阅读说明：本技术 鼠李糖脂发酵培养基及其制备方法、应用 (Rhamnolipid fermentation medium and preparation method and application thereof ) 是由 史正军 张祥胜 袁峰均 周一波 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种鼠李糖脂发酵培养基及其制备方法、应用。其中,鼠李糖脂发酵培养基包括如下质量份的原料组分：尿素2-3份、磷酸二氢钾6-8份、氯化钾1-2份、酵母1-2份、镁盐0.1-0.3份、钙盐0.01-0.03份、碳源20-100份、以及水900-1100份,其中,所述镁盐选自硫酸镁、氯化镁和硝酸镁中的至少一种,所述钙盐选自氯化钙和碳酸钙中的至少一种,所述碳源选自植物油和甘油中的至少一种。上述鼠李糖脂发酵培养基中各原料组分配比合理,经实验验证,铜绿假单胞菌能够充分利用此培养基为基础原料制得产率高的鼠李糖脂。(The invention relates to a rhamnolipid fermentation medium, a preparation method and application thereof. The rhamnolipid fermentation medium comprises the following raw material components in parts by mass: 2-3 parts of urea, 6-8 parts of monopotassium phosphate, 1-2 parts of potassium chloride, 1-2 parts of yeast, 0.1-0.3 part of magnesium salt, 0.01-0.03 part of calcium salt, 20-100 parts of carbon source and 900 parts of water, wherein the magnesium salt is selected from at least one of magnesium sulfate, magnesium chloride and magnesium nitrate, the calcium salt is selected from at least one of calcium chloride and calcium carbonate, and the carbon source is selected from at least one of vegetable oil and glycerol. The rhamnolipid fermentation medium has reasonable raw material component proportion, and the pseudomonas aeruginosa can fully utilize the medium as a basic raw material to prepare the rhamnolipid with high yield through experimental verification.)

鼠李糖脂发酵培养基及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，特别是涉及一种鼠李糖脂发酵培养基及其制备方法、应用。

背景技术

鼠李糖脂主要是以铜绿假单胞菌发酵产生的一种生物表面活性剂，具有较强的表面和界面活性、低毒、可生物降解性，被广泛用于石油、环保、化工、食品、医药和农业等领域。鼠李糖脂为阴离子型表面活性剂，主要是由亲水型的碳水化合物和憎水型的长链脂肪酸或羟基脂肪酸以共价键形式结合而成，应用于肥料或农药助剂主要发挥其乳化、分散、润湿等作用。鼠李糖脂通常的生产方法是利用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)以葡萄糖、植物油、磷酸氢二钾等原料培养基经发酵制备鼠李糖脂。

农药助剂作为重要的新型功能性材料，在改善化肥产品品质、增加化肥产品功能、改进化肥施用效果和提高化肥利用率等方面具有不可或缺的作用，能协助传统化肥生产企业降低化肥生产能耗、提高化肥生产效率、增加企业经济效益、加快化肥产品结构调整和产业升级，对促进现代农业发展、提高资源利用率及改善化肥施用对环境的影响具有十分重要的意义。

传统的鼠李糖脂发酵培养基原料组分的成本高，且制得的发酵液中鼠李糖脂产率低。

发明内容

基于此，提供一种能够提高鼠李糖脂产率且原料成本低廉的鼠李糖脂发酵培养基。

一种鼠李糖脂发酵培养基，其包括如下质量份的原料组分：

其中，所述镁盐选自硫酸镁、氯化镁和硝酸镁中的至少一种，所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙和碳酸钙中的至少一种，所述碳源选自植物油和甘油中的至少一种。

在其中一个实施例中，包括如下质量份的原料组分：

在其中一个实施例中，所述植物油选自花生油、豆油、亚麻油、蓖麻油、菜子油和炸货油中的至少一种。

本发明提供一种鼠李糖脂发酵培养基的制备方法，其包括如下步骤：

将本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的原料组分混合，灭菌处理后出料。

在其中一个实施例中，在将本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的原料组分混合的步骤中，是将尿素、磷酸二氢钾、氯化钾、镁盐、钙盐与水混合至均匀得到混合液；向所述混合液中加入酵母、碳源。

本发明还提供一种肥料助剂，所述肥料助剂的原料包括本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基或本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的制备方法制备得到的培养基。

本发明还提供一种肥料助剂的制备方法，其包括如下步骤：

将铜绿假单胞菌扩大培养制成种子液；

按照种子液质量百分比5％-10％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基中进行发酵得到发酵液；或按照种子液质量百分比5％-10％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的制备方法制备得到的培养基中进行发酵得到发酵液；

