。

一种米曲霉固态发酵生产壳寡糖的方法，按照如下步骤进行：

(1)将保存在试管中的米曲霉菌种活化，转移至锥形瓶，然后按照15％的接种量接种到固态培养基中，调节固态培养基水分，使之含量为50％；

(2)在发酵温度为30℃的培养条件下对米曲霉进行固态发酵培养，发酵4d后终止发酵，获得含壳寡糖的发酵产物。

所述米曲霉菌种活化的操作步骤为：将保存在试管中的米曲霉接种到PDA培养基上，倒置在30℃的恒温培养箱中静置活化4天，然后用无菌生理盐水冲洗平板，使用涂布器轻轻将琼脂表面的米曲霉刮下，使用5ml的移液枪将洗脱液移至灭过菌的100ml锥形瓶中，每管米曲霉收集80mL洗脱液。

所述固态培养基中，含2％的壳聚糖。

所述壳聚糖在加入到固态培养基之前经过酒石酸浸没处理12-24小时。

固体发酵米曲霉产壳聚糖酶对壳聚糖粉末降解效果不明显，因此需要对壳聚糖作一定的预处理，使它在发酵过程中成为相对可溶状态，促进反应发生。壳聚糖不溶于水和碱溶液，但可溶于稀的盐酸、硝酸和大多数有机酸溶液。壳聚糖在稀酸中的溶解，实质上是壳聚糖分子链上众多的游离氨基能从溶液中结合一个氢离子，从而使壳聚糖成为带阳电荷的聚电解质，破坏了壳聚糖分子间和分子内的氢键，使之溶于水。采用盐酸和醋酸过于强烈，会影响体系中发酵的进程，反而使得降解效果更低，采用柠檬酸等弱酸，在发酵过程中容易被分解消耗，发明人反复实验，最终确认选择酒石酸浸没处理，效果最佳。

所述PDA培养基的配置方法：取4.01g马铃薯葡萄糖琼脂粉溶于100ml蒸馏水中，121℃下高压灭菌15min，倒入平板中备用。

所述固态培养基的配置方法：250ml锥形瓶添加25g麸皮、8％的壳聚糖，设置初始水分含量为50％，自然pH，121℃下高压灭菌20min。

本发明的有益效果：本发明对固态培养基初始含水量、接种量、底物添加量、发酵温度、发酵时间、底物处理6项条件进行了优化，并以壳寡糖产量、壳聚糖酶活为指标判定最优条件。最终得到在培养基初始含水量为50％，接种量为15％，底物添加量为2％，发酵温度为30℃且发酵四天时得到的壳寡糖产量最高。且TLC结果显示，培养基内的壳寡糖为壳二糖。最优条件下纤维素酶酶活为49.07U，蛋白酶酶活为31.5956U，壳聚糖酶酶活为33.944U，脂肪酶酶活为292.616U。

附图说明

图1为培养基内水分含量优化实验中壳寡糖含量在发酵过程中的变化规律。

图2为培养基内水分含量优化实验中壳聚糖酶相对酶活在发酵过程中的变化规律。

图3为接种量优化实验中壳寡糖含量在发酵过程中的变化规律。

图4为接种量优化实验中壳聚糖酶相对酶活在发酵过程中的变化规律。

图5为底物添加量优化实验中壳寡糖含量在发酵过程中的变化规律。

图6为底物添加量优化实验中壳聚糖酶相对酶活在发酵过程中的变化规律。

图7为培养温度优化实验中壳寡糖含量在发酵过程中的变化规律。

图8为培养温度优化实验中壳聚糖酶相对酶活在发酵过程中的变化规律。

图9为TLC薄板层析结果；

图中，1:1g/L葡萄糖溶液，2：壳寡糖标准品，3：发酵0h发酵液，4：发酵96h发酵液-1，5：发酵96h发酵液-2。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

