阅读说明：本技术 鱼类诺卡氏菌病共同抗原dna疫苗及其制备和应用 (Fish Nocardia disease common antigen DNA vaccine and preparation and application thereof ) 是由 鲁义善 夏立群 陈建林 王文基 李贝 于 2019-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了鱼类诺卡氏菌病共同抗原DNA疫苗及其制备和应用,制备方法包括：运用双向电泳技术,比较这三种鱼类诺卡氏菌的免疫印迹结果,根据等电点和分子量筛选共同免疫印迹蛋白点；根据共同抗原的等电点和分子量大小,切下相应的蛋白点进行质谱分析及N端测序；结合质谱分析和蛋白测序,鉴定出共同抗原的编码基因；根据共同抗原编码基因,以及反向疫苗学预测的疫苗候选共同抗原的编码基因,两者相互印证后选定共同抗原候选基因；根据共同抗原候选基因的序列设计引物,克隆到载体中,获得真核表达重组质粒。本发明制备的DNA疫苗对鱼类诺卡氏菌病有不同程度的防治作用。(The invention provides a fish Nocardia disease common antigen DNA vaccine and preparation and application thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: comparing the immunoblotting results of the three fish Nocardia by using a two-dimensional electrophoresis technology, and screening common immunoblotting protein points according to the isoelectric points and the molecular weights; according to the isoelectric point and the molecular weight of the common antigen, cutting off the corresponding protein point for mass spectrometry and N-terminal sequencing; identifying coding genes of the common antigen by combining mass spectrometry and protein sequencing; selecting common antigen candidate genes after mutual verification according to the common antigen encoding genes and encoding genes of vaccine candidate common antigens predicted by reverse vaccinology; designing a primer according to the sequence of the common antigen candidate gene, and cloning the primer into a vector to obtain the eukaryotic expression recombinant plasmid. The DNA vaccine prepared by the invention has prevention and treatment effects on fish nocardiosis in different degrees.)

鱼类诺卡氏菌病共同抗原DNA疫苗及其制备和应用

技术领域

本发明涉及疫苗领域，更具体地，涉及鱼类诺卡氏菌病共同抗原DNA 疫苗及其制备和应用。

背景技术

鱼类诺卡氏菌病是池塘养殖、浮筏式网箱养殖和深水网箱养殖模式中的常见细菌性感染病害之一，属于一种慢性、系统性、肉芽肿疾病，俗称“结节病”。迄今为止，分离得到的鱼类诺卡氏菌病致病菌包括三种：鰤鱼诺卡氏菌(N.seriolae)、星形诺卡氏菌(N.asteroides)和杀鲑诺卡氏菌(N. salmonicida)。鱼类诺卡氏菌广泛分布于土壤、海洋、河流、活性淤泥、动物的***物以及腐烂的植被当中，对免疫力低下、体质虚弱的鱼类，可通过饵料、鳃或伤口等进行感染，诱发鱼体体表出血溃烂和内脏器官布满大量白色结节。据某些鱼类的研究分析，感染诺卡氏菌病的鰤鱼呈现体表出血，唇部糜烂，腹部具肉芽肿性***与肝脏、脾脏、肾脏与心脏布满白色结节；而有些患病鱼类，如五条鰤，体表呈现凹凸、脱皮出血、脓疡，内脏器官(如：肾脏、脾脏和肝脏)具有大量大型结节，其中部分患病鱼体仅在鳃部会出现小型结节病症；又有些患病鱼类，如缟鯵，瘤状小突起和半球状的膨隆呈现于体表，无数粟粒状结节布满于脾脏和肾脏，亦见部分患病鱼体的腰椎椎体之间形成脓疡。鱼类诺卡氏菌(N.seriolae)致病菌感染周期较长，早期感染一般处于隐性症状，极难被发现；典型症状和危害的出现一般发生在成鱼期。患病鱼体一般表现体表易被蹭伤出血、反应速度变慢、游泳平衡性变差，再到体表与内部器官出现白色结节、结节样脓疮等症状，最终出现死亡现象。鱼类诺卡氏菌在全球水产养殖业中广泛流行，能够感染多种淡水与海水鱼类，是韩国地区养殖的乌鳢(Channa argus)；日本地区养殖鰤鱼(Seriola quinqueradiata)；欧美地区养殖的大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)；中国台湾地区养殖的斑鳢(C.maculata)、花身鯻(Terapon jarbua)、大口黑鲈(Micropterus salmoides) 以及中国大陆地区养殖的加州鲈(Micropterus salmoides)、招财鱼 (Osphronemus goramy)、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)、大黄鱼 (Larimichthys crocea)、乌鳢(C.argus)和斑鳢(C.maculata)等最主要的细菌性感染病原之一。鱼类诺卡氏菌病已成为多种鱼类产业化养殖道路上的绊脚石，造成全球水产养殖业的经济损失日益严重。

传统意义上，在水产养殖中一般采用针对致病菌具有敏感性的抗生素来治疗与预防鱼类细菌性感染疾病。鱼类诺卡氏菌属于兼性胞内寄生菌，感染鱼体后会被巨噬细胞吞噬但不被杀灭，藏匿于患病鱼体的结节当中，药物无法有效进入结节对其杀灭；并且抗生素的滥用问题日益严重，造成一系列不可逆转的影响，例如环境污染、水体退化与益生菌群失衡以及鱼体药物残留等。因此，为避免上述问题的产生，且能有效控制鱼类诺卡氏菌病的发生与流行，研制出高效环保的疫苗刻不容缓。迄今为止，针对鱼类诺卡氏菌病疫苗的研发进程不甚理想。相关的研究表明鰤鱼诺卡氏菌的多种灭活疫苗，虽然可以提高血清凝集抗体效价，但攻毒后基本不能提供任何免疫保护作用，因此鰤鱼诺卡氏菌灭活疫苗的开发路线丧失了可行性。鰤鱼诺卡氏菌灭活疫苗不具免疫保护的机理尚不明确，可能是由于鱼类致病诺卡氏菌本身就存在一种类似于抗原变异的免疫逃避机制。Itano等人用诺卡氏菌属的几种非致病性菌作为活疫苗，能对鰤鱼诺卡氏菌攻毒产生一定的保护率，但其相对保护率最高仅为65.4％，尚不具备实际应用价值，这或许是因为鱼类致病诺卡氏菌和其近缘无毒种的天然抗原差异较大。总体而言，目前鱼类诺卡氏菌病的疫苗研究陷入困境。因此，利用现代分子生物学技术制备高效安全的新型疫苗是非常有必要的，这代表了当今国际水产业发展的前沿与趋势。

