枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统
阅读说明：本技术 枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统 (Bacillus subtilis CRISPR-Cas9 genome editing system ) 是由 王智文 刘丁玉 黄灿 辛国省 陈涛 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统,该系统的构建方法为：1)构建质粒pBSCas9；2)构建质粒pDonor；3)构建构建多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG；4)由pBSCas9,pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统。本发明解决了目前枯草芽孢杆菌传统基因组编辑技术中存在的问题,不引入任何“负筛选”标记,构建了高效率、高精确度的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas9n基因组无痕编辑系统。且可实现单位点和多位点等不同类型的基因编辑操作,同时实现编辑流程的迭代编辑循环。(The invention discloses a bacillus subtilis CRISPR-Cas9 genome editing system, which comprises the following steps: 1) constructing a plasmid pBSCas 9; 2) constructing a plasmid pDOnor; 3) constructing an auxiliary plasmid pHG in the expression process of constructing the multi-site gRNA; 4) the bacillus subtilis CRISPR-Cas9 genome editing system consists of pBSCas9, pDonor and pHG. The invention solves the problems existing in the traditional genome editing technology of the bacillus subtilis, does not introduce any negative screening marker, and constructs the high-efficiency and high-precision traceless editing system of the CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cas9n genomes. And can realize different types of gene editing operations such as single site and multi-site, and the like, and realize iterative editing circulation of the editing process.)
技术领域
本发明属于基因组编辑技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas9n基因组编辑系统及构建方法及用途。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种，广泛存在于自然界。无致病性，对人畜无害，不污染环境，具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用，被广泛用为分子生物学研究模式生物以及工业化生产高产菌株宿主。
随着系统生物学的发展和开发微生物细胞工厂的需要，高效的基因组“无痕”编辑技术是代谢网络调控研究中的研究热点。枯草芽孢杆菌中传统的无痕基因组编辑系统主要依赖“负筛选”方法，不仅编辑效率较低、精确度低、而且无法满足多位点修饰的需要。近年来，已有CRISPR系统在微生物基因组编辑方面的报道，但目前在枯草芽孢杆菌的CRISPR基因编辑报道中，并未实现流程化的迭代循环系统，且未实现多位点的同时编辑。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统。
本发明的第二个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统的构建方法。
本发明的第三个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统对对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑的用途。
本发明的第四个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统。
本发明的第五个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统的构建方法。
本发明的第六个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统对对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑的用途。
本发明的技术方案概述如下：
枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统的构建方法，包括如下步骤:
1)由来源于质粒pCas9cur的Cas9基因，来源于质粒pHP13的氯霉素抗性基因及其启动子(Cm)，质粒pEBS-cop1的复制子(repF)，质粒pUC18的复制子(ColE1)，枯草芽孢杆菌启动子P43和质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件(xylAcassette)构建质粒pBSCas9；所述Cas9基因核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；氯霉素抗性基因及其启动子(Cm)的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；质粒pEBS-cop1的复制子(repF)的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；质粒pUC18的复制子(ColE1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件(xylAcassette)的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述质粒pBSCas9的核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示；
2)以pHP13为出发质粒，添加枯草芽孢杆菌启动子Pmanp和靶向复制子rep60的gRNA(gRNA-rep60)，并将原氯霉素抗性基因及启动子序列替换为来源于质粒pGRB的氨苄青霉素抗性基因及启动子序列(Amp)构建质粒pDonor；
所述枯草芽孢杆菌启动子Pmanp的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
所述靶向复制子rep60的gRNA(gRNA-rep60)的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；
所述氨苄青霉素抗性基因及启动子(Amp)核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，
所述质粒pDonor的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
3)由质粒pUC18上的复制子(ColE1)和氨苄青霉素抗性基因及其启动子(Amp)组合区域序列，枯草芽孢杆菌启动子P43，构建多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG；
所述质粒pUC18的复制子(ColE1)和氨苄青霉素抗性基因及其启动子(Amp)组合区域核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ IDNO.31所示，多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
4)由pBSCas9，pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统。
上述方法构建的枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统。
上述基因组编辑系统对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑的用途。
枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统的构建方法，包括如下步骤:
1)由来源于质粒pCas9cur的Cas9基因，来源于质粒pHP13的氯霉素抗性基因及其启动子，质粒pEBS-cop1复制子、质粒pUC18的复制子，枯草芽孢杆菌启动子P43和质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件构建质粒pBSCas9，将质粒pBSCas9上所述Cas9基因的核苷酸序列中第10位天冬氨酸Asp密码子GAT突变为丙氨酸Ala密码子GCT，得到点突变后质粒pBSCas9n；
所述Cas9基因核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，氯霉素抗性基因及其启动子(Cm)的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示，质粒pEBS-cop1的复制子(repF)的核苷酸序列如SEQID NO.37所示，质粒pUC18的复制子(ColE1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示，枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件(xylAcassette)的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述质粒pBSCas9的核苷酸序列如SEQID NO.27所示；所述质粒pBSCas9n的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；
2)以pHP13为出发质粒，添加枯草芽孢杆菌启动子Pmanp和靶向复制子rep60的gRNA(gRNA-rep60)，并将原氯霉素抗性基因及启动子序列替换为来源于质粒pGRB的氨苄青霉素抗性基因及启动子序列(Amp)构建质粒pDonor；所述枯草芽孢杆菌启动子Pmanp的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；所述靶向复制子rep60的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述氨苄青霉素抗性基因及启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述质粒pDonor的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
3)由质粒pUC18上的复制子(ColE1)和氨苄青霉素抗性基因及其启动子(Amp)组合区域序列，枯草芽孢杆菌启动子P43，构建多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG；
所述质粒pUC18的复制子(ColE1)和氨苄青霉素抗性基因及其启动子(Amp)组合区域核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ IDNO.31所示，多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
4)由pBSCas9n，pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统。
上述方法构建的枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统。
上述基因组编辑系统对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑的用途。
本发明的优点：
本发明解决了目前枯草芽孢杆菌传统基因组编辑技术中存在的问题，不引入任何“负筛选”标记，构建了高效率、高精确度的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas9n基因组无痕编辑系统。且可实现单位点和多位点等不同类型的基因编辑操作，同时实现编辑流程的迭代编辑循环。
附图说明
图1为pBSCas9/Cas9n工具质粒的图谱。
图2为pDonor工具质粒的图谱。
图3为pHG工具质粒的图谱。
图4为CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas9n基因编辑系统原理。
图5为以pBSCas9为载体表达三个gRNA序列的构建流程。
图6为CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas9n系统分别敲除amyE位点中1kb片段的效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所用到的宿主菌株Bacillus subtilis 168来源为BGSC(BacillusGenetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)。
本发明所用到的原始质粒pAX01和pHP13来源为BGSC(Bacillus Genetic StockCenter，http://www.bgsc.org/)。
质粒pEBS-cop1来源于专利《枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法》(申请公布专利号：CN103451224A)。
质粒pUC18和质粒pCas9cur来源于addgene(http://www.addgene.org)。
pGRB质粒来源于参考文献Li et.al.Metabolic engineering of Escherichiacoli using CRISPR-Cas9 meditated genome editing.Metab Eng.2015,31:13-21.