发酵实验操作流程：

将保存在试管中的米曲霉菌种接种到PDA培养基上，倒置在30℃的恒温培养箱中静置活化4天，然后用无菌生理盐水冲洗平板，使用涂布器轻轻将琼脂表面的米曲霉刮下，使用5ml的移液枪将洗脱液移至灭过菌的100ml锥形瓶中。将混合均匀后的菌种按照10％的接种量接种到配制好的固态培养基中，用勺子将固态培养基搅拌均匀后，每隔24h定时取2g固态培养基成分移至20ml加入弹珠的无菌水中，将取样瓶放置在30℃恒温水浴摇床中摇床30min。

壳聚糖酶酶活测定方法：

壳聚糖酶酶活的定义：壳聚糖酶水解底物壳聚糖产生1μmol氨基葡萄糖所需要的酶量。

取200μl发酵上清液与200μl 2％壳聚糖底物溶液均匀混合，放置在55℃恒温水浴中保温15min。取200ul上述反应液加入到300ul DNS试剂中终止酶促反应，(对照组先取200ul发酵液沸水浴灭活10min再加入2％壳聚糖底物溶液，混合均匀后取200ul反应液加入到300ul DNS试剂中终止酶促反应)沸水浴显色5min后冷却，12000rpm离心90s，取上清液540nm下测吸光度值。

标曲绘制：各取0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml的葡萄糖标准溶液200ul，再加入300ul DNS试剂，沸水浴显色5min，冷却后在540nm下测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

氨基葡萄糖含量测定(Elson-Morgan法)：

取100ul发酵上清液与100ul乙酰丙酮试剂混合，沸水浴中反应30min，冷却后加入200ul无水乙醇溶液、100ul对二甲氨基苯甲醛试剂，震荡，再加入400ul无水乙醇溶液，60℃下保温1h。530nm下测吸光度值。

标曲绘制：各取0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml的氨基葡萄糖溶液100ul与100ul乙酰丙酮试剂混合，沸水浴中反应30min，冷却后加入200ul无水乙醇溶液、100ul对二甲氨基苯甲醛试剂，震荡，再加入400ul无水乙醇溶液，60℃下保温1h。530nm下测吸光度值。以氨基葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

纤维素酶酶活测定：

纤维素酶活的定义：在一定的温度条件下，纤维素酶水解羟甲基纤维素钠溶液产生1μmol葡萄糖所需要的酶量。

取200ul发酵上清液与200ul 8.0g/L羟甲基纤维素钠底物溶液均匀混合，37℃保温30min，取200ul反应液加入到300ul DNS试剂终止酶促反应。沸水浴显色5min后冷却，540nm下测吸光度值。标准曲线绘制过程同壳聚糖酶活测定。

蛋白酶酶活测定：

蛋白酶酶活的定义：蛋白酶水解底物酪蛋白产生1μmol酪氨酸所需要的酶量。

取200ul发酵浸提液与200ul pH为7.2的磷酸缓冲液混合，置于40℃水浴中预热5min后，加入200ul同样预热的1％酪蛋白溶液，置于40℃水浴准确计时反应20min，再加入400ul 0.4mol/L的三氯乙酸溶液终止反应，静置3min，12000rpm离心5min。(对照组将加入三氯乙酸溶液和1％酪蛋白溶液的顺序颠倒)吸取上清40ul，再加入200ul 0.4mol/L的碳酸钠、40ul福林酚试剂，摇匀，置于40℃水浴保温发色20min，冷却，测定680nm处的吸光度值。

标曲绘制：分别取0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml、50ug/ml的酪氨酸标准溶液40ul，各加200ul 0.4mol/L碳酸钠溶液，福林酚试剂40ul，置于40℃恒温水浴中保温发色20min，冷却后于680nm下测定吸光度。以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

脂肪酶酶活测定:

脂肪酶酶活的定义：在一定温度的pH条件下，脂肪酶水解底物产生1μmol脂肪酸所需要的酶量。

取100ul发酵浸提液与100ul pH为7.2的磷酸缓冲液混合，再加入20ul20mM pNPD于37℃反应5min，(对照组用缓冲液代替底物)加入200ul 1％的SDS终止反应，405nm下测定吸光度值。

标曲绘制：向96孔板中添加一定量的pNP母液，并用超纯水稀释，得到梯度为10uM，0uM至250uM的标准溶液。充分混匀均匀，静置2min后，于405nm下检测吸收波长。根据测得数值，以吸光度OD405为横坐标，以pNP浓度为纵坐标绘制曲线。