发明内容

本发明提供了鱼类诺卡氏菌病三种致病菌共同抗原DNA疫苗，该疫苗对鱼类具有显著地免疫保护效果，能够有效地预防鱼类诺卡氏菌病的侵害。该疫苗操作简便，使用安全，效果显著，具有实际的商品开发应用价值。

本发明提供了一种鱼类诺卡氏菌病的DNA疫苗的制备方法，所述制备方法包括：运用双向电泳技术，分别对鰤鱼诺卡氏菌、星状诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌进行全菌蛋白电泳，比较这三种鱼类诺卡氏菌的免疫印迹结果，根据等电点和分子量筛选共同免疫印迹蛋白点，共同免疫印迹蛋白点为共同抗原；分别进行这三种诺卡氏菌的全菌蛋白双向电泳，考马斯亮蓝染色后在电泳胶上根据共同抗原的等电点和分子量大小，切下相应的蛋白点进行质谱分析及N端测序；结合质谱分析和蛋白测序，鉴定出共同抗原的编码基因；根据共同抗原编码基因，以及反向疫苗学预测的疫苗候选共同抗原的编码基因，两者相互印证后选定共同抗原候选基因；根据共同抗原候选基因的序列设计引物，克隆到载体中，获得真核表达重组质粒。

在上述制备方法中，还包括：培养含真核表达重组质粒的工程菌种，大量提取去内毒素的重组质粒。

本发明还提供为了通过上述制备方法得到的鱼类诺卡氏菌病的DNA 疫苗。

本发明还提供了鱼类诺卡氏菌病的DNA疫苗在防治鱼类诺卡氏菌病中的应用。

本发明制备的共同抗原DNA疫苗对鱼类具有显著地免疫保护效果，能够有效地预防鱼类诺卡氏菌病的侵害。

附图说明

图1示出了鱼类诺卡式菌病三种致病菌全菌蛋白双向电泳与免疫印迹图谱，其中，A,C,E分别为鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌和星状诺卡氏菌全菌蛋白2D SDS-PAGE电泳图；B,D,F分别为鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌和星状诺卡氏菌全菌蛋白2D wsstern blot印迹图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买所得。

DNA疫苗是继传统疫苗(减毒活疫苗、灭活疫苗)及基因工程亚单位疫苗之后的新型疫苗，该技术将编码某种抗原蛋白质的外源基因重组真核表达质粒，直接注射到动物体内，依赖宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，刺激机体免疫应答，从而达到治疗的效果。相对于传统疫苗存在致病菌毒力返强或灭活不完全的安全性问题与亚单位疫苗免疫原性低和生产成本高的缺陷，DNA疫苗具有生产成本低廉、可与其它免疫原组成多价疫苗、可诱导机体产生强烈而持久的体液免疫和细胞免疫、具有良好的安全性等独特的优势，同时接种途径较为多样化，其既能采用注射方式接种，亦能口服、喷雾接种等。此外，DNA疫苗具有免疫剂量低、持续时间长等优点，接种一次机体便能获得长效免疫保护，无需反复多次加强免疫。因此，鰤鱼诺卡氏菌DNA疫苗的研制对于鱼类诺卡氏菌病的防治具有重要的意义。

本发明的目标为筛选鱼类诺卡氏菌病三种致病菌(鰤鱼诺卡氏菌、星状诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌)全菌蛋白共同抗原并制备DNA疫苗。

本发明所采用的技术方案：

1.鰤鱼诺卡氏菌、星状诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌共同抗原的筛选和鉴定

a.运用双向电泳技术，分别对鰤鱼诺卡氏菌、星状诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌进行全菌蛋白电泳，将电泳胶转膜后，分别用鰤鱼诺卡氏菌特异性抗体为一抗，进行Westernblot；比较3种鱼类诺卡氏菌的免疫印迹结果，根据等电点和分子量筛选共同免疫印迹蛋白点(共同抗原)。

b.在相同条件下分别进行3种诺卡氏菌的全菌蛋白双向电泳，考马斯亮蓝染色后在电泳胶上根据共同抗原的等电点和分子量大小，切下相应的蛋白点进行质谱分析及N端测序。

c.根据鰤鱼诺卡氏菌全基因组测序数据库(Accession number NZ_JNCT01000022)，结合质谱分析和蛋白测序，鉴定出共同抗原的编码基因。

2.核酸疫苗候选基因的选定、克隆与表达

a.根据鰤鱼诺卡氏菌全基因组序列信息，运用反向疫苗学分析方法，对疫苗候选共同抗原进行预测和筛选。

b.根据共同抗原编码基因，以及反向疫苗学预测的疫苗候选共同抗原的编码基因，两者相互印证后选定共同抗原候选基因。根据这些候选基因的序列设计引物，克隆到pcDNA 3.1-FLAG载体，获得真核表达重组质粒。

3.核酸疫苗的研制及免疫原性评价

a.培养含真核表达重组质粒的工程菌种，大量提取去内毒素的重组质粒，制备共同抗原DNA疫苗，采用肌肉注射方式免疫杂交鳢。

b.各组DNA疫苗免疫杂交鳢35d后，采用腹腔注射方式接种鰤鱼诺卡氏菌野生株，持续观察14d，统计死亡尾数，计算免疫保护率。

下面描述具体的实施方式以使本领域技术人员更好地理解本发明。

实验材料

(一)菌株

鰤鱼诺卡氏菌野生株(N.seriolae strain ZJ0503)分离于阳江网箱养殖患病卵形鲳鲹(T.ovatus)，储藏在广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室。相关文章发表于L.Xia,J.Cai,B.Wang,et al.Draft genome sequence of Nocardia seriolaeZJ0503,a fish pathogen isolated from Trachinotus ovatus in China[J].Genomeannouncements,3(2015).