所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
实施例1工具质粒pBSCas9，pBSCas9n，pDonor和pHG的构建
本发明操作流程中用到pBSCas9，pBSCas9n和pDonor工具质粒，具体构建方法如下。
(1)工具质粒pBSCas9，pBSCas9n的构建
以B.subtilis 168基因组为模板，用引物P43-F和P43-L扩增P43启动子序列(SEQID NO.31)，以质粒pUC18为模板，用引物ColE1-F和ColE1-L扩增pUC18复制子ColE1序列，用引物P43-F和ColE1-L将以上两片段融合为片段F1。这一步融合中，通过引物在P43启动子下游引入gRNA与Cas9蛋白结合的序列和终止子序列。以质粒pHP13为模板，用引物Cm-F和Cm-L扩增氯霉素抗性基因及其启动子序列(Cm)，以质粒pEBs-cop1为模板，用引物repF-F和repF-L扩增pEBs-cop1复制子repF序列，以质粒pAX01为模板，引物xylA-F和xylA-L扩增木糖启动子及诱导元件序列(xylA cassette)，用引物Cm-F和xylA-L将以上三片段融合为片段F2。以pCas9cur为出发质粒用引物Cas9-F和Cas9-L扩增Cas9基因序列。将获得的F1、F2和Cas9片段测定浓度后，按等摩尔比例加入CPEC PCR反应体系中进行一步组装，最终得到pBSCas9质粒(SEQ ID NO.27)(图1)。
所述Cas9基因核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；氯霉素抗性基因及其启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；质粒pEBS-cop1的复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；质粒pUC18的复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件的核苷酸序列如SEQID NO.40所示；所述质粒pBSCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
通过对pBSCas9质粒上Cas9蛋白的内切酶区域进行点突变的方式获得Cas9n序列。以pBSCas9为模板，采用5’端磷酸化引物D10-F和D10-L全质粒扩增pBSCas9，通过引物引入点突变，将原Cas9序列中第10位Asp(GAT)突变为Ala(GCT)，得到Cas9n；全质粒扩增后的片段经T4连接酶连接、转化、筛选阳性克隆，得到质粒pBSCas9n(图1)。所述质粒pBSCas9n的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示。
(2)工具质粒pDonor的构建
以枯草芽孢杆菌质粒pHP13为出发质粒构建pDonor质粒。
采用引物manp-F和manp-L对质粒pHP13进行第一轮全质粒扩增，扩增过程中通过引物引入启动子Pmanp序列(SEQ ID NO.28)，通过Golden Gate克隆重新连接质粒，获得质粒pHP13-2。采用引物gRNA-F和gRNA-L对pHP13-2质粒进行全质粒扩增，扩增过程中通过引物引入靶向复制子rep60的gRNA序列gRNA-rep60(SEQ ID NO.29)，通过Golden Gate克隆重新连接质粒，获得质粒pHP13-3。最后将质粒上的氯霉素基因及启动子序列替换为氨苄青霉素基因及启动子序列，以pGRB质粒为模板，采用引物Amp-F和Amp-L扩增氨苄青霉素基因及启动子序列(Amp，SEQ ID NO.36)。以pHP13-3为模板，采用引物P3-F和P3-L扩增模板质粒，以上两段PCR产物通过Golden Gate克隆连接，获得质粒pDonor(SEQ ID NO.30)(图2)。
所述枯草芽孢杆菌启动子Pmanp的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；所述靶向复制子rep60的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述氨苄青霉素抗性基因及启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述质粒pDonor的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
(3)工具质粒pHG的构建
以质粒pUC18为模板，采用引物pUC-F和pUC-L扩增复制子(ColE1)和氨苄青霉素基因(Amp)组合区域序列(SEQ ID NO.39)。以B.subtilis 168基因组为模板，采用引物P-F和P-L扩增P43启动子序列(SEQ ID NO.31)。以上两个PCR片段，通过CPEC进行一步组装，获得pHG质粒。在质粒的构建过程中，gRNA与Cas9蛋白结合的序列和终止子序列通过引物分别引入(图3)。
所述质粒pUC18的复制子(ColE1)和氨苄青霉素抗性基因及其启动子(Amp)组合区域核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ IDNO.31所示，多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
由质粒pBSCas9，pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统，其中质粒pBSCas9和pDonor完成枯草芽孢杆菌基因组单位点编辑操作，质粒pBSCas9，pDonor和pHG完成枯草芽孢杆菌基因组多位点编辑操作。
由质粒pBSCas9n，pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统，其中质粒pBSCas9n和pDonor完成枯草芽孢杆菌基因组单位点编辑操作，由pBSCas9n，pDonor和pHG完成枯草芽孢杆菌基因组多位点编辑操作。
表1质粒构建所用引物序列
实施例2：CRISPR-Cas9系统基因编辑原理
CRISPR-Cas9系统基因编辑原理如图4所示。
(1)单位点编辑原理
确定基因组修饰位点后，在待修饰区域中选取合适的PAM位点，确定gRNA序列(PAM位点上游20bp序列即为gRNA序列)。将gRNA序列***pBSCas9质粒P43启动子下游区域。具体方法为设计引物对质粒pBSCas9进行全质粒扩增PCR，上下游引物中分别引入BsaI酶切位点以及一部分gRNA序列，通过Golden Gate克隆反应重新连接成环状质粒，此过程中将gRNA***P43启动子(SEQ ID NO.31)下游，此过程不引入任何多余碱基。
根据PAM位点和基因编辑类型，确定同源重组的同源臂序列，以菌株基因组为模板，通过相应的PCR反应扩增同源臂片段，将同源臂序列通过CPEC反应组装至工具质粒pDonor(SEQ ID NO.30)。基因组经同源重组后，PAM位点处序列发生突变，基因组不能继续被Cas9蛋白剪切。
通过spizizen转化将以上构建好的pBSCas9和pDonor质粒分别转入枯草芽孢杆菌宿主菌株，在氯霉素(5μg/mL)和红霉素(0.5μg/mL)双抗LB固体平板上筛选最终的阳性克隆。将阳性菌落转接至氯霉素和红霉素双抗LB液体培养基中，同时添加木糖(终浓度1％)诱导Cas9表达，培养过程中Cas9蛋白剪切基因组，提高发生相应同源重组的效率。将培养后的菌液适当稀释后涂布于氯霉素和红霉素双抗LB固体平板，通过PCR和DNA测序验证目标突变，获得阳性菌株。
LB液体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，调节pH至7.5。0.1Mpa压力下121℃灭菌20min。LB固体培养基配方为：在LB液体培养基中加入琼脂粉(终浓度15g/L)，0.1Mpa压力下121℃灭菌20min。
将验证后的阳性菌株转接于氯霉素(5μg/mL)LB液体培养基，培养基中添加甘露糖(终浓度1％)和木糖(终浓度1％)，甘露糖诱导靶向pDonor质粒(SEQ ID NO.30)复制子rep60的gRNA表达，木糖诱导Cas9表达，培养过程中消除质粒pDonor。菌液划线培养于氯霉素LB固体平板，验证阳性克隆。阳性菌株转接至无抗生素LB液体培养基中，50℃过夜培养，利用repF复制子的热敏系统消除质粒pBSCas9。菌液在无抗生素LB固体平板上划线，验证阳性克隆。将两个工具质粒消除后，可进行下一轮基因编辑操作。
(2)多位点编辑原理(以三位点编辑为例)
确定基因组修饰位点后，分别在待修饰区域中选取合适的PAM位点，确定三条gRNA序列(gRNA-1，gRNA-2，gRNA-3)。以工具质粒pHG为辅助质粒，进行3个单独PCR反应，其中PCR1以gRNA-1的下游引物和gRNA-2的上游引物扩增pHG；PCR2以gRNA-2的下游引物和gRNA-3的上游引物扩增pHG；PCR3以gRNA-3的下游引物和gRNA-1的上游引物扩增pBSCas9。这三段PCR产物经过一步Golden Gate克隆反应就可以获得以pBSCas9为载体同时表达gRNA-1、gRNA-2和gRNA-3的质粒，该过程示意图如图5所示。此过程通过对质粒pHG和pBSCas9的扩增获得不同的PCR片段，每条引物分别引入BsaI酶切位点以及一条gRNA的部分序列，通过Golden Gate克隆反应重新连接成环状质粒，在此过程中将三条gRNA序列以及相应的启动子P43序列(SEQ ID NO.31)***pBSCas9质粒中，此过程不引入任何多余碱基。
CRISPR-Cas9系统进行多位点编辑时，只能实现多密码子碱基突变操作。根据PAM位点，确定不同的同源重组所需同源臂序列，以菌株基因组为模板，通过相应的PCR反应扩增同源臂片段，将三对同源臂序列通过CPEC反应全部组装至工具质粒pDonor(SEQ IDNO.30)。基因组经同源重组后，PAM位点发生突变，基因组不能继续被Cas9蛋白剪切。
构建pBSCas9和pDonor质粒后，后续操作原理与单位点编辑相同。
实施例3：CRISPR-Cas9n系统基因组编辑原理
CRISPR-Cas9n系统基因编辑原理如图4所示。
(1)单位点编辑原理
确定基因组修饰位点后，在待修饰区域中选取合适的PAM位点，确定gRNA序列(PAM位点上游20bp序列即为gRNA序列)。将gRNA序列***pBSCas9n质粒P43启动子下游区域。具体方法为设计引物对质粒pBSCas9n进行全质粒扩增PCR，上下游引物中分别引入BsaI酶切位点以及一部分gRNA序列，通过Golden Gate克隆反应重新连接成环状质粒，此过程中将gRNA***P43启动子(SEQ ID NO.31)下游，此过程不引入任何多余碱基。
根据PAM位点和基因编辑类型，确定同源重组的同源臂序列，以菌株基因组为模板，通过相应的PCR反应扩增同源臂片段，将同源臂序列通过CPEC反应组装至工具质粒pDonor(SEQ ID NO.30)。经同源重组后，PAM位点处序列发生突变，基因组不能继续被Cas9n蛋白剪切。
通过spizizen转化将以上构建好的pBSCas9n和pDonor质粒分别转入枯草芽孢杆菌宿主菌株，在氯霉素(5μg/mL)和红霉素(0.5μg/mL)双抗LB固体平板上筛选最终的阳性克隆。将阳性菌落转接至氯霉素和红霉素双抗LB液体培养基中，同时添加木糖(终浓度1％)诱导Cas9n表达，培养过程中Cas9n蛋白剪切基因组，提高发生相应同源重组的效率。将培养后的菌液适当稀释后涂布于氯霉素和红霉素双抗LB固体平板，通过PCR和DNA测序验证目标突变，获得阳性菌株。
LB液体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，调节pH至7.5。0.1Mpa压力下121℃灭菌20min。LB固体培养基配方为：在LB液体培养基中加入琼脂粉(终浓度15g/L)，0.1Mpa压力下121℃灭菌20min。
将验证后的阳性菌株转接于氯霉素(5μg/mL)LB液体培养基，培养基中添加甘露糖(终浓度1％)和木糖(终浓度1％)，甘露糖诱导靶向pDonor质粒(SEQ ID NO.30)复制子rep60的gRNA表达，木糖诱导Cas9n表达，培养过程中消除质粒pDonor。菌液划线培养于氯霉素LB固体平板，验证阳性克隆。阳性菌株转接至无抗生素LB液体培养基中，50℃过夜培养，利用repF复制子的热敏系统消除质粒pBSCas9。菌液在无抗生素LB固体平板上划线，验证阳性克隆。将两个工具质粒消除后，可进行下一轮基因编辑操作。
(2)多位点编辑原理(以三位点编辑为例)
确定基因组修饰位点后，分别在待修饰区域中选取合适的PAM位点，确定三条gRNA序列(gRNA-1，gRNA-2，gRNA-3)。多位点gRNA质粒构建流程与Cas9系统相同，以工具质粒pHG为辅助质粒，进行3个单独PCR反应，其中PCR1以gRNA-1的下游引物和gRNA-2的上游引物扩增pHG；PCR2以gRNA-2的下游引物和gRNA-3的上游引物扩增pHG；PCR3以gRNA-3的下游引物和gRNA-1的上游引物扩增pBSCas9n。这三段PCR产物经过一步Golden Gate克隆反应就可以获得以pBSCas9n为载体同时表达gRNA-1、gRNA-2和gRNA-3的质粒。此过程通过对质粒pHG和pBSCas9n的扩增获得不同的PCR片段，每条引物分别引入BsaI酶切位点以及一条gRNA的部分序列，通过Golden Gate克隆反应重新连接成环状质粒，在此过程中将三条gRNA序列以及相应的启动子P43序列(SEQ ID NO.31)***pBSCas9n质粒中，此过程不引入任何多余碱基。
CRISPR-Cas9n系统进行多位点编辑时，只能实现多密码子碱基突变操作。根据PAM位点，确定不同的同源重组所需同源臂序列，以菌株基因组为模板，通过相应的PCR反应扩增同源臂片段，将三对同源臂序列通过CPEC反应全部组装至工具质粒pDonor(SEQ IDNO.30)。经同源重组后，PAM位点发生突变，基因组不能继续被Cas9n蛋白剪切。
构建pBSCas9n和pDonor质粒后，后续操作原理与单位点编辑相同。
实施例4：CRISPR-Cas9基因编辑示例及实验操作流程
以敲除amyE基因位点处1kb序列操作为例，介绍CRISPR-Cas9系统编辑流程，基因amyE序列如SEQ ID NO.41所示，敲除序列为其中1kb长度的区域，敲除序列如SEQ ID NO.42所示。具体操作流程如下：
(1)依据编辑位点，在敲除序列中间位置选择PAM位点(即NGG，N代表随机碱基种类)，PAM位点上游20bp序列为gRNA序列，设计引物对质粒pBSCas9进行全质粒扩增，通过引物设计引入20bp gRNA序列和Gold Gate酶切位点，通过Gold Gate重新连接成环状质粒，此过程中在质粒pBSCas9中***了20bp gRNA序列。具体引物设计方法为：
本实验中在敲除序列中选取的gRNA序列为GCGGTGATAGCTTCTCGTTC(SEQ IDNO.43)，全质粒扩增引物为：
gamyE-F(SEQ ID NO.44)：
gamyE-L(SEQ ID NO.45)：
上述引物中，下划线部分为与质粒模板结合的同源序列，构建不同位点gRNA的质粒时该序列保持不变。引物中黑色粗体部分为gRNA序列，gRNA序列通过上下游引物各引入一部分，上游引物中的部分为20bp gRNA序列中的下游10bp序列。下游引物中的部分为20bpgRNA序列中的上游10bp序列的反向互补序列。上下游引物中的斜体碱基为BsaI酶切位点，该酶切位点的切割位置为酶切位点下游间隔一个碱基后的连续4个碱基。因此下游引物中双下划线4个碱基序列为上游引物中10bp gRNA序列中4个前端碱基的反向互补碱基，是为了形成酶切过程中的粘性末端。按照上述引物扩增pBSCas9质粒后，通过Gold Gate重新连接，构建gRNA质粒。其他位点与多位点编辑的gRNA引物设计方法与此相同。
(2)依据基因编辑需要，选择同源重组的同源臂序列，设计引物扩增上下游同源臂和pDonor质粒模板，并通过多片段融合PCR(CPEC)反应将同源臂序列***质粒pDonor中，本实验中扩增上游同源臂引物为：
Del1kbU-F(SEQ ID NO.46)GTTTTACAACGTCGTGAGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTT
Del1kbU-L(SEQ ID NO.47)CCGTCTCTGGTCCATTATTGATTTCCAGTTTTTAATTTGTGTGT
扩增下游同源臂引物为：
Del1kbD-F(SEQ ID NO.48)ACACACAAATTAAAAACTGGAAATCAATAATGGACCAGAGACGG
Del1kbD-L(SEQ ID NO.49)ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCTAGCCTTGCCCTCAATGGGGAAGAG
扩增质粒模板引物为：
pDonD1-F(SEQ ID NO.50)CTCTTCCCCATTGAGGGCAAGGCTAGACTGGGAAAACCCTGGCGT
pDonD1-L(SEQ ID NO.51)AACGGCAGTAAAGAGGTTTTGAATCTCACGACGTTGTAAAAC
上下游同源臂片段和扩增后的质粒片段间分别带有相应的重叠序列，将以上片段通过PCR重新组装(CPEC)成环状质粒，上下游同源臂***至pDonor质粒。
(3)依次将上述构建的gRNA质粒和同源臂质粒转入宿主菌株，在氯霉素(5μg/ml)和红霉素(0.5μg/ml)的双抗LB固体平板上筛选，最终获得带有双质粒系统的菌株。
(4)将带有双质粒系统的阳性克隆菌株接入氯霉素(5μg/ml)和红霉素(0.5μg/ml)双重抗性且终浓度1％木糖的LB液体培养基中，培养8h，培养过程中木糖诱导Cas9切割基因组提升同源重组效率。
(5)木糖诱导培养后的菌液经稀释，涂布于氯霉素和红霉素双抗性的LB平板，获得一定数量的单菌落，待进一步验证。
(6)采用菌落PCR和DNA测序验证阳性克隆。选取平板上一定数量的菌落(50-100个)用引物Del1kbU-F(SEQ ID NO.46)和Del1kbD-L(SEQ ID NO.49)进行PCR验证，敲除成功的菌株PCR片段大小为1kb,未敲除成功的大小为2kb。同时随机挑取PCR验证阳性的菌株进一步通过DNA测序确认序列敲除成功。经验重复验证，本发明中的CRISPR-Cas9系统在枯草芽孢杆菌中敲除1kb序列的阳性率为90％以上(图6)。
(7)挑去验证正确的菌株接种于终浓度1％木糖和1％甘露糖的氯霉素(5μg/mL)LB液体培养基中，过夜培养，将菌液在氯霉素LB平板上划线，培养至菌落可见。
(8)将氯霉素LB平板上的单菌落对点于红霉素(0.5μg/mL)平板，不能在红霉素平板上生长的菌落是pDonor质粒消除的菌株，为保证成功率，可一次对点多个菌落以确保获得质粒消除的菌株。
(9)将pDonor质粒消除的菌株，接种在无抗LB液体培养基中，50℃培养至少8h，将菌液在无抗LB平板上划线，获得的菌落对点于氯霉素平板，在氯霉素平板上不能生长的菌落为pBSCas9质粒消除的菌株。
(10)开始进行下一个循环的基因编辑。
实施例5：CRISPR-Cas9n最优实验操作流程
以敲除amyE基因位点处1kb序列操作为例，介绍CRISPR-Cas9n系统编辑流程，基因amyE序列如SEQ ID NO.41所示，敲除序列为其中1kb长度的区域，敲除序列如SEQ ID NO.42所示。具体操作流程如下：
