阅读说明：本技术 一种利用鱼糜废水回收蛋白制备抗氧化肽方法 (Method for preparing antioxidant peptide by utilizing protein recovered from minced fillet wastewater ) 是由 祁兴普 刘萍 姚芳 刘靖 张静 张军燕 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用鱼糜废水回收蛋白制备抗氧化肽方法,其工艺流程如下：鱼糜清洗废水→过滤→pH值调节→离心沉淀→脱脂→回收蛋白冻干→酶解→膜过滤→真空浓缩→酶解产物冻干→抗氧化活性肽；其中鱼糜废水的回收蛋白质量百分比为2.9～3.2％,用复合风味蛋白酶与中性蛋白酶作为反应酶,并在酶总添加量为3000～5000U的条件下酶解反应3.5～4.2h。本发明以鱼糜加工洗涤用水回收蛋白为底物,通过酶解法制备抗氧化肽,一方面可减少废水排放造成的污染,另一方面可提高加工产品的附加值,并获得一种安全性较高的抗氧化活性肽。而且,本发明的鱼糜废水回收蛋白来源的抗氧化肽具有较强的抗氧化性和热稳定性。(The invention discloses a method for preparing antioxidant peptide by utilizing protein recovered from minced fillet wastewater, which comprises the following process flows of: minced fillet washing wastewater → filtration → pH value adjustment → centrifugal precipitation → degreasing → freeze-drying of recovered protein → enzymolysis → membrane filtration → vacuum concentration → freeze-drying of enzymolysis product → antioxidative peptide; wherein the mass percentage of the recovered protein of the minced fillet wastewater is 2.9-3.2%, the compound flavourzyme and the neutral proteinase are used as reaction enzymes, and the enzymolysis reaction is carried out for 3.5-4.2 h under the condition that the total addition amount of the enzymes is 3000-5000U. The invention uses the protein recovered from the water used for processing and washing minced fillet as the substrate to prepare the antioxidant peptide by an enzymolysis method, thereby reducing the pollution caused by the discharge of waste water, improving the added value of the processed product and obtaining the antioxidant active peptide with higher safety. In addition, the antioxidant peptide from the surimi wastewater recycled protein has stronger oxidation resistance and thermal stability.)

一种利用鱼糜废水回收蛋白制备抗氧化肽方法

技术领域

本发明涉及一种制备生物抗氧化活性肽的方法，具体涉及一种利用鱼糜废水回收蛋白制备抗氧化肽方法，属于水产品加工技术领域。

背景技术

大宗淡水鱼产业技术体系成立以来，全国大宗淡水鱼养殖产量从2009年的1553.18万吨增加到2014年的2008.64万吨，年均增长5.9％^[1]。目前中国淡水鱼除鲜食外，部分如鲢鱼、鳙鱼、草鱼、青鱼等低值淡水鱼被加工成鱼糕、鱼丸、鱼豆腐和鱼香肠等特色鱼糜类产品，深受广大消费者欢迎。但是，这类鱼糜制品加工过程中，需要多次漂洗以去除脂和肌浆蛋白等组分以提高鱼糜品质，漂洗工艺会造成约30％左右的可溶蛋白流失^[2]，浸泡鱼糜废水排放后不仅造成资源浪费，还增加了污水处理负担，直接排放还会严重污染环境。

目前，鱼类加工废水中蛋白质的回收采用方法有沉淀法^[3,4]和膜分离法^[5]，蛋白的回收利用有饲料^[6]、鱼糜制品^[7]、生物活性肽等方面，其中利用水产加工副产物活性肽与与陆生动物蛋白抗氧化肽相比，具有来源更广泛，安全性更高，且结构更新颖，是极具发展前景的功能因子^[8]。

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发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用鱼糜废水回收蛋白制备抗氧化肽方法，该方法不仅可减少废水排放造成的污染，还可提高加工产品的附加值，并获得一种安全性较高的抗氧化活性肽。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用鱼糜废水回收蛋白制备抗氧化肽方法，包括：所述鱼糜废水回收蛋白的质量百分比为2.9～3.2％，用复合风味蛋白酶与中性蛋白酶作为反应酶，并在酶总添加量为3000～5000U的条件下酶解反应3.5～4.5h。