星形诺卡氏菌N.asteroids购于中国微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为ATCC19247。

杀鲑诺卡氏菌N.salmonicida购于中国微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为ATCC27463。

(二)试剂

(1)改良培养基：

高温高压灭菌，加入2％琼脂变固体改良培养基。

(2)裂解液(Lysis buffer)：

-20℃储存(二硫苏糖醇、IPG缓冲液、蛋白酶抑制剂和核酶抑制剂现用现加)

(3)洗涤液(Wash buffer)：

(4)4×分离胶缓冲液(4× Tris-HCL)：

(5)10％SDS溶液：

十二烷基硫酸钠SDS 15g

ddH₂O 150mL

用于配制10×电泳缓冲液和SDS平衡缓冲液

(6)10×电泳缓冲液：

室温保存(再稀释成1×电泳缓冲液，用于配制琼脂糖密封液)

(7)SDS平衡缓冲液：

-20℃保存，分装成10mL/管，共20管；

使用之前加1％DDT和2.5％的碘乙酰胺Iodoacetamide

(8)琼脂糖密封液：

1×电泳缓冲液 50mL

琼脂糖Agarose 0.25g

1％溴酚蓝Bromophenol blue 100μL

常温保存；分装成1mL/管，共50管。

(9)水化液：

IPG、DTT最后添加。最后分装成500ul/管，共10管。

(10)蛋白固定液：

冰醋酸Acetic Acid 100mL

甲醇Methanol 400mL

ddH₂O 至1000mL

(11)考马斯亮蓝染液：

(13)Anti-N.serioale antibody鰤鱼诺卡氏菌兔多克隆抗体(一抗), 由本实验室委托上海友科生物科技有限公司制备，制备方法为常规方法，简述如下：将鰤鱼诺卡氏菌培养至对数期后，在培养液中加入终浓度4％甲醛、4℃震荡孵育使鰤鱼诺卡氏菌灭活。灭活后菌体进行2-3次离心收集、 PBS清洗，并加入适量PBS制成菌悬液。使用鰤鱼诺卡氏菌菌悬液免疫新西兰白兔，每只兔子免疫4-5次、每次免疫间隔1-2周。处死兔子后分离血清，获得鰤鱼诺卡氏菌兔多克隆抗体(一抗)。通过灭活菌抗原即能够制备该一抗。

(14)HRP-标记的羊抗兔IgG(二抗)武汉博士德生物工程有限公司。

(15)全菌蛋白提取试剂盒2D Clean up Kit与全菌蛋白纯化试剂盒2D Quant Kit购于美国通用电器公司医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Science)。

实施例1鰤鱼诺卡氏菌、星状诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌共同抗原筛选与鉴定

(一)鱼类诺卡氏菌病三种致病菌全菌蛋白的制备

(1)于-80℃冰箱取出鰤鱼诺卡氏菌野生株、星形诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌甘油保存菌液，置于37℃恒温水浴锅融化，吸取100μL菌液涂布于改良固体培养基，置于28℃恒温培养箱中，培养48h将其复苏；挑取单菌落制备菌悬液，涂布接种于改良固体培养基，大量培养，待细菌达对数生长期收集菌体。

(2)鰤鱼诺卡氏菌野生株、星形诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌三种致病菌均为革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，使用1mg/mL溶菌酶分别预处理2h、3h 和2h。处理完毕使用灭菌PBS溶液洗涤三次。

(3)分别吸取溶菌酶处理后的1mL菌液至1.5mL离心管中，4℃ 7000r/min离心5min；弃上清，取沉淀。

(4)Wash buffer重悬三次，每次4℃7000r/min离心5min；弃上清，取沉淀。

(5)配制Lysis buffer。蛋白酶抑制剂、核酶抑制剂、IPG与DTT分别占整个Lysisbuffer体系的1％。

(6)取1mL Lysis buffer溶液加入沉淀中重悬。

(7)置于冰上裂解处理2h。

(8)裂解处理完全后，4℃13000r/min离心1h，吸取上清，-80℃保存(上清液即蛋白样品)。

(二)诺卡氏菌全菌蛋白纯化

采用2D Clean-Up Kid试剂盒对鰤鱼诺卡氏菌、星形诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌三种致病菌全菌蛋白进行纯化，所有步骤均在冰上处理，具体操作步骤参考试剂盒说明书。

(三)全菌蛋白浓度测定

采用2D Quant Kid试剂盒测定鰤鱼诺卡氏菌、星形诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌三种致病菌全菌蛋白纯化后的全菌蛋白浓度，具体操作步骤参考试剂盒说明书。分别将各组全菌蛋分配成相等的两份样品，保证各组试验是由相同的蛋白样品呈现出SDS-PAGE凝胶与Western Blot NC膜结果。

(四)一向等电聚焦(IEF)电泳

(1)根据蛋白质浓度测算出需要添加蛋白体积(蛋白总含量为120μg)，在蛋白溶液加入相应的水化液(用时配制水化液，加入1％的DTT；水化液体积＝125μL-蛋白质体积)，再加入6.25μL IPG，加入1.25μL蛋白酶抑制剂Protease Mix。

(2)将所有混合后的样品加入电泳槽，覆盖上胶条，去除气泡，使蛋白溶液均匀铺开，吸取1.5mL左右甘油覆盖胶条。

(3)将上样后的胶条置于Ettan IPGphorⅢ水平电泳仪20℃水化12h；随后按照程序(S100V 1h，S200V 1h，S500V 1h，G1000V 1h，G10000V 3h， S10000V 8h)进行一向等电聚焦(IEF)电泳。电泳完成，迅速取出IPG胶条，先置于平衡液A(20mL SDS平衡缓冲液中加入0.2g DTT)平衡15min 后，再将胶条置于平衡液B(20mL SDS平衡缓冲液加入0.5g碘乙酰胺)平衡15min。

(五)二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳

将平衡好的胶条上样至SDS-PAGE分离胶凝胶，吸取100μL琼脂糖封闭液覆盖胶条，排除气泡，待其凝固转移至垂直电泳槽，按照程序(90V 30 min，120V 120min)进行第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳。

(六)免疫印迹(Western blot)试验

聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳完成后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒，打开电转印夹，每侧垫上一块转膜液浸润的专用海绵垫，再各放一块转膜液浸润的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸)，将SDS-PAGE 凝胶平铺在阴性侧滤纸并将转膜液浸润的硝酸纤维素NC膜覆盖凝胶之上，去除气泡，最后依次加入滤纸和海绵，夹紧转移至转印槽，按照程序(150 mA,120min)进行转印。转印完成，将NC膜置于封闭液室温封闭1h；加入一抗(1：2000)室温孵育2h；洗膜液洗涤4次，每次10min；加入二抗(1：5000)室温孵育1h；洗膜液洗涤4次，每次10min；采用DAB试剂曝光显影。

(七)考马斯亮蓝染色

聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳完成后，将SDS-PAGE凝胶置于蛋白固定液，水平摇晃固定30min，固定完毕将固定液倒出，加入考马斯亮蓝染色四个小时以上。将考马斯亮蓝染色液小心倒出，换脱色液进行脱色，直至SDS-PAGE凝胶背景清晰，蛋白点突显。