(1)依据编辑位点，在敲除序列中间位置选择PAM位点(即NGG，N代表随机碱基种类)，PAM位点上游20bp序列为gRNA序列，设计引物对质粒pBSCas9n进行全质粒扩增，通过引物设计引入20bp gRNA序列和Gold Gate酶切位点，通过Gold Gate重新连接成环状质粒，此过程中在质粒pBSCas9n中***了20bp gRNA序列。具体引物设计方法为：
本实验中在敲除序列中选取的gRNA序列为GCGGTGATAGCTTCTCGTTC(SEQ IDNO.43)，全质粒扩增引物为：
gamyE-F(SEQ ID NO.44)：
gamyE-L(SEQ ID NO.45)：
上述引物中，下划线部分为与质粒模板结合的同源序列，构建不同位点gRNA的质粒时该序列保持不变。引物中黑色粗体部分为gRNA序列，gRNA序列通过上下游引物各引入一部分，上游引物中的部分为20bp gRNA序列中的下游10bp序列。下游引物中的部分为20bpgRNA序列中的上游10bp序列的反向互补序列。上下游引物中的斜体碱基为BsaI酶切位点，该酶切位点的切割位置为酶切位点下游间隔一个碱基后的连续4个碱基。因此下游引物中双下划线4个碱基序列为上游引物中10bp gRNA序列中4个前端碱基的反向互补碱基，是为了形成酶切过程中的粘性末端。按照上述引物扩增pBSCas9n质粒后，通过Gold Gate重新连接，构建gRNA质粒。其他位点与多位点编辑的gRNA引物设计方法与此相同。
(2)依据基因编辑需要，选择同源重组的同源臂序列，设计引物扩增上下游同源臂和pDonor质粒模板，并通过多片段融合PCR(CPEC)反应将同源臂序列***质粒pDonor中，本实验中扩增上游同源臂引物为：
Del1kbU-F(SEQ ID NO.46)GTTTTACAACGTCGTGAGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTT
Del1kbU-L(SEQ ID NO.47)CCGTCTCTGGTCCATTATTGATTTCCAGTTTTTAATTTGTGTGT
扩增下游同源臂引物为：
Del1kbD-F(SEQ ID NO.48)ACACACAAATTAAAAACTGGAAATCAATAATGGACCAGAGACGG
Del1kbD-L(SEQ ID NO.49)ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCTAGCCTTGCCCTCAATGGGGAAGAG
扩增质粒模板引物为：
pDonD1-F(SEQ ID NO.50)CTCTTCCCCATTGAGGGCAAGGCTAGACTGGGAAAACCCTGGCGT
pDonD1-L(SEQ ID NO.51)AACGGCAGTAAAGAGGTTTTGAATCTCACGACGTTGTAAAAC
上下游同源臂片段和扩增后的质粒片段间分别带有相应的重叠序列，将以上片段通过PCR重新组装(CPEC)成环状质粒，上下游同源臂***至pDonor质粒。
(3)依次将上述构建的gRNA质粒和同源臂质粒转入宿主菌株，在氯霉素(5μg/ml)和红霉素(0.5μg/ml)的双抗LB固体平板上筛选，最终获得带有双质粒系统的菌株。
(4)将带有双质粒系统的阳性克隆菌株接入氯霉素(5μg/ml)和红霉素(0.5μg/ml)双重抗性且终浓度1％木糖的LB液体培养基中，培养8h，培养过程中木糖诱导Cas9n切割基因组提升同源重组效率。
(5)木糖诱导培养后的菌液经稀释，涂布于氯霉素和红霉素双抗性的LB平板，获得一定数量的单菌落，待进一步验证。
(6)采用菌落PCR和DNA测序验证阳性克隆。选取平板上一定数量的菌落(50-100个)用引物Del1kbU-F(SEQ ID NO.46)和Del1kbD-L(SEQ ID NO.49)进行PCR验证，敲除成功的菌株PCR片段大小为1kb,未敲除成功的大小为2kb。同时随机挑取PCR验证阳性的菌株进一步通过DNA测序确认序列敲除成功。经验重复验证，本发明中的CRISPR-Cas9n系统在枯草芽孢杆菌中敲除1kb序列的阳性率为90％以上(图6)。
(7)挑去验证正确的菌株接种于终浓度1％木糖和1％甘露糖的氯霉素(5μg/mL)LB液体培养基中，过夜培养，将菌液在氯霉素LB平板上划线，培养至菌落可见。
(8)将氯霉素LB平板上的单菌落对点于红霉素(0.5μg/mL)平板，不能在红霉素平板上生长的菌落是pDonor质粒消除的菌株，为保证成功率，可一次对点多个菌落以确保获得质粒消除的菌株。
(9)将pDonor质粒消除的菌株，接种在无抗LB液体培养基中，50℃培养至少8h，将菌液在无抗LB平板上划线，获得的菌落对点于氯霉素平板，在氯霉素平板上不能生长的菌落为pBSCas9n质粒消除的菌株。
(10)开始进行下一个循环的基因编辑。
序列表
<110> 天津大学
<120> 枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统
<160> 51
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgcattga tttgagtcag ctaggaggtg actgacgtgc atgcaggccg gggcat 56
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcatcaccg aaacgtgtac attcctctct tacct 35
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccctt cctcgctcac tgactcgc 58
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaaaggatt tgagcgtagc gaaaaatcct ttctgtcaga ccaagtttac tcatat 56
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagaaa ggatttttcg ctacgctca 59
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgtgatgcg ctgcgtccat taaaggatat ggatctggag ctg 43
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagctccaga tccatatcct ttaatggacg cagcgcatca cac 43
<210> 8
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attgattctt ttttaagtgt tacccctata agttagtgtc ttttgcgcag tcggcttaaa 60
c 61
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtttaagccg actgcgcaaa agacactaac ttataggggt aacactt 47
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tatctaagcc tattgagtat ttcttatcca tggatcccat ttcccccttt gatttttag 59
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcaaaggggg aaatgggatc catggataag aaatactcaa taggcttag 49
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgccccggc ctgcatgcac gtcagtcacc tcctagctga ctcaaatcaa t 51
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taggcttagc tatcggcaca aat 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttgagtattt cttatccatg gatc 24
<210> 15
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cacaccaggt ctcagatttt aatgagctga tttcggtata cagttgagac aagatctaag 60
cttggctgca ggtcgacgga tccccgg 87
<210> 16
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cacaccaggt ctcaaatcgc tttttttacc ataggttccg gtaataaagg catttttccc 60
tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcct 89
<210> 17
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cacaccaggt ctcattaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccaag 60
cttggctgca ggtcgacgga tccccgg 87
<210> 18
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cacaccaggt ctcattaact tgctatttct agctctaaaa cttacatttc gaatcgtcag 60
cagatcttgt ctcaactgta taccgaaat 89
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cacaccaggt ctcaattacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag c 51
<210> 20
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cacaccaggt ctcatcctgc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatg 56
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cacaccaggt ctcaaggagg cttacttgtc tgctttcttc 40
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacaccaggt ctcataatgt cactaacctg ccccgttagt c 41
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggtaagagag gaatgtacac gctgtttcct gtgtgaaatt g 41
<210> 24
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aacggactag ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacgacgaa agggcctcgt 60
gatacgccta ttt 73
<210> 25
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac ccgtgcatgc 60
aggccggggc atat 74
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caatttcaca caggaaacag cgtgtacatt cctctcttac ctataatggt 50
<210> 27
<211> 9237
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctaacttata ggggtaacac ttaaaaaaga atcaataacg atagaaaccg ctcctaaagc 60
aggtgcattt tttcctaacg aagaaggcaa tagttcacat ttattgtcta aatgagaatg 120
gactctagaa gaaacttcgt ttttaatcgt atttaaaaca atgggatgag attcaattat 180
atgatttctc aagataacag cttctatatc aaatgtatta aggatattgg ttaatccaat 240
tccgatataa aagccaaagt tttgaagtgc atttaacatt tctacatcat ttttatttgc 300
gcgttccaca atctcttttc gagaaatatt cttttcttct ttagagagcg aagccagtaa 360
cgctttttca gaagcatata attcccaaca gcctcgattt ccacagctgc atttgggtcc 420
attaaaatct atcgtcatat gacccatttc cccagaaaaa ccctgaacac ctttatacaa 480
ttcgttgtta ataacaagtc cagttccaat tccgatatta atactgatgt aaacgatgtt 540
ttcatagttt tttgtcatac caaatacttt ttcaccgtat gctcctgcat tagcttcatt 600
ttcaacaaaa accggaacat taaactcact ctcaattaaa aactgcaaat ctttgatatt 660
ccaatttaag ttaggcatga aaataatttg ctgatgacga tctacaaggc ctggaacaca 720
aattcctatt ccgactagac cataagggga ctcaggcata tgggttacaa aaccatgaat 780
aagtgcaaat aaaatctctt ttacttcact agcggaagaa ctagacaagt cagaagtctt 840
ctcgagaata atatttcctt ctaagtcggt tagaattccg ttaagatagt cgactcctat 900
atcaatacca atcgagtagc ctgcattctt attaaaaaca agcattacag gtcttctgcc 960
gcctctagat tgccctgccc caatttcaaa aataaaatct ttttcaagca gtgtatttac 1020
ttgagaggag acagtagact tgtttaatcc tgtaatctca gagagagttg ccctggagac 1080
aggggagttc ttcaaaattt catctaatat taatttttga ttcatttttt ttactaaagc 1140
ttgatctgca atttgaataa taaccactcc tttgtttatc caccgaacta agttggtgtt 1200
ttttgaagct tgaattagat atttaaaagt atcatatcta atattataac taaattttct 1260
aaaaaaaaca ttgaaataaa catttatttt gtatatgatg agataaagtt agtttattgg 1320
ataaacaaac taactcaatt aagatagttg atggataaac ttgttcactt aaatcaaagg 1380
gggaaatgac aaatggtcca aactagtgat atctaaaaat caaaggggga aatgggatcc 1440
atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 1500
atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 1560
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 1620
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 1680
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 1740
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 1800
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 1860
aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 1920
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 1980
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 2040
attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 2100
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 2160
ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 2220
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 2280
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 2340
ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 2400
atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 2460
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 2520
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 2580
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 2640
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 2700
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 2760
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 2820
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 2880
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 2940