调节所述发酵液的pH至8.0-10.0，升温至80-100℃，保温、过滤得到肥料助剂。

在其中一个实施例中，在将铜绿假单胞菌扩大培养制成种子液的步骤中，是将斜面菌种用接种环接入营养肉汤培养基中，所述斜面菌种为铜绿假单胞菌，扩大培养制成一级种子液，将所述一级种子液接入培养基扩大培养制成二级种子液。

在其中一个实施例中，在将斜面菌种接入培养基扩大培养制成一级种子液的步骤中，是将所述斜面菌种接种于肉汤培养基中摇瓶培养8h-12h，培养温度为28-30℃。

在其中一个实施例中，在将所述一级种子液接入培养基扩大培养制成二级种子液的步骤中，是将所述一级种子液按质量百分比1％-5％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基中；或是将所述一级种子液按质量百分比1％-5％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的制备方法制备得到的培养基中；

摇瓶培养或通气培养24h-48h，培养温度为28-30℃。

本申请的发明人对传统的鼠李糖脂发酵培养基的配方研究发现，传统的鼠李糖脂发酵培养基中多含有由磷酸二氢钾和磷酸氢二钾组成的双磷酸盐，不仅原料成本高，且铜绿假单胞菌不能够充分利用培养基中的营养物质，发酵制得的鼠李糖脂产率低。

基于此，发明人对传统的鼠李糖脂发酵培养基配方进行改良，上述鼠李糖脂发酵培养基中各原料组分配比合理，经实验验证，铜绿假单胞菌能够充分利用此培养基为基础原料制得产率高的鼠李糖脂。此外，发明人选用价格低廉的磷酸二氢钾、尿素、氯化钾等作为鼠李糖脂发酵培养基的原料，大大降低了原料成本。

附图说明

图1为本发明实施例1、实施例3、对比例3与对比例4的肥料助剂中鼠李糖脂含量的比较图；

图2为本发明实施例3、对比例1与对比例2的肥料助剂中鼠李糖脂含量的比较图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例中提供了一种鼠李糖脂发酵培养基，其包括如下质量份的原料组分：

其中，所述镁盐选自硫酸镁、氯化镁和硝酸镁中的至少一种，所述钙盐选自氯化钙和碳酸钙中的至少一种，所述碳源选自植物油和甘油中的至少一种。

在其中一个实施例中，本发明一实施例中提供了一种鼠李糖脂发酵培养基，其包括如下质量份的原料组分：

在其中一个实施例中，所述酵母为成本低廉的食品级酵母粉、酵母膏和酵母提取物中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述植物油选自花生油、豆油、亚麻油、蓖麻油、菜子油和炸货油中的至少一种。

在其中一个实施例中，经实验验证，当所述钙盐为氯化钙时，铜绿假单胞菌经本申请的培养基发酵制备的鼠李糖脂比钙盐为碳酸钙时产量更高。

在其中一个实施例中，尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙均为肥料级试剂材料，酵母粉为食品级酵母粉，植物油选用炸货油，废油等，上述原料成本低廉可以降低成本且在同等条件下，对鼠李糖脂的产量并无明显影响。

在其中一个实施例中，所述水为去离子水，经实验验证，选用去离子水时，铜绿假单胞菌经本申请的培养基发酵制备的鼠李糖脂产量更高。当然可以理解，所述水也可以为自来水。

发明人对传统的鼠李糖脂发酵培养基配方进行改良，上述鼠李糖脂发酵培养基中各原料组分配比合理，经实验验证，铜绿假单胞菌能够充分利用此培养基为基础原料制得产率高的鼠李糖脂。此外，发明人选用价格低廉的磷酸二氢钾、尿素、氯化钾等作为鼠李糖脂发酵培养基的原料，大大降低了原料成本。

本发明提供一种鼠李糖脂发酵培养基的制备方法，其包括如下步骤：

将本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的原料组分混合，灭菌处理后出料。

在其中一个实施例中，在将权利要求上述鼠李糖脂发酵培养基的原料组分混合的步骤中，是将尿素、磷酸二氢钾、氯化钾、镁盐、钙盐与水混合至均匀得到混合液；向所述混合液中加入酵母、碳源。

在其中一个实施例中，灭菌处理是在120-122℃下蒸汽灭菌15min-20min，当然也可以采用蒸汽高压灭菌灭菌处理。

本发明还提供一种肥料助剂，所述肥料助剂的原料包括本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基或本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的制备方法制备得到的培养基。

上述肥料助剂含有本发明所述的鼠李糖脂发酵培养基，其原料成本低廉，可作灌根剂和消毒剂，防治土传疾病，促进作物生长。

本发明还提供一种肥料助剂的制备方法，包括如下步骤：

将铜绿假单胞菌扩大培养制成种子液；

按照种子液质量百分比5％-10％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基中进行发酵得到发酵液，之后再调节所述发酵液的pH至8.0-10.0，升温至80-100℃，保温、过滤得到肥料助剂；或