(八)免疫印迹共同蛋白点筛选

通过蛋白凝胶电泳扫描仪Image Scanner III对SDS-PAGE凝胶与 Western blotNC膜进行图像扫描，光学分辨率为300dpi。采用ImageMaster 2D Elite 5.0分析鰤鱼诺卡氏菌野生株、星形诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌三种致病菌的电泳图谱和转印图谱。

鰤鱼诺卡氏菌野生株、星形诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌三种致病菌全蛋白经过第一向等电聚焦电泳(IEF)与第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) 电泳试验，大部分蛋白点分布于等电点4-7与分子量20-100kDa之间(图 1中的A、C、E所示)。通过Western bolt试验，分别在三种致病菌全菌蛋白硝酸纤维素(NC)膜上共发现11个相同的免疫印迹位点(图1中的B、D、F所示)。分别在三种致病菌的SDS-PAGE凝胶上扣取11个相同的免疫印迹蛋白点送至深圳市微纳菲生物技术有限公司进行质谱鉴定。

(九)数据库分析

运用反向疫苗学，根据质谱鉴定结果，结合鰤鱼诺卡氏菌N.seriolae stainZJ0503全基因组序列和在线比对NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析。结果表明分别扣取的11个等电点与蛋白分子量相同位点的蛋白样品中，具有7个相同的抗原蛋白，分别为1号点：分子伴侣DnaK(Molecular chaperone DnaK，DnaK)、2 号点：分子伴侣GroEL(Molecular chaperone GroEL，GroEL)、3号点： 30S核糖体蛋白S1(30S ribosomal protein S1，RpsA)、6号点：TerD家族蛋白(TerD family protein，TerD)、8号点：FHA结构域蛋白(FHA domain-containing protein，FHA)、9号点：50S核糖体蛋白L7/L12(50S ribosomal protein L7/L12，RplL)和10号点：PspA/IM30家族蛋白(PspA/IM30 family protein，PspA)。

实施例2候选基因真核表达载体构建

(一)引物设计

根据鰤鱼诺卡氏菌N.seriolae strain ZJ0503全基因组(Accession number:JNCT01000019)中GroEL、RpsA、DnaK、TerD、FHA、RplL和 PspA基因的序列和真核表达质粒pcDNA 3.1-FLAG的MCS酶切位点，利用Primer premier 5.0软件设计出用于构建真核过表达质粒的引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。GroEL、RpsA、DnaK、TerD、FHA、RplL和PspA基因的序列分别如序列表第29-35个序列所示，它们对应的蛋白序列分别如序列表第36-42个序列所示。

表1

注：下划线部分为限制性酶切位点。

(二)7个共同抗原候选基因克隆、双酶切、连接与转化

利用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)提取鰤鱼诺卡氏菌N. seriolaestrain ZJ0503总基因组作为PCR扩增模板，采用高保真聚合酶进行 PCR扩增。反应体系和扩增程序具体如下：

PCR退火温度分别为GroEL：66.7℃、RpsA：67.5℃、DnaK：71.4℃、 TerD：66.85℃、FHA：66.9℃、RplL：63.9℃和PspA：64.1℃。分别将7个候选基因的PCR产物通过1％琼脂凝胶电泳检测，确定目的条带大小。PCR产物经DNA片段纯化试剂盒纯化后，与质粒pcDNA 3.1-FLAG 进行双酶切后16℃连接。连接产物转化入大肠杆菌DH5α。经菌落PCR 鉴定后，将阳性克隆进行测序分析。构建成功的重组表达载体分别命名为 pcDNA-DnaK、pcDNA-GroEL、pcDNA-RpsA、pcDNA-TerD、pcDNA-FHA、 pcDNA-RplL和pcDNA-PspA。

双酶切、连接与转化具体操作参照相应试剂盒说明书进行。

实施例3DNA疫苗的制备及其免疫保护效果评价

(一)鰤鱼诺卡氏菌攻毒杂交鳢LD₅₀计算

培养鰤鱼诺卡氏菌野生株N.seriolae strain ZJ0503，制备菌液，将鰤鱼诺卡氏菌原液用灭菌PBS溶液依次进行10倍梯度稀释，设置7组不同浓度菌液，分别为1×10³CFU/mL、1×10⁴CFU/mL、1×10⁵CFU/mL、1×10⁶ CFU/mL、1×10⁷CFU/mL、1×10⁸CFU/mL和1×10⁹CFU/mL。

将健康杂交鳢随机分配至0.1m³养殖桶进行饲养，每桶10尾，共30 桶。分别吸取7组不同浓度的鰤鱼诺卡氏菌菌液，采用腹腔注射方式感染杂交鳢，每组10尾，每尾100μL；同时注射等剂量PBS溶液作为空白对照组；每个浓度菌液和空白对照组设置3个平行小组。连续观察14d后统计各组死亡数，用于鰤鱼诺卡氏菌感染杂交鳢LD₅₀的计算。

根据不同浓度鰤鱼诺卡氏菌感染杂交鳢死亡率统计结果，利用统计学软件SPSS21.0计算鰤鱼诺卡氏菌感染乌斑杂交鳢的半致死剂量(LD₅₀)为 3.31×10⁵CFU/尾。

(一)DNA疫苗制备

分别将7种真核重组表达载体菌pcDNA-DnaK/BL21、 pcDNA-GroEL/BL21、pcDNA-RpsA/BL21、pcDNA-TerD/BL21、 pcDNA-FHA/BL21、pcDNA-RplL/BL21、pcDNA-PspA/BL21和空质粒菌 pcDNA 3.1-FLAG/BL21分别接种于含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床200r/min振荡培养8-10h，待菌液浓度OD₆₀₀达2.0-3.0时，停止振荡。将菌液加入50mL离心管中，离心机8000r/min 离心1min收集菌体(菌液较多可分几次进行离心收集菌体)。使用E.Z.N.A@ Fastfiler Endo-free Plasmid Maxiprep试剂盒大量提取无内毒素真核表达重组质粒，具体操作参照试剂盒说明书。分别将8种无内毒素质粒稀释成浓度为250μg/mL，用于后续免疫杂交鳢试验。