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 3000
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 3060
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 3120
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 3180
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 3240
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 3300
ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 3360
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 3420
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 3480
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 3540
agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 3600
catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 3660
gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 3720
attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 3780
atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 3840
gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 3900
gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 3960
attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 4020
gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 4080
aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 4140
acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 4200
ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 4260
actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 4320
aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 4380
taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 4440
tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 4500
atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 4560
aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 4620
cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 4680
gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 4740
cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 4800
gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 4860
tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 4920
aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 4980
tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 5040
tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 5100
caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 5160
cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 5220
cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 5280
attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 5340
ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 5400
cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 5460
gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 5520
gatttgagtc agctaggagg tgactgacgt gcatgcaggc cggggcatat gggaaacagc 5580
gcggacgcag cggaatttcc aatttcatgc cgcagccgcc tgcgctgttc tcatttgcgg 5640
cttccttgta gagctcagca ttattgagtg gatgattata ttccttttga taggtggtat 5700
gttttcgctt gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa 5760
acatcaccct cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt gcgtttttgc 5820
cgtgatttcg tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat ggctgaaaat 5880
tcttacattt attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa 5940
atataaagtg atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacacgtt tcggtgatga 6000
cctttccagt cgggaaacct gtcgtaggtc gttcgctcca agcgttttag agctagaaat 6060
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccc ttcctcgctc 6120
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 6180
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 6240
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 6300
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 6360
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 6420
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 6480
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 6540
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 6600
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 6660
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 6720
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 6780
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 6840
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 6900
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 6960
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 7020
tatgagtaaa cttggtctga cagaaaggat ttttcgctac gctcaaatcc tttaaaaaaa 7080
cacaaaagac cacatttttt aatgtggtct ttattcttca actaaagcac ccattagttc 7140
aacaaacgaa aattggataa agtgggatat ttttaaaata tatatttatg ttacagtaat 7200
attgactttt aaaaaaggat tgattctaat gaagaaagca gacaagtaag cctcctaaat 7260
tcactttaga taaaaattta ggaggcatat caaatgaact ttaataaaat tgatttagac 7320
aattggaaga gaaaagagat atttaatcat tatttgaacc aacaaacgac ttttagtata 7380
accacagaaa ttgatattag tgttttatac cgaaacataa aacaagaagg atataaattt 7440
taccctgcat ttattttctt agtgacaagg gtgataaact caaatacagc ttttagaact 7500
ggttacaata gcgacggaga gttaggttat tgggataagt tagagccact ttatacaatt 7560
tttgatggtg tatctaaaac attctctggt atttggactc ctgtaaagaa tgacttcaaa 7620
gagttttatg atttatacct ttctgatgta gagaaatata atggttcggg gaaattgttt 7680
cccaaaacac ctatacctga aaatgctttt tctctttcta ttattccatg gacttcattt 7740
actgggttta acttaaatat caataataat agtaattacc ttctacccat tattacagca 7800
ggaaaattca ttaataaagg taattcaata tatttaccgc tatctttaca ggtacatcat 7860
tctgtttgtg atggttatca tgcaggattg tttatgaact ctattcagga attgtcagat 7920
aggcctaatg actggctttt ataatatgag ataatgccga ctgtactttt tacagtcggt 7980
tttctaatgt cactaacctg ccccgttagt tgaagaaggt ttttatatta cagctccaga 8040
tccatatcct ttaatggacg cagcgcatca cacgcaaaaa ggaaattgga ataaatgcga 8100
aatttgagat gttaattaaa gacctttttg aggtcttttt ttcttagatt tttggggtta 8160
tttaggggag aaaacatagg ggggtactac gacctccccc ctaggtgtcc attgtccatt 8220
gtccaaacaa ataaataaat attgggtttt taatgttaaa aggttgtttt ttatgttaaa 8280
gtgaaaaaaa cagatgttgg gaggtacagt gatggttgta gatagaaaag aagagaaaaa 8340
agttgctgtt actttaagac ttacaacaga agaaaatgag atattaaata gaatcaaaga 8400
aaaatataat attagcaaat cagatgcaac cggtattcta ataaaaaaat atgcaaagga 8460
ggaatacggt gcattttaaa caaaaaaaga tagacagcac tggcatgctg cctatctatg 8520
actaaatttt gttaagtgta ttagcaccgt tattatatga tgagcgaaaa tgtaataaaa 8580
gaaactgaaa acaagaaaaa ttcaagagga cgtaattgga catttgtttt atatccagaa 8640
tcagcaaaag ccgagtggtt agagtattta aaagagttac acattcaatt tgtagtgtct 8700
ccattacatg atagggatac tgatacagaa ggtaggatga aaaaagagca ttatcatatt 8760
ctagtgatgt atgagggtaa taaatcttat gaacagataa aaataattaa cagaagaatt 8820
gaatgcgact attccgcaga ttgcaggaag tgtgaaaggt cttgtgagat atatgcttca 8880
catggacgat cctaataaat ttaaatatca aaaagaagat atgatagttt atggcggtgt 8940
agatgttgat gaattattaa agaaaacaac aacagataga tataaattaa ttaaagaaat 9000
gattgagttt attgatgaac aaggaatcgt agaatttaag agtttaatgg attatgcaat 9060
gaagtttaaa tttgatgatt ggttcccgct tttatgtgat aactcggcgt atgttattca 9120
agaatatata aaatcaaatc ggtataaatc tgaccgatag attttgaatt taggtgtcac 9180
aagacactct tttttcgcac cagcgaaaac tggtttaagc cgactgcgca aaagaca 9237
<210> 28
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agggaaaaat gcctttatta ccggaaccta tggtaaaaaa agcgatttta atgagctgat 60
ttcggtatac agttgagaca agatct 86
<210> 29
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gctgacgatt cgaaatgtaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcacc 86
<210> 30
<211> 5270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggttgataat gaactgtgct gattacaaaa atactaaaaa tgcccatatt ttttcctcct 60
tataaaatta gtataattat agcacgaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 120
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 180
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 240
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 300
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 360
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 420
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 480
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 540
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 600
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 660
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 720
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 780
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 840
acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 900
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 960
cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1020
gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga 1080
gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt 1140
gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca 1200