按照种子液质量百分比5％-10％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的制备方法制备得到的培养基中进行发酵得到发酵液，之后再调节所述发酵液的pH至8.0-10.0，升温至80-100℃，保温、过滤得到肥料助剂。

其中，按照种子液质量百分比5％-10％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基中进行发酵得到发酵液是指种子液质量百分比占种子液质量与鼠李糖脂发酵培养基总质量的5％-10％。

其中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种能够合成表面活性剂鼠李糖脂的烃降解菌，其能够利用本发明所述的鼠李糖脂发酵培养基经发酵合成鼠李糖脂。本发明的所述的铜绿假单胞菌选用本领域技术人员已知的铜绿假单胞菌即可。

在其中一个实施例中，保温处理的时间为15min-25min。

在其中一个实施例中，在将铜绿假单胞菌扩大培养制成种子液的步骤中，是将斜面菌种用接种环接入营养肉汤培养基中，所述斜面菌种为铜绿假单胞菌，扩大培养制成一级种子液，将所述一级种子液接入培养基扩大培养制成二级种子液。此时，二级种子液也为最终的种子液。斜面菌种经二次扩大培养制备得到二级种子液，更有利于后续铜绿假单胞菌发酵。当然可以理解，也可以不将所述一级种子液接入培养基扩大培养制成二级种子液，而是直接将一级种子液按照质量百分比5％-10％的接种量接入本发明所述的鼠李糖脂发酵培养基或本发明所述的鼠李糖脂发酵培养基的制备方法制备得到的培养基中进行发酵得到发酵液。

在其中一个实施例中，在将斜面菌种接入培养基扩大培养制成一级种子液的步骤中，是将所述斜面菌种接种于肉汤培养基中摇瓶培养8h-12h，培养温度为28-30℃。

在其中一个实施例中，在将所述一级种子液接入培养基扩大培养制成二级种子液的步骤中，是将所述一级种子液按质量百分比1％-5％的接种量接入本发明所述的鼠李糖脂发酵培养基中，摇瓶培养24h-48h，培养温度为28-30℃。

在其中一个实施例中，在将所述一级种子液接入培养基扩大培养制成二级种子液的步骤中，是将所述一级种子液按质量百分比1％-5％的接种量接入本发明所述的鼠李糖脂发酵培养基的制备方法制备得到的培养基中，摇瓶培养或通气培养24h-48h，培养温度为28-30℃。

在其中一个实施例中，按照种子液质量百分比5％-10％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的步骤中，发酵条件为在28-32℃下发酵3-5天，进一步地，按照种子液的5％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基中。

在本实施例中，对发酵装置不做过多限定，可以为摇瓶或发酵罐均可，进一步地，如果用摇瓶发酵，发酵液体积占摇瓶容积的五分之一，如果用发酵罐发酵，发酵液体积占发酵罐容积的70％。更利于充分发酵。

在其中一个实施例中，按照种子液质量百分比5％-10％的接种量再次接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的步骤中，发酵条件为在28-32℃下发酵3-5天，进一步地，按照种子液的5％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基中。

在本实施例中，对发酵装置不做过多限定，可以为摇瓶或发酵罐均可，进一步地，如果用摇瓶发酵，发酵液体积占摇瓶容积的五分之一，如果用发酵罐发酵，发酵液体积占发酵罐容积的70％。更利于充分发酵。

在其中一个实施例中，按照种子液质量百分比5％-10％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的制备方法制备得到的培养基的步骤中，发酵条件为在28-32℃下发酵3-5天，进一步地，按照种子液的5％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基中。

其中，按照种子液质量百分比5％-10％的接种量接入本发明任一项所述的鼠李糖脂发酵培养基的制备方法制备得到的培养基是指种子液质量百分比占种子液质量与鼠李糖脂发酵培养基总质量的5％-10％。

上述肥料助剂的制备方法操作简单，利用本发明所述的鼠李糖脂发酵培养基制备得到肥料助剂，可作灌根剂和消毒剂，防治土传疾病，促进作物生长。

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实验设计

材料准备：

实验用菌株选用铜绿假单胞菌株Z-2，该菌株已公开于CN104087525A(一种新型的产生物表面活性剂海水发酵型菌株)专利中。

肉汤培养基，购置于杭州微生物试剂有限公司。

除另有规定外，除对比例5外，下述实施例中所用试剂原料均为市场购置，尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙均为肥料级试剂材料，酵母粉为食品级酵母粉，植物油选用废弃的炸货油，上述鼠李糖脂发酵培养基原料组分成本低廉。

实施例1

一种肥料助剂的生产方法：

鼠李糖脂发酵培养基的配置：将2.5g尿素、8g磷酸二氢钾、1g氯化钾、0.2g硫酸镁、0.02g氯化钙与1L去离子水混合得到混合液，之后向混合液中加入1g酵母粉，混匀后再加入30mL炸货油，本实施例中炸货油选用豆油，120℃蒸汽灭菌处理20min。