进一步地，所述复合风味蛋白酶与中性蛋白酶的酶活力单位比为1.20:1～1.25:1。

进一步地，所述方法中，酶解条件为pH值为6.2～6.9，温度为48～55℃。

进一步地，一种利用鱼糜废水回收蛋白制备抗氧化肽方法的具体步骤如下：

(1)过滤：将鱼糜废水用纱布过滤，除去鱼鳞、鱼骨和其他固体杂物；

(2)pH值调节：将过滤好的鱼糜废水用酸碱溶液调节至pH值为5.4～6.2，再在0～10℃温度下静置45～60min；

(3)离心沉淀：除去上清液中脂肪成分，保留沉淀粗蛋白；

(4)脱脂：将步骤(3)处理后的鱼糜沉淀物解冻，高速捣碎，将捣碎后的鱼糜与正己烷按照1﹕3的体积比混合，恒温振荡，离心弃去上清液，将脱脂后的鱼糜通风挥发，去除正己烷；

(5)冻干：将步骤(4)处理后的沉淀蛋白预冻至中心温度为25℃，再在绝对压力为80Pa、升华温度为-20℃的条件下冻干，冻干后的回收蛋白粉碎备用；

(6)酶解液的制备：取冻干回收蛋白配制成质量百分比为2.9～3.2％的蛋白悬浊液，并将pH值为调节为6.2～6.9；

(7)酶解：在温度为48～55℃条件下，复合风味蛋白酶与中性蛋白酶的酶活力单位比为1.20:1～1.25:1、酶添总加量为3000～5000U的条件下，酶解3.5～4.5h时；

(8)膜过滤后，取滤过液备用；

(9)浓缩、冻干：将滤过液在75℃、绝对压力为-72KPa的条件浓缩至原来体积的1/10，然后在绝对压力为80Pa，升华温度为-50℃的条件下冻干，冻干产物即为制备的抗氧化肽。

进一步地，所述步骤(2)中，调节后的pH值为5.8；鱼糜废水pH调节后采用间接换热的方法迅速降温至0～10℃。

进一步地，所述步骤(4)中，将步骤(3)处理后的鱼糜冻块解冻至中心温度为-4℃，于高速组织捣碎机中捣碎，将捣碎后的鱼糜与正己烷按照1﹕3的体积比混合均匀，在35℃条件下于恒温水浴振荡器中振荡3h，然后在冷冻离心机中且0℃条件下6000r/min离心10min，弃去上清液，重复以上操作2次，将脱脂后的鱼糜在通风橱中挥发75℃条件下挥发去除正己烷。

鱼糜加工过程中，大量的可溶性蛋白经多次洗涤随废水排放而流失，造成了环境污染和可食用蛋白质损失。本发明的优点在于：本发明以鱼糜(不限定哪种鱼糜，只要是鱼糜即可)加工洗涤用水回收蛋白为底物，通过酶解法制备抗氧化肽，通过该技术的应用，一方面可减少废水排放造成的污染，另一方面可提高加工产品的附加值，并获得一种安全性较高的抗氧化活性肽。而且，本发明的鱼鱼糜废水回收蛋白来源的抗氧化肽具有较强的抗氧化性和热稳定性。

附图说明

图1为不同蛋白酶对鱼糜水解度和酶解产物DPPH清除率的影响(n＝3)；

图2为不同复合酶比例对水解度和产物DPPH自由基清除率的影响(n＝3)；

图3为不同底物浓度对水解度和产物DPPH自由基清除率的影响(n＝3)；

图4为酶添加量对水解度和产物DPPH自由基清除率的影响(n＝3)；

图5为温度和pH值对水解度和产物DPPH自由基清除率的影响(n＝3)：(A)温度对水解度和产物DPPH自由基清除率的影响；(B)pH值对水解度和产物DPPH自由基清除率的影响；

图6为反应时间对水解度和产物DPPH自由基清除率的影响(n＝3)；

图7为2因素交互作用对酶解产物DPPH清除率影响的响应曲面图及等高线图：(a)为底物浓度和酶比例交互作用影响的响应面曲线图；(b)为底物浓度和酶比例交互作用影响的等高线图；(c)为酶添加量和酶比例交互作用影响的响应面曲线图；(d)为酶添加量和酶比例交互作用影响的等高线图；(e)为酶解时间和酶比例交互作用影响的响应面曲线图；(f)为酶解时间和酶比例交互作用影响的等高线图；(g)为酶添加量和底物浓度交互作用影响的响应面曲线图；(h)为酶添加量和底物浓度交互作用影响的等高线图；(i)为酶解时间和底物浓度交互作用影响的响应面曲线图；(j)为酶解时间和底物浓度交互作用影响的等高线图；(k)为酶添加量和酶解时间交互作用影响的响应面曲线图；(l)为酶添加量和酶解时间交互作用影响的等高线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