gggaaaaatg cctttattac cggaacctat ggtaaaaaaa gcgattttaa tgagctgatt 1260
tcggtataca gttgagacaa gatctgctga cgattcgaaa tgtaagtttt agagctagaa 1320
atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac caagcttggc 1380
tgcaggtcga cggatccccg ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 1440
aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 1500
taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga 1560
atggcgacta acggggcagg ttagtgacat tagcctcgtg atacgcctat ttttataggt 1620
taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 1680
cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 1740
ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 1800
ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 1860
aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 1920
actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 1980
gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 2040
agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 2100
cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 2160
catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 2220
aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 2280
gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 2340
aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 2400
agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 2460
ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tcacgcggta tcattgcagc 2520
actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 2580
aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 2640
gaggaggctt acttgtctgc tttcttcatt agaatcaatc cttttttaaa agtcaatatt 2700
actgtaacat aaatatatat tttaaaaata tcccacttta tccaattttc gtttgttgaa 2760
ctaatgggtg ctttagttga agaataaaag accacattaa aaaatgtggt cttttgtgtt 2820
tttttaaagg atttgagcgt agcgaaaaat ccttttcttt cttatcttga tactatatag 2880
aaacaacatc atttttcaaa attaggtcaa agccttgtgt atcaagggtt tgatggttct 2940
ttgacaggta aaaactcctt ctgctattat taaggtgtcg aatcaaaata atagaatgct 3000
agagaactag ctcagaagga gtttttttgt tgatttattc atctgaaaat gattatagca 3060
tcctcgaaga taaaaccgca acaggtaaaa agcgggattg gaaggggaaa aagagacgga 3120
cgaacctcat ggcggagcat tacgaagcgt tagagagtaa gattggggca ccttactatg 3180
gcaaaaaggc tgaaaaacta attagttgtg cagagtatct ttcgtttaag agggatccgg 3240
agacgggcaa gttaaaactg tatcaagccc atttttgtaa agtgaggtta tgtccgatgt 3300
gtgcgtggcg caggtcgtta aaaattgctt atcacaataa gttgatcgta gaggaagcca 3360
atagacagta cggctgcgga tggatttttc tcacgctgac gattcgaaat gtaaagggag 3420
aacggctgaa gccacaaatt tctgcgatga tggaaggctt taggaaactg ttccagtaca 3480
aaaaagtaaa aacttcggtt cttggatttt tcagagcttt agagattacc aaaaatcatg 3540
aagaagatac atatcatcct cattttcatg tgttgatacc agtaaggaaa aattattttg 3600
ggaaaaacta tattaagcag gcggagtgga cgagcctttg gaaaaaggcg atgaaattgg 3660
attacactcc aattgtcgat attcgtcgag tgaaaggtaa agctaagatt gacgctgaac 3720
agattgaaaa cgatgtgcgg aacgcaatga tggagcaaaa agctgttctc gaaatctcta 3780
aatatccggt taaggatacg gatgttgtgc gcggtaataa ggtgactgaa gacaatctga 3840
acacggtgct ttacttggat gatgcgttgg cagctcgaag gttaattgga tacggtggca 3900
ttttgaagga gatacataaa gagctgaatc ttggtgatgc ggaggacggc gatctggtca 3960
agattgagga agaagatgac gaggttgcaa atggtgcatt tgaggttatg gcttattggc 4020
atcctggcat taaaaattac ataatcaaat aaaaaaagca gacctttaga aggcctgctt 4080
ttttaactaa cccatttgta ttgtgttgaa atatgttttg tatggtgcac tctcagtaca 4140
atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 4200
ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 4260
agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 4320
gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gcgattcaca 4380
aaaaataggc acacgaaaaa caagttaagg gatgcagttt atgcatccct tacttattaa 4440
ataatttata gctattgaaa agagataaga attgttcaaa gctaatattg tttaaatcgt 4500
caattcctgc atgttttaag gaattgttaa attgattttt tgtaaatatt ttcttgtatt 4560
ctttgttaac ccatttcata acgaaataat tatacttttg tttatctttg tgtgatattc 4620
ttgatttttt tctacttaat ctgataagtg agctattcac tttaggttta ggatgaaaat 4680
attctcttgg aaccatactt aatatagaaa tatcaacttc tgccattaaa agtaatgcca 4740
atgagcgttt tgtatttaat aatcttttag caaacccgta ttccacgatt aaataaatct 4800
cattagctat actatcaaaa acaattttgc gtattatatc cgtacttatg ttataaggta 4860
tattaccata tattttatag gattggtttt taggaaattt aaactgcaat atatccttgt 4920
ttaaaacttg gaaattatcg tgatcaacaa gtttattttc tgtagttttg cataatttat 4980
ggtctatttc aatggcagtt acgaaattac acctctttac taattcaagg gtaaaatggc 5040
cttttcctga gccgatttca aagatattat catgttcatt taatcttata tttgtcatta 5100
ttttatctat attatgtttt gaagtaataa agttttgact gtgttttata tttttctcgt 5160
tcattataac cctctttaat ttggttatat gaattttgct tattaacgat tcattataac 5220
cacttatttt ttgtttggtt gataatgaac tgtgctgatt acaaaaatac 5270
<210> 31
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgtgcatgca ggccggggca tatgggaaac agcgcggacg cagcggaatt tccaatttca 60
tgccgcagcc gcctgcgctg ttctcatttg cggcttcctt gtagagctca gcattattga 120
gtggatgatt atattccttt tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc 180
cattgaacat acggttgatt taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa 240
ggacgctgcc gccggggctg tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact 300
tatttttttg ccaaagctgt aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa 360
atgggcgtga aaaaaagcgc gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata 420
ggtaagagag gaatgtacac 440
<210> 32
<211> 2722
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcacccgtg catgcaggcc ggggcatatg ggaaacagcg cggacgcagc ggaatttcca 120
atttcatgcc gcagccgcct gcgctgttct catttgcggc ttccttgtag agctcagcat 180
tattgagtgg atgattatat tccttttgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa 240
tacagccatt gaacatacgg ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc 300
ggccaaggac gctgccgccg gggctgtttg cgtttttgcc gtgatttcgt gtatcattgg 360
tttacttatt tttttgccaa agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt 420
ttagaaatgg gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc 480
attataggta agagaggaat gtacacgctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 540
attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 600
agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 660
tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 720
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 780
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 840
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 900
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 960
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 1020
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 1080
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 1140
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 1200
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 1260
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 1320
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 1380
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 1440
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 1500
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 1560
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 1620
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 1680
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1740
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 1800
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 1860
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 1920
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 1980
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 2040
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 2100
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 2160
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 2220
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 2280
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 2340
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 2400
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 2460
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 2520
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 2580
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 2640
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 2700
cgtatcacga ggccctttcg tc 2722
<210> 33
<211> 9237
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctaacttata ggggtaacac ttaaaaaaga atcaataacg atagaaaccg ctcctaaagc 60
aggtgcattt tttcctaacg aagaaggcaa tagttcacat ttattgtcta aatgagaatg 120
gactctagaa gaaacttcgt ttttaatcgt atttaaaaca atgggatgag attcaattat 180
atgatttctc aagataacag cttctatatc aaatgtatta aggatattgg ttaatccaat 240
tccgatataa aagccaaagt tttgaagtgc atttaacatt tctacatcat ttttatttgc 300