一级种子液培养：取铜绿假单胞菌株Z-2斜面菌种，接种于购置的肉汤培养基中摇瓶培养10h，培养温度为30℃，转速180rpm。

二级种子液培养：取一级种子液按5％的接种量接入鼠李糖脂发酵培养基中，摇瓶培养30h，培养温度为28℃，转速180rpm。

发酵培养：取二级种子液按10％的接种量再次接入鼠李糖脂发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件是在5L发酵罐中，在30℃下发酵3天，之后调节pH为8.0，升温至80℃，保温20min，经纸板过滤机过滤后，得到的滤液为肥料助剂。

实施例2

一种肥料助剂的生产方法：

鼠李糖脂发酵培养基的配置：将2.1g尿素、8g磷酸二氢钾、2g氯化钾、0.2g硫酸镁、0.02g氯化钙与1L去离子水混合得到混合液，之后向混合液中加入1.5g酵母粉，混匀后再加入50mL炸货油，本实施例中炸货油选用豆油，120℃蒸汽灭菌处理20min。

一级种子液培养：取铜绿假单胞菌株Z-2斜面菌种，接种于购置的肉汤培养基中摇瓶培养10h，培养温度为30℃，转速180rpm。

二级种子液培养：取一级种子液按5％的接种量接入鼠李糖脂发酵培养基中，摇瓶培养30h，培养温度为28℃，转速180rpm。

发酵培养：取二级种子液按10％的接种量再次接入鼠李糖脂发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件是在5L发酵罐中，30℃下发酵3天，之后调节pH为8.0，升温至100℃，保温20min，经纸板过滤机过滤后，得到的滤液为肥料助剂。

实施例3

一种肥料助剂的生产方法，其制备方法大体上与实施例1相同，不同之处在于：在发酵培养的步骤中，取二级种子液按5％的接种量再次接入鼠李糖脂发酵培养基中进行发酵培养。

对比例1

一种肥料助剂的生产方法，其制备方法大体上与实施例3相同，不同之处在于：鼠李糖脂发酵培养基的配方不同，即采用自来水替代去离子水。

对比例2

一种肥料助剂的生产方法，其制备方法大体上与实施例3相同，不同之处在于：鼠李糖脂发酵培养基的配方不同，即不添加镁盐硫酸镁和氯化钙，且采用自来水替代去离子水。

对比例3

一种肥料助剂的生产方法，其制备方法大体上与实施例1相同，不同之处在于：鼠李糖脂发酵培养基配方不同，即采用磷酸二氢钾4g和磷酸氢二钾4g双磷酸盐替代磷酸二氢钾8g。

对比例4

一种肥料助剂的生产方法，其制备方法大体上与实施例1相同，不同之处在于：鼠李糖脂发酵培养基配方不同，即在鼠李糖脂发酵培养基配方中还添加有1g/L碳酸钙。

对比例5

一种肥料助剂的生产方法，其制备方法大体上与实施例3相同，不同之处在于：鼠李糖脂发酵培养基配方组分中磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙均为实验室用分析纯级。

效果实验

采用硫酸苯酚法测定肥料助剂中的鼠李糖脂，结果见图1和图2。

由图1可知，添加碳酸钙的对比例4的肥料助剂中的鼠李糖脂产率最低，远不如实施例1和实施例3，采用磷酸二氢钾4g和磷酸氢二钾4g双磷酸盐的对比例3不如实施例1中的鼠李糖脂产率高，此外，实施例1和实施例3进行对比，发酵接种量虽然有所提升，但是鼠李糖脂产率确不如实施例3中的鼠李糖脂产率高。

由图2可知，采用自来水作为鼠李糖脂发酵培养基原料组分发酵效果差，检测到的鼠李糖脂含量少，而如果不添加钙盐、镁盐，发酵效果更差，检测到的鼠李糖脂含量最少。

此外，对比例5中的鼠李糖脂发酵培养基配方选用的原料均为实验室用分析纯级，但是与实施例3进行比对，经测定鼠李糖脂含量与之相差无几，并无显著差异，实施例3中的鼠李糖脂可达到19.5g/L。

再者，对实施例3中的肥料助剂中的鼠李糖脂发酵培养基、肥料助剂(原液)、肥料助剂(浓缩10倍)的主要营养元素进行测定，结果见表1。

表1

由表1可知，鼠李糖脂发酵培养基中的主要营养元素在制备肥料助剂的过程中并无损失，且得到了富集。本发明的肥料助剂在使用时，可以根据实际需求与其他肥料配合使用，例如将肥料助剂浓缩10倍后的浓缩液再重新稀释100倍使用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。