(三)DNA疫苗免疫杂交鳢

将杂交鳢鱼苗分配到0.5m³的养殖桶中饲养，共27桶，每桶饲养50 尾。分别吸取100μL无内毒素真核表达重组质粒，以背鳍肌肉注射的方式免疫杂交鳢，分别命名为pcDNA-DnaK、pcDNA-GroEL、pcDNA-RpsA、 pcDNA-TerD、pcDNA-FHA、pcDNA-RplL、pcDNA-PspA和空质粒pcDNA 3.1-FLAG组；同时注射等剂量PBS溶液的杂交鳢作为空白对照组。实验组与对照组分别设置3个平行小组，每小组注射50尾杂交鳢。

(四)杂交鳢体内GroEL、RpsA、DnaK、TerD、FHA、RplL和PspA 基因表达检测

分别于DNA疫苗免疫杂交鳢的第7和35d，每组随机取3尾杂交鳢进行组织取样。无菌操作取杂交鳢肌肉、肝脏、脾脏和头肾(组织样品大小约0.2cm×0.2cm×0.2cm)组织样品置于含1mL RNAlater溶液的 1.5mL离心管，置于4℃过夜使RNAlater溶液充分固定组织样品，-80℃保存，以备提取RNA，用于RT-PCR检测DNA疫苗目的基因。

采用EasyPure RNA Kit试剂盒提取RNA组织样品(肌肉、肝脏、脾脏和头肾)。采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒将杂交鳢组织样品RNA反转录成cDNA，作为 RT-PCR检测模板。RT-PCR反应引物、体系与程序参照“实施例2”。

为确定所构建的pcDNA-DnaK、pcDNA-GroEL、pcDNA-RpsA、 pcDNA-TerD、pcDNA-FHA、pcDNA-RplL、pcDNA-PspA真核表达重组质粒在杂交鳢组织中的表达情况，在注射重组质粒的第7、35d对各组实验鱼的肌肉、肝脏、脾脏与头肾组织进行RT-PCR检测，琼脂糖凝胶电泳均能发现与目的基因GroEL、RpsA、DnaK、TerD、FHA、RplL和PspA大小相符的条带，表明重组质粒在杂交鳢各组织已经表达。

(五)血清抗体效价测定

(1)血清取样

分别于DNA疫苗免疫杂交鳢的第0、1、3、5、7、14、21、28和35d，每组随机取3尾杂交鳢进行血清样品采集。使用肝素钠溶液润洗1mL注射器，以尾部静脉采血方式抽取每尾杂交鳢1mL左右血液。将注射器去掉针头，轻轻挤压，将血液转移到1.5mL离心管，室温放置2h，4℃过夜，离心机4000r/min 4℃离心5min，吸取上清，-80℃保存。

(2)血清酶活测定

采用南京建成生物工程研究所溶菌酶(LZM)、过氧化物酶(POD)、总超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP) 对血清样品进行5种酶活测定，具体操作步骤参照相应的试剂盒说明书。实验结果采用SPSS 21.0软件对所得数据进行多重比较检验(p>0.05,差异不显著；p<0.05,差异显著；p<0.01,差异极显著)与标准偏差(SD)分析。

结果显示，相比pcDNA 3.1-FLAG组与PBS对照组，7个DNA疫苗组在免疫后的不同时间点，杂交鳢血清五种酶均被激活，表达量上升，并于不同时间点表达量达到峰值。

(3)血清抗体效价测定

采用间接ELISA法检测DNA疫苗免疫杂交鳢的血清抗体效价，计算公式如下：

抗体滴度(实验组T/对照组C)＝(实验组待测血清的OD450-空白对照的OD450)/(阴性对照组待测血清的OD450-空白对照的OD450)。

当T/C>2.1时，抗血清的稀释倍数为其抗体滴度。

分别于各组DNA疫苗(pcDNA-DnaK、pcDNA-GroEL、pcDNA-RpsA、 pcDNA-TerD、pcDNA-FHA、pcDNA-RplL、pcDNA-PspA组)免疫后的7、 14、21、28、35d，采用间接ELISA的方法测定各组DNA疫苗免疫后的杂交鳢血清抗体效价。结果显示，杂交鳢接种各组DNA疫苗后，均发生了特异性免疫反应，在不同时间点血清抗体效价均明显升高。相比pcDNA 3.1-FLAG组与PBS对照组，各组DNA疫苗组在免疫杂交鳢后的第7d即可检测到抗体的产生，分别于不同时间点表达量达到峰值(pcDNA-GroEL 组：峰值：28d；效价：1:8192；pcDNA-RpsA组：峰值：28d；效价：1:4096； pcDNA-DnaK组：峰值：28d；效价：1:512；pcDNA-RplL组：峰值：21d；效价：1:4096；pcDNA-FHA组：峰值：21d；效价：1:1024；pcDNA-TerD 组：峰值：28d；效价：1:8192；pcDNA-PspA组：峰值：21d；效价：1:512)，并且持续35d之内均处于高表达水平状态。

(六)qRT-PCR检测杂交鳢免疫相关基因差异表达

(1)分别于DNA疫苗免疫杂交鳢的第0、1、3、5、7、14、21、28 和35d，每组随机取3尾杂交鳢进行组织取样。无菌操作取杂交鳢肌肉、肝脏、脾脏和头肾(组织样品大小约0.2cm×0.2cm×0.2cm)组织样品置于含1mL RNAlater溶液的1.5mL离心管，置于4℃过夜使RNAlater 溶液充分固定组织样品，-80℃保存，以备提取RNA，用于qRT-PCR检测杂交鳢免疫相关基因表达试验。

(2)采用EasyPure RNA Kit试剂盒提取RNA组织样品(肝脏、脾脏和头肾)。采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒将杂交鳢组织样品RNA反转录成cDNA，作为荧光定量qRT-PCR检测模板。

(3)根据杂交鳢免疫相关基因MHCIα、MHCIIα、IL-1β、TNFα、CD4 和CD8α序列，设计引物，各对引物如表2所示。荧光定量qRT-PCR检测免疫相关基因mRNA的相对表达量，β-actin作为内参基因，反应体系与扩增程序如下：

表2

内参基因和目的基因的相对表达量采用2^(-△△Ct)法计算；采用SPSS 21.0 软件对所得数据进行多重比较检验(p>0.05,差异不显著；p<0.05,差异显著；p<0.01,差异极显著)与标准偏差(SD)分析。

