一种犬红细胞抗原dea1.1的鉴定方法
阅读说明：本技术 一种犬红细胞抗原dea1.1的鉴定方法 (Identification method of canine erythrocyte antigen DEA1.1 ) 是由 李来庆 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法,属于基因技术领域,步骤如下：获取犬红细胞表面抗原DEA1.1基因,将基因序列进行密码子优化；构建DEA1.1表达载体,将修饰后的DEA1.1基因进行基因合成；将合成后的DEA1.1基因转化至DH5α细胞扩增；将扩增后的DEA1.1基因转化至BL21细胞大量表达；对DEA1.1蛋白纯化；取重组表达纯化后DEA1.1蛋白与犬血液混合,检测凝血情况,鉴定DEA1.1抗原性。本发明通过基因工程手段重组表达犬红细胞表面抗原DEA1.1,以达到快速简便的检测犬DEA1.1血型、提高犬输血成功的概率、减少犬类医疗成本以及提高犬大量失血后的存活率的目的。(The invention discloses an identification method of dog erythrocyte antigen DEA1.1, belonging to the technical field of genes, comprising the following steps: obtaining a dog erythrocyte surface antigen DEA1.1 gene, and carrying out codon optimization on a gene sequence; constructing a DEA1.1 expression vector, and carrying out gene synthesis on the modified DEA1.1 gene; transforming the synthesized DEA1.1 gene into DH5 alpha cells for amplification; transforming the amplified DEA1.1 gene into BL21 cells for mass expression; purifying DEA1.1 protein; mixing the DEA1.1 protein after recombinant expression and purification with dog blood, detecting the blood coagulation condition, and identifying the antigenicity of DEA 1.1. The invention recombines and expresses dog erythrocyte surface antigen DEA1.1 by means of genetic engineering, so as to achieve the purposes of quickly, simply and conveniently detecting the blood type of dog DEA1.1, improving the success probability of dog blood transfusion, reducing the medical cost of dogs and improving the survival rate of dogs after a large amount of blood loss.)
技术领域
本发明涉及一种DEA1.1测定方法，特别是涉及一种犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法，属于基因技术领域。
背景技术
犬红细胞血型是指动物红细胞表面含有能抗特定抗体的抗原，他是一种遗传的性状，由若干个相互关联的抗原抗体组成的血型体系，成为血型系统，如犬有DEA（DogErythrocyte Antigen）系统，另外，还有白细胞抗原系统等。未免疫或数学的动物，血浆中存在着先天性的同种抗体；在输血致敏后，可产生后天性的其他同种抗体。输血后引发的溶血或初生幼犬、猫吃母乳后发生溶血，可能是这些同种抗体引发的。同种抗体可通过交叉配血试验和血液分型来检验，凝血或溶血说明有同种抗体的存在。
犬至少有13种红细胞血型，但只有6个血型有意义，它们是DEA系统的DEA1.1、1.2、3、4、5、7血型。DEA1血型有多个等位基因，包括DEA1.1、DEA1.2、DEA1.3和一个无效血型，DEA1.1抗原最重要，其次是DEA1.2。
如果供血犬是DEA1.1阳性，受血犬是DEA1.1阴性，初次输血将致敏，第二次输血将很快在12小时内发生输血溶血反应，导致输入的红细胞崩解，甚至危及生命。因此，不能用DEA1.1阳性犬给DEA1.1阴性犬作供血犬。DEA1.1阳性公犬和DEA1.1母***配，生下的DEA1.1阳性幼犬，当幼犬吃母乳后，有可能发生溶血病，导致幼犬在短时间内死亡。因此，最好不用DEA1.1阳性公犬和DEA1.1阴性母***配，以防止幼犬吃母乳后发生溶血。