TLC薄板层析：

展开剂为正丙醇：氨水(体积为2:1)。显色剂为0.1％的茚三酮乙醇溶液。取纸层析板，在距离底端1cm处用铅笔轻轻划线，用2.5ul的移液枪等距离点样，每个样品需要点样三次，以壳寡糖混合物(1-6糖)作为参照物。待纸层析板放在展开缸中，下端泡入展开剂进行展开。展开结束后，吹风机将纸层析板吹干，在缸内补充少量展开剂后再将纸层析板放入展开缸中进行二次展开。展开结束后用吹风机将纸层析板吹干，泡入显色液中，110℃下显色5min，壳寡糖的斑点将显现。

实施例1：培养基内水分含量优化

在发酵固态培养基的基础上，分别按初始含水量为30％、40％、50％、60％、70％在培养基中加入蒸馏水(麸皮含水量以12％计)，30℃培养箱中培养120h,每24h取样一次。分别测定其氨基葡萄糖的含量、壳聚糖酶相对酶活以及孢子数。结果如图1-2所示，依次是壳寡糖含量、壳聚糖酶相对酶活在发酵过程中的变化规律。

由图1-2可知，壳寡糖的产量随着时间的增加呈波动性变化。因为在生成壳寡糖的同时，培养基内的米曲霉菌体也在消耗一部分壳寡糖，因此壳寡糖的产量处于动态变化过程。大部分梯度呈现一个先上升后下降再升高的趋势，且所有梯度的培养基均在发酵24h达到最大值。水分含量对于壳寡糖的产量有较大影响，其中初始水分含量为50％的培养基壳寡糖产量高于其他水分含量的培养基，其最大值在24h达到了3.26mg/g。

壳聚糖相对酶活随时间增加先增高后下降保持在一个稳定水平，除含水量为40％的培养基在48h达到最高酶活，其他含水量的培养基均在24h时达到最大值。最高酶活由30％水分含量的培养基发酵第一天产生。

虽然壳寡糖的相对酶活在初始水分含量为30％时较高，但是50％水分含量的培养基壳寡糖产量优于其他梯度的培养基，因此选择50％的初始水分含量作为最优值。

实施例2：接种量优化

确定上述初始含水量为50％后，在发酵固态培养基的基础上，分别按5％、10％、15％的接种量接种，30℃培养箱中培养120h,每24h取样一次。分别测定其氨基葡萄糖的含量、壳聚糖酶酶活。结果如图3-4所示，依次是壳寡糖含量、壳聚糖酶相对酶活在发酵过程中的变化规律。

由图3-4可知，接种量为5％的培养基内壳寡糖产量随时间增加而逐渐增加，最大值为发酵120h产生，为2.55mg/ml；接种量为10％的培养基内随时间增加而先增加后下降在增加，其最大值为发酵96h时产生，为2.36mg/ml；15％的培养基内壳寡糖产量随时间增加而先增加后下降再升高再下降，其最大值为发酵96h产生，为2.85mg/ml。最大产量由接种量15％的培养基在发酵第96h产生，为2.85mg/ml。可以观察到15％接种量壳寡糖产量的变化趋势与水分含量周期中50％的变化趋势一致。

三种接种量的培养基相对酶活均在24h时达到最大值，24h-48h之间酶活骤减，24h后相对酶活保持在一定范围内。接种量为15％的酶活与其他两个梯度差距明显，接种量15％的酶活最大，其次为5％，最后为10％。

综上所述，三种接种量的培养基在48h内壳寡糖产量差异不明显，48h后15％接种量的培养基壳寡糖产量明显高于5％、10％接种量的培养基，因此选择15％的接种量作为最优值。

实施例3：底物添加量优化

确定上述初始水分含量为50％，接种量为15％后，在发酵固态培养基的基础上，分别按2％、5％、8％、10％的底物添加量添加壳聚糖，30℃培养箱中培养120h,每24h取样一次。分别测定其氨基葡萄糖的含量、壳聚糖酶酶活。结果如图5-6所示，依次是壳寡糖含量、壳聚糖酶相对酶活在发酵过程中的变化规律。