实验采用荧光定量qRT-PCR分别对6个免疫相关基因(MHCIα、 MHCIIα、CD4、CD8α、IL-1β和TNFα)在杂交鳢肝脏、脾脏和头肾组织， 9个时间点(0、1、3、5、7、14、21、28、35d)的表达情况进行了分析。结果显示，相比pcDNA 3.1-FLAG组与PBS对照组，7组DNA疫苗杂交鳢的MHCIα、MHCIIα、CD4、CD8α、IL-1β和TNFα基因mRNA表达量在杂交鳢的肝脏、脾脏和肾脏均出现了上调，并且在不同时间点表达量达到峰值，随后出现一定的下降现象，但仍然高于对照组的表达水平。

(七)野生株攻毒与免疫保护率计算

根据LD₅₀计算结果，制备杂交鳢感染鰤鱼诺卡氏菌野生株N.seriolae strainZJ0503半致死浓度菌液。各组DNA疫苗免疫杂交鳢35d后，分别吸取鰤鱼诺卡氏菌野生株N.seriolae strain ZJ0503半致死浓度菌液以腹腔注射的方式对杂交鳢进行攻毒试验。pcDNA-DnaK、pcDNA-GroEL、 pcDNA-RpsA、pcDNA-TerD、pcDNA-FHA、pcDNA-RplL、pcDNA-PspA、空质粒pcDNA 3.1-FLAG免疫组与PBS对照组均分别攻毒3组杂交鳢，每组30尾，每尾100μL。连续观察14d，记录死亡尾数。

将鰤鱼诺卡氏菌DNA疫苗免疫杂交鳢35d后进行鰤鱼诺卡氏菌野生株N.seriolaestrain ZJ0503活菌攻毒试验，实验组与对照组杂交鳢在14d 内出现不同程度的死亡，死亡时间集中在活菌攻毒后的5-10d，之后基本处于稳定状态。对死亡的鱼体进行临床鉴定，发病鱼体型呈现腹部肿大，具有腹水；将其解剖，观察肝脏、脾脏和肾脏等器官均出现明显的白色结节结构。通过对死亡杂交鳢进行病原分离与鉴定，证实发病杂交鳢是由注射鰤鱼诺卡氏菌野生株N.seriolae strain ZJ0503活菌诱发感染死亡。此外，鱼类诺卡氏菌病三种致病菌共同抗原DNA疫苗对杂交鳢防治鱼类诺卡氏菌病具有一定的免疫保护效果，其免疫保护率分别为pcDNA-PspA组： 57.83％；pcDNA-FHA组：62.64％；pcDNA-DnaK组：53.01％；pcDNA-RplL 组：78.31％；pcDNA-TerD组：83.14％；pcDNA-RpsA组：71.08％； pcDNA-GroEL组：80.71％(表3)。

表3

*相对免疫保护率(RPS)＝{1–[免疫组死亡率(％)/对照组死亡率(％)]}×100％

N.A.＝不适用

由表3可知，本发明制备的DNA疫苗对鱼类诺卡氏菌病有不同程度的防治作用。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

序列表

<110>广东海洋大学深圳研究院；广东海洋大学；深圳义海生物科技有限公司

<120> 鱼类诺卡氏菌病共同抗原DNA疫苗及其制备和应用

<130> HP191210LZ

<141> 2019-05-20

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 1

cgggatccat gcccatccct gatctggag 29

<210> 2

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<212> DNA

<213> 未知()

<400> 2

ggaattccta gaagtccatg ccgcccatg 29

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<211> 28

<212> DNA

<213> 未知()

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cgggatccat gcccaccact gtcacctc 28

<210> 4

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<212> DNA

<213> 未知()

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ggaattctca ggcgttgccc gacagcttc 29

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<212> DNA

<213> 未知()

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gaagatctat ggctcgtgcg gtcggtatc 29

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<213> 未知()

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ggaattctca cttcttctca ggctcctcga cgacctc 37

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<212> DNA

<213> 未知()

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cgggatccat ggccaacgtt gatgagctg 29

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ggaattctta cttgacggtg atcttggc 28

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gaagatctat ggctaatccg ttcgtgaag 29

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ggaattctta ctgctgggcg gcctggc 27

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cgggatccat gggtgtcagt ttgtccaag 29

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ccgctcgagt cagacgttga cgccgaag 28

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<212> DNA

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cgggatccat gagcgagaac aaggacc 27

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ccgctcgagc tatagagccg aatcgctcg 29

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tgcactcatg gaaggcattt tacac 25

<210> 16

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<213> 未知()

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gggtagcctc tgagaatgt 19

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<212> DNA

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actttggtac gcggacttca 20

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gaactttggt acgcggactt 20

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<212> DNA

<213> 未知()

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aatctgtctt ctgacctcca ac 22

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<212> DNA

<213> 未知()

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cacccatttt ccgctatct 19

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<212> DNA

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tggtcggttt ccttggtt 18

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ctttgtgcat gaatccccat 20

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<212> DNA

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gacaaaagca tcctgacgac 20

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<212> DNA

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gaaaattggc ggacctga 18

<210> 25

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<213> 未知()

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ccgttttaca ccggatactt tg 22

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<213> 未知()