犬血型DEA1.1和DEA1.2在输血中非常重要，因DEA1.1阴性犬可给DEA1.1阴性犬、DEA1.1阳性犬和DEA1.2阳性犬输血，故也称为“通适供血犬或万能供血犬”。
临床上给未输过血的犬，初次输血时，可以不做交叉配血试验或检验血型。但是，若初次输入了部相合的血型血液，输入血液红细胞的半衰期约12小时；如果初次输入相合血型的血液时，输入血液红细胞的半衰期为21天。所以初次给犬输血时，为了效果更好，鉴别血型过做交叉配血试验，根据血型或试验结果输血时很重要的。临床上常见这样情况，不做血型鉴定或交叉配血试验，第一次给犬输血后，犬精神大有好转，但第二天病情更加严重，这可能就是输入了不相配血液的原因。
因此，需要一种敏感性高、快速、简便、易于推广的犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法，防止发生上述输血配对中出现的问题。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供一种犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法，通过基因工程手段重组表达犬红细胞表面抗原DEA1.1，以达到快速简便的检测犬DEA1.1血型、提高犬输血成功的概率、减少犬类医疗成本以及提高犬大量失血后的存活率的目的。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
一种犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、获取犬红细胞表面抗原DEA1.1基因，利用基因工程技术，将DEA1.1基因序列进行密码子优化，序列为SEQ ID NO.1；
步骤（2）、构建DEA1.1表达载体，将密码子优化后的DEA1.1基因两端分别添加两个酶切位点，分别是NdeI位点在5’端，XhoI位点在3’端，修饰后的DEA1.1基因序列为SEQ ID NO.2，将修饰后的DEA1.1基因进行基因合成，并连接到pET30aCH1-BAB载体的相应位点；
步骤（3）、将合成后的DEA1.1基因转化至DH5α细胞扩增，提取扩增后质粒；
步骤（4）、将扩增后后的DEA1.1基因转化至BL21细胞大量表达，取上清；
步骤（5）、对DEA1.1蛋白进行亲和层析纯化，测定其纯度；
步骤（6）、取重组表达纯化后DEA1.1蛋白与犬血液混合，检测凝血情况，鉴定DEA1.1抗原性。
优选的是，所述步骤（3）中将合成后的DEA1.1基因转化至DH5α细胞扩增，提取扩增后质粒的方法如下：制备DH5α电转感受态细胞，然后将含有DEA1.1基因的载体转化至DH5α电转感受态细胞中。
优选的是，所述制备DH5α电转感受态细胞步骤如下:
稀释DH5α菌株浓度，涂布到LB固体培养基中过夜培养；挑取过夜培养后生长出的单个菌落加到LB液体培养基中过夜培养；取过夜培养的菌液加入到无菌LB培养基中，培养至菌液在OD600吸光度为0.5-0.8，取出容器，至于冰水混合物中冷却，离心，收菌；
用预冷的超纯水和无菌甘油洗涤若干次，弃上清，用甘油重悬菌体并在冰上分装至EP管中储存，备用。
优选的是，所述将含有DEA1.1基因的载体转化至DH5α电转感受态细胞的步骤如下：
取含有DEA1.1基因的载体加入到DH5α电转感受态细胞中，冰上培育，转移至电穿孔容器中进行脉冲；然后添加LB培养基至电穿孔容器中培养细胞，涂布到筛选培养基中过夜培养；挑取过夜培养的菌落加入到LB筛选培养基中过夜培养，然后提取扩增后质粒。
优选的是，所述步骤（4）中将扩增后后的DEA1.1基因转化至BL21细胞大量表达，取上清的方法如下：制备BL21电转感受态细胞，将扩增后的质粒转化到BL21感受态细胞中，转化后将细胞涂布于LB固体筛选培养基中过夜培养；取单个菌落过夜培养，接种到LB液体培养基中，培养至OD600在0.5-0.8，添加IPTG培养；离心，收菌；超声破碎菌体，低温离心，取上清用微米滤膜抽滤，备用。
优选的是，所述制备BL21电转感受态细胞步骤如下：
稀释BL21菌株浓度，涂布到LB固体培养基中过夜培养；挑取过夜培养后生长出的单个菌落加到LB液体培养基中过夜培养；取过夜培养的菌液加入到无菌LB培养基中，培养至菌液在OD600吸光度为0.5-0.8，取出容器，至于冰水混合物中冷却，离心，收菌；
用预冷的超纯水和无菌甘油洗涤若干次，弃上清，用甘油重悬菌体并在冰上分装至EP管中储存，备用。
优选的是，所述将扩增后的质粒转化到BL21感受态细胞中的转化方法如下：
将扩增后后的DEA1.1基因加入到BL21电转感受态细胞中，冰上培育；转移至电穿孔容器中进行脉冲；添加LB培养基至电穿孔容器中培养细胞，涂布到筛选培养基中过夜培养；挑取过夜培养的菌落加入到LB筛选培养基中过夜培养。