本实施例的利用鱼糜废水回收蛋白制备抗氧化肽方法的工艺流程如下：鱼糜清洗废水→过滤→pH值调节→离心沉淀→脱脂→回收蛋白冻干→酶解→膜过滤→真空浓缩→酶解产物冻干→抗氧化活性肽。

(1)关于蛋白酶的筛选

在100mL2％的冻干白鲢鱼蛋白液中分别加入等量(3000U/g)的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶，并在各自最佳反应温度和pH条件下反应2h，并在100℃条件下灭酶10min，测定不同蛋白酶制备的酶解液对酶解度和DPPH自由基清除率的影响。

研究表明，制备较高抗氧化活性的多肽往往需要较高的水解度，具有抗氧化作用的肽分子量通常小于3.5KD。如图1所示，复合风味蛋白酶水解度最高，产物抗氧化性能最佳，中性蛋白酶次之。在抗氧化多肽制取过程中，多采用复合酶解法，利用蛋白酶酶切位点的差异，提高酶解效率，制得抗氧化性多肽。本实验选用最适酶解pH和温度接近的复合风味蛋白酶和中性蛋白酶对鱼糜回收蛋白进行酶解，一方面提高酶解效率，利于生产过程的简化，另一方面可避免使用缓冲溶液和金属盐调节pH值而出现产品安全隐患和环境污染。

(2)复合酶比例对水解度和酶解产物DPPH自由基清除率的影响

在100mL 2％的冻干白鲢鱼蛋白液中按照0.3:1、0.6：1、0.9:1、1.2:1、1.5：1、1.8:1的质量比例加入复合风味蛋白酶和中性蛋白酶，总添加量为3000U/g，在pH值为7.0的条件下反应2h,并在100℃条件下灭酶10min，测定不同复合酶比例制备的酶解液对水解度和DPPH自由基清除率的影响。

如图2所示，随着复合风味蛋白酶的比例增加，水解度先缓慢上升，在0.9﹕1至1.5﹕1之间，水解度无显著变化，在1.5﹕1后水解度开始下降。DPPH清除率随复合风味蛋白酶与中性蛋白酶的不同比例呈现先增加后下降，在1.2﹕1时达到最大。相关研究表明：多肽的抗氧化活性与氨基酸组成密切相关，蛋白酶的酶切位点和酶切顺序的不同，可能导致不同组合的蛋白酶水解得到的肽的氨基酸序列的不同，从而影响水解液DPPH自由基清除率，这与水解度变化规律不完全相同。

(3)底物浓度对水解度和酶解产物DPPH自由基清除率的影响

在100mL 0.5％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％和4.5％(质量百分比)的冻干白鲢鱼蛋白液中分别加入3000U胃蛋白酶和木瓜蛋白酶(酶活单位比为1.2﹕1)，并在50℃和pH为7.0的条件下反应2h，并在100℃条件下灭酶10min，测定不同底物浓度制备的酶解液对酶解度和DPPH自由基除率的影响。

如图3所示，随着底物浓度增加，水解度先增加后降低，DPPH清除率先增加后无显著变化，这是由于随着底物浓度增加，酶分子与底物的结合已达到饱和，同时体系黏度增加，不利于酶与底物充分接触，体系的酶解产物总量未显著增加，从而导致水解度下降，DPPH清除率无显著的变化。因此初步选择底物浓度为2.5％左右。

(4)酶添加量对水解度和酶解产物DPPH自由基清除率的影响

分别在100mL 2.5％的冻干白鲢鱼蛋白液中分别加入1500、2000、2500、3000、3500、4000和4500U的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶(酶活单位比为1.2﹕1)，并在50℃和pH为7.0的条件下反应2h，并在100℃条件下灭酶10min，测定不同酶添加量制备的酶解液对水解度和DPPH自由基除率的影响。

如图4所示，在酶添加量小于3500U时，底物充足，随酶添加量的增加，水解度显著增加，DPPH清除率随之增加，当酶添加量超过3500U时，因底物与酶充分结合，故水解液水解度和DPPH清除率无显著增加，因此，酶添加量初步定为3500U左右。

(5)温度、pH值对水解度和酶解产物DPPH自由基清除率的影响

分别在100mL 2.5％的冻干白鲢鱼蛋白液中分别加入3000U胃蛋白酶和木瓜蛋白酶(酶活单位比为1.2﹕1)，并分别在pH为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2和温度为42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃的条件下反应2h，并在100℃条件下灭酶10min，分别测定不同pH值和温度制备的酶解液对水解度和DPPH自由基除率的影响。