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tactcgccct tcatcaccac 20

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<212> DNA

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atgtcgccct ggacttcg 18

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<212> DNA

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ctgggcaacg gaacctct 18

<210> 29

<211> 1656

<212> DNA

<213> Nocardiaceae

<400> 29

atgcccatcc ctgatctgga ggatctcaac gcaatggcca agacaattgc gtacgacgaa 60

gaggctcgcc gcggactcga gcgtggcctg aacagcctcg ccgacgctgt caaggtgacc 120

cttggcccca agggccgcaa tgtcgtgctg gagaagaagt ggggcgcccc caccatcacc 180

aacgatggtg tctccatcgc gaaggaaatc gagctcgagg acccgtacga gaagatcggc 240

gcggagctcg tcaaggaagt tgcgaagaag accgacgacg tcgcgggtga cggcaccacc 300

accgccaccg tgctggccca ggcgctggtc cgcgagggcc tgcgcaacgt ggccgccggc 360

gccaacccgc tcggcctgaa gcgcggcatc gagaaggccg tcgaggccgt caccgcctcg 420

ctgctcgaca ccgccaagga ggtcgagacc aaggagcaga tcgccgccac cgccggtatc 480

tcggccggcg actcgtccat cggtgagctc atcgccgagg ccatggacaa ggtcggcaag 540

gaaggcgtca tcaccgtcga ggagagcaac accttcggtc tccagctgga gctgaccgag 600

ggcatgcgct tcgacaaggg ctacatctcc ggttacttcg tgaccgaccc ggagcgtcag 660

gaagcggtcc tcgaggaccc gtacatcctg ctggtcggct cgaagatctc gaccgtcaag 720

gacctgctgc cgctgctgga gaaggtcatc caggccggca agccgctgct gatcatcgcc 780

gaagacgttg agggcgaagc gctctcgacc ctggtcgtga acaagatccg cggcaccttc 840

aagtccatcg ccgtcaaggc cccgggcttc ggcgaccgcc gcaaggccat gctggccgac 900

atcgccatcc tgaccggtgg cgaggtcatc agcgaagagg tcggcctctc tctcgagacc 960

gccggtctgg agctgctggg caccgcccgc aaggtcgtca tcaccaagga cgagaccacc 1020

atcgtcgagg gcgcgggcga cccggaggcc atcaagggcc gcgtggcgca gatccgcacc 1080

gagatcgaga actcggactc ggactacgac cgtgagaagc tgcaggagcg cctggccaag 1140

ctggccggtg gcgttgctgt catcaaggcg ggcgcggcca ccgaggtcga gctcaaggag 1200

cgcaagcacc gcatcgagga cgccgtccgc aacgcgaagg ccgccgtcga agagggcatc 1260

gtcgccggtg gtggcgtggc cctgctgcag gcctccccgg ccctggacgc gctgtccctg 1320

accggtgacg aggccaccgg cgcgaacatc gttcgcgtcg cgctgtccgc gccgctgaag 1380

cagatcgcct tcaacgcggg cctggagccc ggcgtcgtcg ccgagaaggt ctcgaacctc 1440

ccggccggcc acggcctgaa cgccgagtcc ggcgagtacg tcgacctgct ggccgccggc 1500

gttgccgacc cggtcaaggt cacccgctcg gccctgcaga acgcggcctc catcgcggcc 1560

ctgttcctca ccaccgaggc cgtcgtcgcc gacaagccgg agaaggccgc ccccgcgggc 1620

gacccgaccg gcggcatggg cggcatggac ttctag 1656

<210> 30

<211> 468

<212> DNA

<213> Nocardiaceae

<400> 30

atgagcgaga acaaggaccc gggttaccag gaaacggcag cagagaccac ttcggtgttc 60

cgtgccgact tcctgaacga ggtcgacacg tcgcgccccg agcagacagg cgagcagccg 120

gtacagggag tcgagggtct gcccgcgggc gcggccctgc tggtggtcaa gcgtggtccg 180

aacgccggtt cgcgattcct gctcgaccag ccgaccacct cggcgggccg ccaccccgac 240

agcgacatct tcctggacga tgtcaccgtc agccgtcgcc acgcggaatt ccgccaggac 300

gacgacacct tccaggtggt cgatgtgggc agcctcaacg gcacctacgt caaccgggag 360

ccggtggatt cctcggaact gcagaacggt gacgaggtcc agatcggcaa gttccgcctg 420

gtcttcctga ccggccccaa gccggtttcg agcgattcgg ctctatag 468

<210> 31

<211> 831

<212> DNA

<213> Nocardiaceae

<400> 31

atggctaatc cgttcgtgaa ggcctggaag tacctgatgg ccctcttcga ctcgaagatc 60

gaggagcatg cggatccgaa ggttcagatc cagcaggcca tcgaggaagc ccagcgccag 120

catcaggccc tgtcgcagca ggccgcgtcg gtgatcggca accagcgcca gctggagatg 180

aagctgaacc gccagctgga cgaggtcgag aagctcaatg ccaatgcgcg ccaggcggtt 240

atgctcgccg accaggccag cggcgcgggt gacaccgaga aggcgatcca gtacaccaat 300

gccgcagagg ctttcgccgc gcagctggtg accgccgagc agtccgtcga ggatctgaag 360

gtgctgcacg accagtcgct gcaggccgcc gcgcaggcca agaaggccgt cgagcagaac 420

gccatgctgc tgcagcagaa ggtcgccgag cgcaccaagc tgctttccca gctggagcag 480

gccaagatgc aggagcaggt ctcggcctcg ctgcagcaga tggattccac gctgtccgcg 540

cccggtgcgg tccccagcct ggacgcggta cgcgagaaga tcgagcgccg ctacgccaac 600

gccctgggtg ccgccgagct ggcgggcaac tcggtgcagg gccgcatgct cgaggtccag 660

caggccagcg tccagatggc cggccacaac cgcctcgagc agatccgcgc ctccatgcgc 720

ggcgacgccc tccccgccgg tggcgccgcc cagccgcaga tccagcaggg ccagcccgcc 780

cagcccgccg cccagcccaa cttcaacaag ggccaggccg cccagcagta a 831

<210> 32

<211> 1467

<212> DNA

<213> Nocardiaceae

<400> 32

atgcccacca ctgtcacctc gccgcaggtt gccgtcaacg acatcggcac tgccgaggac 60

ttcctcgccg ccatcgacaa gaccatcaag tacttcaacg acggtgacat cgtcgaagga 120

accatcgtca aggtcgatcg cgatgaggtc cttctcgaca tcggttacaa gaccgaaggc 180

gtgatcccgt ctcgcgaact gtccatcaag cacgatgtcg acccggccga ggtcgtttcc 240

gtgggcgatg aggtcgaggc cctcgttctc accaaggagg acaaggaagg ccgcctgatc 300

ctgtcgaaga agcgcgctca gtacgagcgg gcttggggca cgatcgagga gctcaaggag 360

aaggacgagg ccgtcaaggg caccgtcatc gaggtcgtca agggcggcct gatcctggac 420