优选的是，所述对DEA1.1蛋白进行亲和层析纯化的方法为：取裂解后的上清，过His亲和层析柱，收集纯化后蛋白。
优选的是，所述测定纯度的方法为：将纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳，对纯度进行判断蛋白条带清晰度。
本发明的有益技术效果：本发明提供的犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法，敏感性高、操作简单，可快速检测犬DEA1.1血型，有效的防止因血型不同导致犬类输血配对困难，提高犬输血成功的概率，减少犬类医疗成本，提高犬大量失血后的存活率，也降低了人们失去爱宠的危险。
附图说明
图1为按照本发明的犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法的一优选实施例的流程图；
图2为按照本发明的犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法的一优选实施例的DEA1.1重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测示意图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
如图1和图2所示，本实施例提供的犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、获取犬红细胞表面抗原DEA1.1基因，利用基因工程技术，将DEA1.1基因序列进行密码子优化，序列为SEQ ID NO.1；
步骤（2）、构建DEA1.1表达载体，将密码子优化后的DEA1.1基因两端分别添加两个酶切位点，分别是NdeI位点在5’端，XhoI位点在3’端，修饰后的DEA1.1基因序列为SEQ ID NO.2，将修饰后的DEA1.1基因进行基因合成，并连接到pET30aCH1-BAB载体的相应位点；
步骤（3）、将合成后的DEA1.1基因转化至DH5α细胞扩增，提取扩增后质粒；
步骤（4）、将扩增后后的DEA1.1基因转化至BL21细胞大量表达，取上清；
步骤（5）、对DEA1.1蛋白进行亲和层析纯化，测定其纯度；
步骤（6）、取重组表达纯化后DEA1.1蛋白与犬血液混合，检测凝血情况，鉴定DEA1.1抗原性。
进一步的，在本实施例中，如图1所示，步骤（3）中将合成后的DEA1.1基因转化至DH5α细胞扩增，提取扩增后质粒的方法如下：
取DH5α菌株稀释到合适浓度进行涂布到LB固体培养基中，37℃，过夜培养；挑取过夜培养后生长出的单个菌落加到5ml LB液体培养基中，37℃，200 rpm过夜培养；取过夜培养的菌液加入到500ml无菌LB培养基中，37℃，200 rpm，培养至菌液在OD600吸光度为0.6，取出容器，至于冰水混合物中冷却30分钟，离心，收菌；预冷的超纯水洗涤2次，5000rpm，15min；10%无菌甘油洗涤2次，5000rpm，15min；最后一次洗涤结束，弃上清，用20ml 10%甘油重悬菌体并在冰上分装至1.5 ml EP管中，每管150 ul，至于-80℃储存，备用；
然后将含有DEA1.1基因的载体转化至DH5α电转感受态细胞中，方法如下：取含有DEA1.1基因的载体2 ul加入到DH5α电转感受态细胞中，冰上培育约5分钟；转移至2mm电穿孔容器中，进行脉冲（200欧姆，25uFd，2.5千伏）；立即添加300ulLB 培养基至电穿孔容器中，37℃培养细胞40分钟，涂布到筛选培养基中，37℃，过夜培养；挑取过夜培养的菌落，37℃，LB筛选培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养；提取扩增后质粒。
进一步的，在本实施例中，如图1所示，步骤（4）中将扩增后后的DEA1.1基因转化至BL21细胞大量表达，取上清的方法如下：
制备BL21电转感受态细胞：取BL21菌株稀释到合适浓度进行涂布到LB固体培养基中，37℃，过夜培养；挑取过夜培养后生长出的单个菌落加到5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；取过夜培养的菌液加入到500ml无菌LB培养基中，37℃，200 rpm，培养至菌液在OD600吸光度为0.6，取出容器，至于冰水混合物中冷却30分钟，离心，收菌；预冷的超纯水洗涤2次，5000rpm，15min；10%无菌甘油洗涤2次，5000rpm，15min；最后一次洗涤结束，弃上清，用20ml 10%甘油重悬菌体并在冰上分装至1.5 ml EP管中，每管150 ul，至于-80℃储存，备用；