如图5(A)、(B)所示，当水解pH值为6.6、温度为52℃时，在复合风味蛋白酶和中性蛋白酶的共同作用下，回收鱼糜蛋白的水解度和DPPH清除率最大，因此，选择pH值为6.6、温度为52℃为最适反应pH和温度。

(6)反应时间对水解度和酶解产物DPPH自由基清除率的影响

分别在100mL 2.5％的冻干白鲢鱼蛋白液中分别加入3000U胃蛋白酶和木瓜蛋白酶(酶活单位比为1.2﹕1)，并在52℃和pH为6.6的条件下分别反应1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0h，并在100℃条件下灭酶10min，分别测量不同反应时间制备的酶解液对酶解度和DPPH自由基除率的影响。

如图6所示，随着水解时间的增加，水解度和DPPH自由基清除率增加，当水解3小时以后水解度和DPPH自由基清除率无显著增加，这可能是由于底物已经被完全消耗或底物分解出抑制酶解进程的产物。因此，选取3.5h左右为最佳酶解时间。

(7)响应面试验

(7.1)响应面分析方案及结果

综合单因素试验结果，根据Box-Behnken设计原理，选取酶比例(X1)、底物浓度(X2)、酶添加量(X3)和酶解时间(X4)作为自变量，DPPH清除率作为因变量，设计4因素3水平响应面实验，共计29组试验点，其中5组中心试验点，结果见表1，回归模型的方差分析见表2。

表1Box-Behnken试验设计及结果

利用Design-Expert V8.0.6软件对表2试验数据进行分析，得到回归模型方程为：DPPH清除率＝83.98731X₁+114.6322X₂+0.04857X₃+22.19596X₄+3.30142X₁X₃-0.92671X₁X₄-0.00170284X₂X₃+0.41702X₂X₄+0.00038227X₃X₄-33.74783X₁X₂-18.01358X₂X₂-0.0000048166X₃X₂-2.88744X₄X₂-310.14595

回归方程的方差分析见表2，回归模型的极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P＝0.0656>0.05)，表示模型预测值与实测值误差较小，模型较可靠；模型相关系数R²＝0.9980,说明该模型具有很好的精密度；模型矫正决定系数R² _Adj＝0.9960，说明该模型能解释99.80％响应值的变化，该模型与实际试验的拟合程度好，可利用该模型对鱼糜废水回收蛋白的酶解活性抗氧化肽酶解条件进行优化；R² _Pred为0.9890说明该模型预测性良好，能很好地预测酶解条件对鱼糜废水回收蛋白的酶解抗氧化肽活性的影响。

表2回归模型方差分析

注：“**”表示极显著(P＜0.001)。

(7.2)响应面因素间的交互作用分析

通过对回归模型进行响应面分析，如图7所示，得到将任意2个因素固定在零水平，另外2个因素及其交互作用影响的响应面曲线图及对应的等高线图。响应面坡度表示该因素对因变量影响强弱的关系，曲面越陡峭，影响越显著；等高线表示各因素交互作用强弱，椭圆形表示因素交互作用显著，圆形表示因素交互作用不显著；同一等高线图中，密度越大的因素对响应值的影响大于等高线密度小的因素。由图7可知，X3>X2>X1>X4，既酶添加量>底物浓度>酶比例>酶解时间。

实施例1：本实施例利用鱼糜废水回收蛋白制备抗氧化肽方法，步骤如下：

(1)过滤：将鱼糜废水用双层纱布过滤，除去细小的鱼鳞、鱼骨和其它固体杂物。在获取取鱼糜废水时，应注意将加工过程中鱼糜清洗废水与工器具洗涤、消毒及其他原辅料清洗用水分流，防止有害物质引入和降低鱼糜废水中蛋白质浓度降低。

(2)pH值调节：用HCl、NaOH溶液调节将过滤好的鱼糜废水溶液，pH范围为：5.4～6.2，在0～10℃温度下然后静置45～60min。

鱼糜废水pH调节后应采用间接换热的方法迅速降温至0～10℃，防止因高温导致其腐败变质，其最佳pH值为5.8。

(3)离心沉淀：将静置后的过滤液在2000r/min的条件下离心15min，除去上清液中脂肪成分，保留沉淀粗蛋白。

(4)脱脂：将步骤(3)处理后的鱼糜冻块解冻至中心温度为-4℃，于高速组织捣碎机中捣碎，将捣碎后的鱼糜与有机溶剂(优选的是正己烷)按照1﹕3的比例(体积比)混合均匀，在35℃条件下于恒温水浴振荡器中振荡3h，然后在冷冻离心机(0℃)中，6000r/min离心10min，弃去上清液，重复以上操作2次。将脱脂后的鱼糜在通风橱中挥发75℃条件下挥发去除正己烷。