gcgttccaca atctcttttc gagaaatatt cttttcttct ttagagagcg aagccagtaa 360
cgctttttca gaagcatata attcccaaca gcctcgattt ccacagctgc atttgggtcc 420
attaaaatct atcgtcatat gacccatttc cccagaaaaa ccctgaacac ctttatacaa 480
ttcgttgtta ataacaagtc cagttccaat tccgatatta atactgatgt aaacgatgtt 540
ttcatagttt tttgtcatac caaatacttt ttcaccgtat gctcctgcat tagcttcatt 600
ttcaacaaaa accggaacat taaactcact ctcaattaaa aactgcaaat ctttgatatt 660
ccaatttaag ttaggcatga aaataatttg ctgatgacga tctacaaggc ctggaacaca 720
aattcctatt ccgactagac cataagggga ctcaggcata tgggttacaa aaccatgaat 780
aagtgcaaat aaaatctctt ttacttcact agcggaagaa ctagacaagt cagaagtctt 840
ctcgagaata atatttcctt ctaagtcggt tagaattccg ttaagatagt cgactcctat 900
atcaatacca atcgagtagc ctgcattctt attaaaaaca agcattacag gtcttctgcc 960
gcctctagat tgccctgccc caatttcaaa aataaaatct ttttcaagca gtgtatttac 1020
ttgagaggag acagtagact tgtttaatcc tgtaatctca gagagagttg ccctggagac 1080
aggggagttc ttcaaaattt catctaatat taatttttga ttcatttttt ttactaaagc 1140
ttgatctgca atttgaataa taaccactcc tttgtttatc caccgaacta agttggtgtt 1200
ttttgaagct tgaattagat atttaaaagt atcatatcta atattataac taaattttct 1260
aaaaaaaaca ttgaaataaa catttatttt gtatatgatg agataaagtt agtttattgg 1320
ataaacaaac taactcaatt aagatagttg atggataaac ttgttcactt aaatcaaagg 1380
gggaaatgac aaatggtcca aactagtgat atctaaaaat caaaggggga aatgggatcc 1440
atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 1500
atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 1560
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 1620
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 1680
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 1740
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 1800
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 1860
aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 1920
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 1980
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 2040
attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 2100
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 2160
ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 2220
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 2280
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 2340
ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 2400
atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 2460
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 2520
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 2580
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 2640
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 2700
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 2760
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 2820
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 2880
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 2940
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 3000
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 3060
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 3120
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 3180
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 3240
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 3300
ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 3360
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 3420
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 3480
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 3540
agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 3600
catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 3660
gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 3720
attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 3780
atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 3840
gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 3900
gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 3960
attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 4020
gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 4080
aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 4140
acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 4200
ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 4260
actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 4320
aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 4380
taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 4440
tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 4500
atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 4560
aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 4620
cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 4680
gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 4740
cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 4800
gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 4860
tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 4920
aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 4980
tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 5040
tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 5100
caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 5160
cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 5220
cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 5280
attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 5340
ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 5400
cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 5460
gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 5520
gatttgagtc agctaggagg tgactgacgt gcatgcaggc cggggcatat gggaaacagc 5580
gcggacgcag cggaatttcc aatttcatgc cgcagccgcc tgcgctgttc tcatttgcgg 5640
cttccttgta gagctcagca ttattgagtg gatgattata ttccttttga taggtggtat 5700
gttttcgctt gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa 5760
acatcaccct cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt gcgtttttgc 5820
cgtgatttcg tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat ggctgaaaat 5880
tcttacattt attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa 5940
atataaagtg atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacacgtt tcggtgatga 6000
cctttccagt cgggaaacct gtcgtaggtc gttcgctcca agcgttttag agctagaaat 6060
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccc ttcctcgctc 6120
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 6180
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 6240
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 6300
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 6360
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 6420
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 6480
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 6540
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 6600
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 6660
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 6720
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 6780
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 6840
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 6900
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 6960
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 7020
tatgagtaaa cttggtctga cagaaaggat ttttcgctac gctcaaatcc tttaaaaaaa 7080
cacaaaagac cacatttttt aatgtggtct ttattcttca actaaagcac ccattagttc 7140
aacaaacgaa aattggataa agtgggatat ttttaaaata tatatttatg ttacagtaat 7200
attgactttt aaaaaaggat tgattctaat gaagaaagca gacaagtaag cctcctaaat 7260
tcactttaga taaaaattta ggaggcatat caaatgaact ttaataaaat tgatttagac 7320
aattggaaga gaaaagagat atttaatcat tatttgaacc aacaaacgac ttttagtata 7380
accacagaaa ttgatattag tgttttatac cgaaacataa aacaagaagg atataaattt 7440
taccctgcat ttattttctt agtgacaagg gtgataaact caaatacagc ttttagaact 7500
ggttacaata gcgacggaga gttaggttat tgggataagt tagagccact ttatacaatt 7560
tttgatggtg tatctaaaac attctctggt atttggactc ctgtaaagaa tgacttcaaa 7620
gagttttatg atttatacct ttctgatgta gagaaatata atggttcggg gaaattgttt 7680
cccaaaacac ctatacctga aaatgctttt tctctttcta ttattccatg gacttcattt 7740
actgggttta acttaaatat caataataat agtaattacc ttctacccat tattacagca 7800
ggaaaattca ttaataaagg taattcaata tatttaccgc tatctttaca ggtacatcat 7860
tctgtttgtg atggttatca tgcaggattg tttatgaact ctattcagga attgtcagat 7920
aggcctaatg actggctttt ataatatgag ataatgccga ctgtactttt tacagtcggt 7980
tttctaatgt cactaacctg ccccgttagt tgaagaaggt ttttatatta cagctccaga 8040
tccatatcct ttaatggacg cagcgcatca cacgcaaaaa ggaaattgga ataaatgcga 8100
aatttgagat gttaattaaa gacctttttg aggtcttttt ttcttagatt tttggggtta 8160
tttaggggag aaaacatagg ggggtactac gacctccccc ctaggtgtcc attgtccatt 8220