将扩增后的质粒转化到BL21感受态细胞中，转化方法如下：将扩增后后的DEA1.1基因的载体2 ul加入到BL21电转感受态细胞中，冰上培育约5分钟；转移至2mm电穿孔容器中，进行脉冲（200欧姆，25uFd，2.5千伏）；立即添加300ulLB 培养基至电穿孔容器中，37℃培养细胞40分钟，涂布到筛选培养基中，37℃，过夜培养；挑取过夜培养的菌落，37℃，LB筛选培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养；
转化后细胞涂布于LB固体筛选培养基中，37℃过夜培养，取单个菌落，37℃，200 rpm，过夜培养，按1:100比例接种到LB液体培养基（kan+）中，培养至OD600在0.6左右，添加IPTG（终浓度为0.5umol/L），37℃，200 rpm，培养2小时；5000rpm，离心20分钟收菌；超声破碎菌体，低温离心，取上清，0.22微米滤膜抽滤备用。
进一步的，在本实施例中，如图2所示，对DEA1.1蛋白进行亲和层析纯化的方法为：取步骤4裂解后的上清，过His亲和层析柱，收集纯化后蛋白，纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳对纯度进行初步判断，蛋白质的相对分子质量决定了SDS-蛋白复合物在凝胶电泳中的迁移率，聚丙烯酰胺凝胶中的去垢剂SDS带有大量的负电荷，与之相比，蛋白质所带电荷量可忽略不计。因此，蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速度和距离完全取决于相对分子质量（速度与相对分子质量成反比）而不受其所带电荷的影响，不同相对分子质量的蛋白质将位于凝胶的不同区段而得到分离，检测结果如图2所示，蛋白条带清晰，大小在40 KD左右，大小与预期结果相符。
综上所述，本实施例提供的犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法，通过基因工程手段重组表达犬红细胞表面抗原DEA1.1，以达到快速简便的检测犬DEA1.1血型、提高犬输血成功的概率、减少犬类医疗成本以及提高犬大量失血后的存活率的目的。
以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州艺得诺生物科技有限公司
<120> 一种犬红细胞抗原DEA1.1的鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1198
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60
atggaagttc agctggttga atctggtggt gacctggtta aaccgggtgg ttctctgcgt 120
ctgtcttgcg ttgcttctgg tttcaacttc tctaactacg acatgaactg ggttcgtcag 180
gctccgggta aaggtctgca gtgggttgct tacatctctt ctggtggtat caacacctac 240
tacgctgacg ttgttcaggg tcgtttcacc atctctcgtg acaacgctaa atctatgctg 300
tacctgcaga tggaccgtct gcgtgttgaa gacaccgcta tgtactactg cgctggtgaa 360
ggtccgtact ctcgtggttc tggtctgttc ggttacggta tggactactg gggtccgggt 420
acctctctgt tcgtttcttc tggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt 480
ggttctgctc agccggttct gacccagccg ccgtctgttt ctggttctct ggaccagcgt 540
gttaccatct cttgcaccgg ttcttcttct aacgttggtt actcttcttc tgttggttgg 600
taccagcagt tcccgggtcg tggtccgcgt accatcatct acttcgacac ctctcgtccg 660
tctggtgttc cggaccgttt ctctggttct aaatctggta acaccgctac cctgaccatc 720
tctggtctgc gtaccgaaga cggtgctcac tactactgct cttcttggga ctctggtgtt 780
cgtgctccgg ttttcggttc tggtaccccg ctgaccgttc tgggttctgg atccgctgct 840
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tacgttctga ccggtcgtta cgactctgct ccggctaccg acggttctgg taccgctctg 1020
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