(5)冻干：将沉淀蛋白在铺在冻干盘上，厚度约10mm，在超低温冰箱中预冻至中心温度为25℃，然后在绝对压力为80Pa，升华温度为-20℃的条件下冻干，冻干后的回收蛋白粉碎备用。

(6)酶解液的制备：取冻干回收蛋白配制成浓度(质量百分比)为2.9～3.2％(底物浓度)的蛋白悬浊液，并将pH值为调节为6.2～6.9。

(7)酶解：在温度为48～55℃条件下，复合风味蛋白酶与中性蛋白酶比例(酶活力单位比)为1.20:1～1.25:1、酶添总加量为3000～5000U的条件下，酶解3.5～4.5h。

(8)膜过滤：将酶解结束的酶解液用3000KD的膜进行过滤，取滤过液备用。

(9)浓缩、冻干：将滤过液在75℃、绝对压力为-72KPa的条件浓缩至约为原来体积的1/10，然后然后在绝对压力为80Pa，升华温度为-50℃的条件下冻干，冻干产物即为制备的抗氧化肽。

经实验测定验证，本实施例制备抗氧化肽的分子量小于3000KD，得率可达93.6％，其具有较强的抗氧化性，对羟自由基清除率、DPPH自由基除率、过氧化氢清除率、亚铁离子还原力等各抗氧化指标的半数效应浓度IC50分别为2.16、2.74、4.41、3.88mg/mL。

此外，本实施例制备的抗氧化肽具有较强的热稳定性，在小于60℃条件下保温2h，其抗氧化活性无显著变化，在100℃条件下保温2h其抗氧化活性可保持原来的87.3％。

结果表明，本实施例制备的鱼糜废水回收蛋白来源的抗氧化肽具有较强的抗氧化性和热稳定性。

实施例2：具体实施步骤如实施例1，其中(2)、(6)和(7)步骤参数如下：

(2)pH值调节：用HCl、NaOH溶液调节将过滤好的鱼糜废水溶液，pH范围为：5.4，在0～10℃温度下然后静置45～60min。

(6)酶解液的制备：取冻干回收蛋白配制成浓度(质量百分比)为2.9％的蛋白悬浊液，并将pH值为调节为6.2。

(7)酶解：在温度为48℃条件下，复合风味蛋白酶与中性蛋白酶比例(酶活力单位比)为1.20:1、酶添总加量为3000U的条件下，酶解3.5～4.5h。

实施例3：具体实施步骤如实施例1，其中(2)、(6)和(7)步骤参数如下：

(2)pH值调节：用HCl、NaOH溶液调节将过滤好的鱼糜废水溶液，pH范围为：5.8，在0～10℃温度下然后静置45～60min。

(6)酶解液的制备：取冻干回收蛋白配制成浓度(质量百分比)为3.2％的蛋白悬浊液，并将pH值为调节为6.9。

(7)酶解：在温度为48℃条件下，复合风味蛋白酶与中性蛋白酶比例(酶活力单位比)为1.25:1、酶添总加量为5000U的条件下，酶解3.5h。

实施例4：具体实施步骤如实施例1，其中(2)、(6)和(7)步骤参数如下：

(2)pH值调节：用HCl、NaOH溶液调节将过滤好的鱼糜废水溶液，pH范围为：6.2，在0～10℃温度下然后静置45～60min。

(6)酶解液的制备：取冻干回收蛋白配制成浓度(质量百分比)为3.0％的蛋白悬浊液，并将pH值为调节为6.6。

(7)酶解：在温度为52℃条件下，复合风味蛋白酶与中性蛋白酶比例(酶活力单位比)为1.23:1、酶添总加量为4000U的条件下，酶解4h时。

实施例5：具体实施步骤如实施例1，其中(2)、(6)和(7)步骤参数如下：

(2)pH值调节：用HCl、NaOH溶液调节将过滤好的鱼糜废水溶液，pH为：6.0，在0～10℃温度下然后静置45～60min。

(6)酶解液的制备：取冻干回收蛋白配制成浓度(质量百分比)为3.15％(底物浓度)的蛋白悬浊液，并将pH值为调节为6.2～6.9。

(7)酶解：在温度为55℃条件下，复合风味蛋白酶与中性蛋白酶比例(酶活力单位比)为1.22:1、酶添总加量为35000U的条件下，酶解4.2h。

以上所述仅为本发明的优选例实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。