由图5-6可知，四种底物添加量不同的培养基内壳寡糖的产量随时间呈波动性变化，且都是先增加后下降再增加再下降的趋势。四种不同梯度的培养基均在发酵96h达到最高值，底物添加量为2％、5％、8％、10％的转化率依次为25.5％、9.5％、7.0％、5.5％。由此可见，随底物添加量逐渐升高，每1g底物转化为产物的产量逐渐降低。

除底物添加量为2％的培养基在48h达到最大酶活，其余均在24h时达到最大酶活。底物添加量对于酶活的影响较为显著，底物添加量为8％的最高酶活显著大于底物添加量为5％的酶活，其次为10％，最低的为2％。

综上所述，选择转化率最高的2％作为最优的底物添加量。

实施例4：培养温度优化

确定上述初始水分含量为50％，接种量为15％，底物添加量为2％后，将固态培养基分别放在27℃、30℃、37℃恒温培养箱中培养120h，每24h取样一次。分别测定其氨基葡萄糖的含量、壳聚糖酶酶活。结果如图7-8所示，依次是壳寡糖含量、壳聚糖酶相对酶活在发酵过程中的变化规律。

由图7-8可知，培养温度不同的培养基内壳寡糖的产量随时间呈波动性变化，且都是先增加后下降再增加的趋势。其中培养温度为25℃的培养基在48h时达到最大值2.42mg/g；培养温度为30℃的培养基在24h时达到最大值为2.43mg/g；培养温度为37℃的培养基在48h达到最大值达到2.37mg/g。

培养温度为25℃和30℃时，发酵培养基在48h达到最大酶活，培养温度为37℃的发酵培养基在24h时达到最大酶活。其中培养温度为37℃的培养基酶活最高，其次为30℃，最低的是25℃。

综上所述，温度对于壳寡糖产量的影响不显著，但培养温度为30℃时相对较稳定。因此选择30℃作为培养温度。

实施例5：发酵时间优化

由底物添加量优化周期可知，当底物添加量为2％时，发酵48h与96h的壳寡糖产量差异较大。虽然48h可以节省时间成本，但在48h结束发酵开始新的发酵周期会对物料造成极大的浪费。因此选择壳寡糖产量更高的96h作为最优发酵时间。

由上述可知，最终选择在接种量为15％，底物添加量为2％，培养基初始水分含量为50％，发酵温度为30℃的培养条件下对米曲霉固态发酵培养基进行发酵，且取发酵第四天壳寡糖产量最高的时刻终止发酵。对在以上条件下的培养基进行蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、壳聚糖酶酶活的测定。并采用TLC薄板层析的方法对培养基内寡糖产物进行分析。

酶活测定结果如下表1所示，在脂肪酶的酶活测定中，结果表明脂肪酶对于对硝基苯酚己酸酯、对硝基苯酚辛酸酯、对硝基苯酚癸酸酯、对硝基苯酚棕榈酸酯均有活性，但对对硝基苯酚辛酸酯活性最高且活性稳定。

表1

本组实验以1g/L葡萄糖溶液以及壳寡糖标准品作为对照。样品为发酵0h以及发酵96h的发酵液。由两组发酵液对比可知，发酵后产生了壳二糖(图9)。而培养基中本身存在一定量的葡萄糖。

实施例6：底物处理优化

壳聚糖在加入到固态培养基之前经过酒石酸浸没处理18小时,对照为未处理壳聚糖底物。

在接种量为15％，底物添加量为2％，培养基初始水分含量为50％，发酵温度为30℃的培养条件下对米曲霉固态发酵培养基进行发酵，且取发酵第四天壳寡糖产量最高的时刻终止发酵。

最终经过酒石酸底物处理的固体发酵物中壳寡糖产量为3.38mg/g，未经过底物处理的固体发酵物中壳寡糖产量为2.66mg/g，增产效果明显。若采用同摩尔浓度的盐酸浸没处理底物18小时，最终的固体发酵物中壳寡糖产量为1.38mg/g，抑制效果明显。