gtccaaacaa ataaataaat attgggtttt taatgttaaa aggttgtttt ttatgttaaa 8280
gtgaaaaaaa cagatgttgg gaggtacagt gatggttgta gatagaaaag aagagaaaaa 8340
agttgctgtt actttaagac ttacaacaga agaaaatgag atattaaata gaatcaaaga 8400
aaaatataat attagcaaat cagatgcaac cggtattcta ataaaaaaat atgcaaagga 8460
ggaatacggt gcattttaaa caaaaaaaga tagacagcac tggcatgctg cctatctatg 8520
actaaatttt gttaagtgta ttagcaccgt tattatatga tgagcgaaaa tgtaataaaa 8580
gaaactgaaa acaagaaaaa ttcaagagga cgtaattgga catttgtttt atatccagaa 8640
tcagcaaaag ccgagtggtt agagtattta aaagagttac acattcaatt tgtagtgtct 8700
ccattacatg atagggatac tgatacagaa ggtaggatga aaaaagagca ttatcatatt 8760
ctagtgatgt atgagggtaa taaatcttat gaacagataa aaataattaa cagaagaatt 8820
gaatgcgact attccgcaga ttgcaggaag tgtgaaaggt cttgtgagat atatgcttca 8880
catggacgat cctaataaat ttaaatatca aaaagaagat atgatagttt atggcggtgt 8940
agatgttgat gaattattaa agaaaacaac aacagataga tataaattaa ttaaagaaat 9000
gattgagttt attgatgaac aaggaatcgt agaatttaag agtttaatgg attatgcaat 9060
gaagtttaaa tttgatgatt ggttcccgct tttatgtgat aactcggcgt atgttattca 9120
agaatatata aaatcaaatc ggtataaatc tgaccgatag attttgaatt taggtgtcac 9180
aagacactct tttttcgcac cagcgaaaac tggtttaagc cgactgcgca aaagaca 9237
<210> 34
<211> 4107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60
atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600
attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720
ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900
ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960
atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860
ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100
agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160
catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220
gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280
attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340
atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400
gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460
gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520
attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580
gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640
aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700
acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760
ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820
actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880
aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940
taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000
tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060
atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120
aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180
cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240
gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300
cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360
gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420
tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480
aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540
tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600
tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660
caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720
cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780
cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840
attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900
ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960
cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020
gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080
gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107
<210> 35
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aaaggatttt tcgctacgct caaatccttt aaaaaaacac aaaagaccac attttttaat 60
gtggtcttta ttcttcaact aaagcaccca ttagttcaac aaacgaaaat tggataaagt 120
gggatatttt taaaatatat atttatgtta cagtaatatt gacttttaaa aaaggattga 180
ttctaatgaa gaaagcagac aagtaagcct cctaaattca ctttagataa aaatttagga 240
ggcatatcaa atgaacttta ataaaattga tttagacaat tggaagagaa aagagatatt 300
taatcattat ttgaaccaac aaacgacttt tagtataacc acagaaattg atattagtgt 360
tttataccga aacataaaac aagaaggata taaattttac cctgcattta ttttcttagt 420
gacaagggtg ataaactcaa atacagcttt tagaactggt tacaatagcg acggagagtt 480
aggttattgg gataagttag agccacttta tacaattttt gatggtgtat ctaaaacatt 540
ctctggtatt tggactcctg taaagaatga cttcaaagag ttttatgatt tatacctttc 600
tgatgtagag aaatataatg gttcggggaa attgtttccc aaaacaccta tacctgaaaa 660
tgctttttct ctttctatta ttccatggac ttcatttact gggtttaact taaatatcaa 720
taataatagt aattaccttc tacccattat tacagcagga aaattcatta ataaaggtaa 780
ttcaatatat ttaccgctat ctttacaggt acatcattct gtttgtgatg gttatcatgc 840
aggattgttt atgaactcta ttcaggaatt gtcagatagg cctaatgact ggcttttata 900
atatgagata atgccgactg tactttttac agtcggtttt ctaatgtcac taacctgccc 960
cgttagttga agaaggtttt tatattacag ctccagatcc atatcctt 1008
<210> 36
<211> 1049
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt 60
caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 120
attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 180
aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 240
tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 300
agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 360
gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 420
cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 480
agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 540
taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 600
tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 660
taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 720
acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 780
ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 840
cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 900
agcgtgggtc acgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 960
tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 1020
agataggtgc ctcactgatt aagcattgg 1049
<210> 37
<211> 1186
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
taatggacgc agcgcatcac acgcaaaaag gaaattggaa taaatgcgaa atttgagatg 60
ttaattaaag acctttttga ggtctttttt tcttagattt ttggggttat ttaggggaga 120
aaacataggg gggtactacg acctcccccc taggtgtcca ttgtccattg tccaaacaaa 180
taaataaata ttgggttttt aatgttaaaa ggttgttttt tatgttaaag tgaaaaaaac 240
agatgttggg aggtacagtg atggttgtag atagaaaaga agagaaaaaa gttgctgtta 300
ctttaagact tacaacagaa gaaaatgaga tattaaatag aatcaaagaa aaatataata 360
ttagcaaatc agatgcaacc ggtattctaa taaaaaaata tgcaaaggag gaatacggtg 420
cattttaaac aaaaaaagat agacagcact ggcatgctgc ctatctatga ctaaattttg 480
ttaagtgtat tagcaccgtt attatatgat gagcgaaaat gtaataaaag aaactgaaaa 540
caagaaaaat tcaagaggac gtaattggac atttgtttta tatccagaat cagcaaaagc 600
cgagtggtta gagtatttaa aagagttaca cattcaattt gtagtgtctc cattacatga 660
tagggatact gatacagaag gtaggatgaa aaaagagcat tatcatattc tagtgatgta 720
tgagggtaat aaatcttatg aacagataaa aataattaac agaagaattg aatgcgacta 780
ttccgcagat tgcaggaagt gtgaaaggtc ttgtgagata tatgcttcac atggacgatc 840
ctaataaatt taaatatcaa aaagaagata tgatagttta tggcggtgta gatgttgatg 900
aattattaaa gaaaacaaca acagatagat ataaattaat taaagaaatg attgagttta 960
ttgatgaaca aggaatcgta gaatttaaga gtttaatgga ttatgcaatg aagtttaaat 1020
ttgatgattg gttcccgctt ttatgtgata actcggcgta tgttattcaa gaatatataa 1080
aatcaaatcg gtataaatct gaccgataga ttttgaattt aggtgtcaca agacactctt 1140
ttttcgcacc agcgaaaact ggtttaagcc gactgcgcaa aagaca 1186
<210> 38
<211> 934
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 60
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 120
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 180
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 240
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 300
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 360
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 420
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 480
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 540
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 600
acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 660
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 720
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 780
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 840
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 900
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acag 934
<210> 39
<211> 2216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 60
cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 120
ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 180
acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 240
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 300
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 360
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 420
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 480
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 540
taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 600
ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 660
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 720
aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 780
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 840
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 900
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 960
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 1020
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 1080
cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 1140
aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 1200
atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 1260
cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 1320
tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 1380
atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 1440
taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 1500
tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 1560
gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 1620
cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 1680
cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 1740
gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 1800
aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 1860
accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 1920
ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 1980
gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 2040
aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 2100
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 2160
cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 2216
<210> 40
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ctaacttata ggggtaacac ttaaaaaaga atcaataacg atagaaaccg ctcctaaagc 60
aggtgcattt tttcctaacg aagaaggcaa tagttcacat ttattgtcta aatgagaatg 120
gactctagaa gaaacttcgt ttttaatcgt atttaaaaca atgggatgag attcaattat 180
atgatttctc aagataacag cttctatatc aaatgtatta aggatattgg ttaatccaat 240
tccgatataa aagccaaagt tttgaagtgc atttaacatt tctacatcat ttttatttgc 300
gcgttccaca atctcttttc gagaaatatt cttttcttct ttagagagcg aagccagtaa 360
cgctttttca gaagcatata attcccaaca gcctcgattt ccacagctgc atttgggtcc 420
attaaaatct atcgtcatat gacccatttc cccagaaaaa ccctgaacac ctttatacaa 480
ttcgttgtta ataacaagtc cagttccaat tccgatatta atactgatgt aaacgatgtt 540
ttcatagttt tttgtcatac caaatacttt ttcaccgtat gctcctgcat tagcttcatt 600
ttcaacaaaa accggaacat taaactcact ctcaattaaa aactgcaaat ctttgatatt 660
ccaatttaag ttaggcatga aaataatttg ctgatgacga tctacaaggc ctggaacaca 720
aattcctatt ccgactagac cataagggga ctcaggcata tgggttacaa aaccatgaat 780
aagtgcaaat aaaatctctt ttacttcact agcggaagaa ctagacaagt cagaagtctt 840
ctcgagaata atatttcctt ctaagtcggt tagaattccg ttaagatagt cgactcctat 900
atcaatacca atcgagtagc ctgcattctt attaaaaaca agcattacag gtcttctgcc 960
gcctctagat tgccctgccc caatttcaaa aataaaatct ttttcaagca gtgtatttac 1020
ttgagaggag acagtagact tgtttaatcc tgtaatctca gagagagttg ccctggagac 1080
aggggagttc ttcaaaattt catctaatat taatttttga ttcatttttt ttactaaagc 1140
ttgatctgca atttgaataa taaccactcc tttgtttatc caccgaacta agttggtgtt 1200
ttttgaagct tgaattagat atttaaaagt atcatatcta atattataac taaattttct 1260
aaaaaaaaca ttgaaataaa catttatttt gtatatgatg agataaagtt agtttattgg 1320
ataaacaaac taactcaatt aagatagttg atggataaac ttgttcactt aaatcaaagg 1380
gggaaatgac aaatggtcca aactagtgat atctaaaaat caaaggggga aatgggatcc 1440
<210> 41
<211> 1980
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60
tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgctg aaacggcgaa caaatcgaat 120
gagcttacag caccgtcgat caaaagcgga accattcttc atgcatggaa ttggtcgttc 180
aatacgttaa aacacaatat gaaggatatt catgatgcag gatatacagc cattcagaca 240
tctccgatta accaagtaaa ggaagggaat caaggagata aaagcatgtc gaactggtac 300
tggctgtatc agccgacatc gtatcaaatt ggcaaccgtt acttaggtac tgaacaagaa 360
tttaaagaaa tgtgtgcagc cgctgaagaa tatggcataa aggtcattgt tgacgcggtc 420
atcaatcata ccaccagtga ttatgccgcg atttccaatg aggttaagag tattccaaac 480
tggacacatg gaaacacaca aattaaaaac tggtctgatc gatgggatgt cacgcagaat 540
tcattgctcg ggctgtatga ctggaataca caaaatacac aagtacagtc ctatctgaaa 600
cggttcttag acagggcatt gaatgacggg gcagacggtt ttcgatttga tgccgccaaa 660
catatagagc ttccagatga tggcagttac ggcagtcaat tttggccgaa tatcacaaat 720
acatctgcag agttccaata cggagaaatc ctgcaggata gtgcctccag agatgctgca 780
tatgcgaatt atatggatgt gacagcgtct aactatgggc attccataag gtccgcttta 840
aagaatcgta atctgggcgt gtcgaatatc tcccactatg catctgatgt gtctgcggac 900
aagctagtga catgggtaga gtcgcatgat acgtatgcca atgatgatga agagtcgaca 960
tggatgagcg atgatgatat ccgtttaggc tgggcggtga tagcttctcg ttcaggcagt 1020
acgcctcttt tcttttccag acctgaggga ggcggaaatg gtgtgaggtt cccggggaaa 1080
agccaaatag gcgatcgcgg gagtgcttta tttgaagatc aggctatcac tgcggtcaat 1140
agatttcaca atgtgatggc tggacagcct gaggaactct cgaacccgaa tggaaacaac 1200
cagatattta tgaatcagcg cggctcacat ggcgttgtgc tggcaaatgc aggttcatcc 1260
tctgtctcta tcaatacggc aacaaaattg cctgatggca ggtatgacaa taaagctgga 1320
gcgggttcat ttcaagtgaa cgatggtaaa ctgacaggca cgatcaatgc caggtctgta 1380
gctgtgcttt atcctgatga tattgcaaaa gcgcctcatg ttttccttga gaattacaaa 1440
acaggtgtaa cacattcttt caatgatcaa ctgacgatta ccttgcgtgc agatgcgaat 1500
acaacaaaag ccgtttatca aatcaataat ggaccagaga cggcgtttaa ggatggagat 1560
caattcacaa tcggaaaagg agatccattt ggcaaaacat acaccatcat gttaaaagga 1620
acgaacagtg atggtgtaac gaggaccgag aaatacagtt ttgttaaaag agatccagcg 1680
tcggccaaaa ccatcggcta tcaaaatccg aatcattgga gccaggtaaa tgcttatatc 1740
tataaacatg atgggagccg agtaattgaa ttgaccggat cttggcctgg aaaaccaatg 1800
actaaaaatg cagacggaat ttacacgctg acgctgcctg cggacacgga tacaaccaac 1860
gcaaaagtga tttttaataa tggcagcgcc caagtgcccg gtcagaatca gcctggcttt 1920
gattacgtgc taaatggttt atataatgac tcgggcttaa gcggttctct tccccattga 1980
<210> 42
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cgatgggatg tcacgcagaa ttcattgctc gggctgtatg actggaatac acaaaataca 60
caagtacagt cctatctgaa acggttctta gacagggcat tgaatgacgg ggcagacggt 120
tttcgatttg atgccgccaa acatatagag cttccagatg atggcagtta cggcagtcaa 180
ttttggccga atatcacaaa tacatctgca gagttccaat acggagaaat cctgcaggat 240
agtgcctcca gagatgctgc atatgcgaat tatatggatg tgacagcgtc taactatggg 300
cattccataa ggtccgcttt aaagaatcgt aatctgggcg tgtcgaatat ctcccactat 360
gcatctgatg tgtctgcgga caagctagtg acatgggtag agtcgcatga tacgtatgcc 420
aatgatgatg aagagtcgac atggatgagc gatgatgata tccgtttagg ctgggcggtg 480
atagcttctc gttcaggcag tacgcctctt ttcttttcca gacctgaggg aggcggaaat 540
ggtgtgaggt tcccggggaa aagccaaata ggcgatcgcg ggagtgcttt atttgaagat 600
caggctatca ctgcggtcaa tagatttcac aatgtgatgg ctggacagcc tgaggaactc 660
tcgaacccga atggaaacaa ccagatattt atgaatcagc gcggctcaca tggcgttgtg 720
ctggcaaatg caggttcatc ctctgtctct atcaatacgg caacaaaatt gcctgatggc 780
aggtatgaca ataaagctgg agcgggttca tttcaagtga acgatggtaa actgacaggc 840
acgatcaatg ccaggtctgt agctgtgctt tatcctgatg atattgcaaa agcgcctcat 900
gttttccttg agaattacaa aacaggtgta acacattctt tcaatgatca actgacgatt 960
accttgcgtg cagatgcgaa tacaacaaaa gccgtttatc 1000
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gcggtgatag cttctcgttc 20
<210> 44
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cacaccaggt ctcacttctc gttcgtttta gagctagaaa tagcaagtta a 51
<210> 45
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cacaccaggt ctcagaagct atcaccgcgt gtacattcct ctcttaccta taatggtac 59
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gttttacaac gtcgtgagat tcaaaacctc tttactgccg tt 42
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ccgtctctgg tccattattg atttccagtt tttaatttgt gtgt 44
<210> 48
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
acacacaaat taaaaactgg aaatcaataa tggaccagag acgg 44
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acgccagggt tttcccagtc tagccttgcc ctcaatgggg aagag 45
<210> 50
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ctcttcccca ttgagggcaa ggctagactg ggaaaaccct ggcgt 45
<210> 51
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aacggcagta aagaggtttt gaatctcacg acgttgtaaa ac 42
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种细菌启动子报告载体的构建方法及其应用