atcggtctgc gcggcttcct cccggcttcg ctggtcgaga tgcgccgtgt ccgcgacctc 480

cagccgtacg tcggcaagga gatcgaggcc aagatcatcg agctcgacaa gaaccgcaac 540

aacgtggtcc tgtcgcgtcg cgcctggctc gagcagaccc agtccgaggt ccgcagcgag 600

ttcctgcacc agctccagaa gggccaggtc cgcaagggcg tcgtgtcctc catcgtcaac 660

ttcggtgcct tcgtggacct gggtggcgtc gacggtctgg tgcacgtctc cgagctgtcc 720

tggaagcaca tcgaccaccc gtccgaggtt gtcgaggtcg gcaacgaggt caccgtcgag 780

gttctcgacg tcgatctcga ccgcgagcgt gtctccctgt cgctcaaggc gacccaggaa 840

gacccgtggc gtcagttcgc ccgcacccac gcgatcggtc agatcgggcc gggcaaggtc 900

accaagctgg ttccgttcgg tgcgttcgtg cgcgtcgaag agggcatcga gggcctggtt 960

cacatctccg agctggccga gcgccacgtc gaggtcccgg accaggttgt cgccgtcggc 1020

gacgacgcca tggtcaaggt catcgacatc gacctcgagc gtcgccggat ctcgctgtcg 1080

ctgaagcagg ccaacgagga ctacaccgcc gagttcgacc cgtcgaagta cggcatggcc 1140

gacagctacg acgaccaggg caactacatc ttccccgagg gcttcgactc cgagaccaac 1200

gaatggctcg agggcttcga gaagcagcgt gaagagtggg agacccggta cgccgaggcc 1260

gagcgtcgcc acaagatgca caccgctcag atggagaaga tggcggccga cgccgccgct 1320

gaggccgcca acggcgggcc gcagaactac tcctcggagt ccggttcgca ggctgccgct 1380

tcgtcctcct ccgagtcggc cggtggctcg ctcgcgagcg acgcgcagtt ggctgccctg 1440

cgtgagaagc tgtcgggcaa cgcctga 1467

<210> 33

<211> 576

<212> DNA

<213> Nocardiaceae

<400> 33

atgggtgtca gtttgtccaa gggcggtaac gtttcactga ccaagcaggc tccgaacctg 60

acccaggtgg ccgtcggcct cggctgggac attcggacca ccaccggcac cgacttcgac 120

ctcgacgcca gcgccatcgc caccggcgcc gacaagaagg cgctgtccga caagcacttc 180

gtcttcttca acaacctgca gtcccccgag ggcaccatcg tgcacaccgg cgacaacctc 240

accggtgagg gcgagggcga cgacgaggtc atcaatatcg acctggccaa caccccgccg 300

gccatcgagt ccatcttctt cccggtctcg atctacgacg cggactcccg cggccagagc 360

ttcggccagg tccgcaatgc ctacatccgc gtggtggacc gcgccaacgg tgccgagctg 420

gcacgctacg acctgtccga ggacgcctct accgaaaccg ccatggtgtt cggcgagctc 480

taccgcaaca atggtgagtg gaagttccgc gccgtcggtc agggttacgc gtccggtctc 540

gcgggcatcg cccgcgactt cggcgtcaac gtctga 576

<210> 34

<211> 1839

<212> DNA

<213> Nocardiaceae

<400> 34

atggctcgtg cggtcggtat cgacctcggg accacgaact ctgtcatcgc cgttctcgaa 60

ggcggcgagc cggtcgtcgt ggccaactcg gaaggatcgc ggaccactcc gtcgatcgtc 120

gcgttcgcga agaacggcga ggtgctcgtc ggtcagcccg cgaagaacca ggccgtcacc 180

aacgtcgacc gcaccattcg gtccgtcaag cgccacatgg gcgaggactg gtcggtcgag 240

atcgacggca agaagtacac cccgcaggag atttccgcgc gcacgctcat gaagctgaag 300

cgcgacgccg aggcctacct cggtgaggag atcaccgacg cggtcatcac cgtccccgcc 360

tacttcgagg acgcgcagcg ccaggccacc aaggaggccg ggcagatcgc gggcctgaac 420

gtcctgcgca tcgtcaacga gccgaccgcg gccgcgctgg cctacggcct ggacaagggc 480

gacaaggaac agaccatcct ggtcttcgac ctcggcggcg gcaccttcga cgtgtccctg 540

ctcgagatcg gcgagggcgt cgtcgaggtc cgcgcgacct ccggtgacaa ccacctcggt 600

ggcgacgact gggacgagcg catcgtctcc tggctggtcg acaagttccg gggcacctcg 660

ggcatcgacc tgaccaagga caagatggcc atgcagcgtc tgcgcgaggc cgccgagaag 720

gcgaagatcg agctgagctc ctcgcagagc acctcgatca acctgcccta catcacggtc 780

gacgcggaca agaacccgct gttcctcgac gagcagctga cccgcgccga gttccagaag 840

atcacctccg atctgctgga ccgcacccgc aagccgttcc agtcggtcat caaggacgcc 900

ggtatctccg tcggcgacat cgaccacgtt gtgctcgttg gtggttcgac ccgtatgccc 960

gccgtgtccg acctggtcaa ggaactgacc ggcggcaagg agcccaacaa gggcgtgaac 1020

ccggacgagg tcgtcgccgt cggcgccgcc ctgcaggccg gtgtgctcaa gggtgaggtc 1080

aaggacgtcc tgctgctcga tgtcaccccg ctgtcgctgg gcatcgagac caagggcggc 1140

gtgatgacca agctcatcga gcgcaacacc acgatcccga ccaagcgttc ggagaccttc 1200

accacggccg acgacaacca gccgtccgtg cagatccagg tcttccaggg tgagcgtgag 1260

atcgcctcgc acaacaagct gctcggatcc ttcgagctga ccggcatccc gccggccccg 1320

cgcggcgtgc cgcagatcga ggtcaccttc gacatcgacg ccaacggcat cgtccacgtg 1380

acggccaagg acaagggcac cggcaaggag aacacgatca agatccagga cggctccggc 1440

ctgtccaagg aggagatcga ccgcatggtc cgcgacgccg aggcgcacgc cgccgaggac 1500

aaggagcggc gcgaggaggc ggagacccgc aaccaggccg agtcgctggt gcaccagacc 1560

gagaagttca tcaaggacaa cgaggacaag gtcccggccg agatcaagac caaggtcgag 1620

gcggccatcg ccgacgccaa cgaggcgctc gagggcaccg acatcgcggc catcaagacc 1680

gcggtggaga agctcgccac cgagtcgcag gcgctgggcc aggccatcta cgaggcctcg 1740

gccgcggatc aggccgccca gggcaacggt gctgcggcgc cgcagtccga tgacaccgtg 1800

gtggacgccg aggtcgtcga ggagcctgag aagaagtga 1839

<210> 35

<211> 381

<212> DNA

<213> Nocardiaceae

<400> 35

atggccaacg ttgatgagct gctcgagacc ttcgccggca tgaccctgct ggagctgtcc 60

gagttcgtga aggcgttcga ggacaagttc gaggtcaccg ctgccgctcc ggtcgccgtc 120

gccgtcgcgg gtggcgctgc tgccccggcc gaggccgccg aggagcagga cgagttcgac 180

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