具体实施方式

以下结合附图详细阐述本发明的具体实施方式，本领域技术人员应当理解，此处的具体实施例仅用于示例性地描述本发明，而不应被视作对本发明保护范围的限定。

图1是本发明所述高通量实时单细胞电学本征参数实时测量系统示意框图。由图可知，所述高通量实时单细胞电学本征参数实时测量系统包括共三个子系统：微流控系统、多频阻抗测量系统和实时处理算法系统。以下详细描述各个子系统的结构设计。

微流控系统及器件结构设计

由图1可以看出，微流控系统由微流控器件与进样装置组成。图2是测量系统中微流控系统器件的结构示意图，如图2所示，考虑到制造和光学观察的便利性，本实施例中微流控器件芯片被设计为两层，结构示意图如图2(a)所示。底层以玻璃作为基底并配置有一对平面电极以进行阻抗检测，顶层则配置有聚二甲基硅氧烷(PDMS)微通道以使单细胞聚束列队依次通过检测区域，检测区域流道的尺寸由细胞大小决定。特别地，针对常见的哺乳动物细胞，在典型直径为8-18μm的范围时，为了实现高灵敏度且准确的单细胞电学表征并避免细胞阻塞和电流泄漏问题，如图2(b)所示，测量区域流道的宽度和高度均为20μm。同时为了降低发生多个细胞同时通过测量区域的可能性，测量区域的入口配置有间隔为20μm的柱状阵列作为片上过滤器，并根据伯努利原理设计为漏斗状从而产生压力分离距离太近的细胞。此外，通过对单细胞电学模型的分析优化的电极尺寸为30μm长，20μm宽和20μm间距。需要指出，给出的这个结构和尺寸并不是唯一的，可以根据应用场合进行适当调整。

图3是测量系统中微流控系统器件加工示意图及示例图。如图3所示，微流控器件的一种制造过程如图3(a)所示。微流道层通过软光刻技术制作，利用PDMS倒模形成，电极层通过lift-off技术图案化到玻璃基底上。在用氧等离子体处理并烘烤之后，将电极层和微通道层对准牢固地键合在一起。最终，为便于施加激励信号和采集测量信号，电极与其图案匹配的定制印刷电路板焊接在一起。图3(b)为器件的实例图，细胞悬浮液进口出口通过塑料软管与流体驱动装置相连，通过流体驱动装置将细胞悬浮液推注入微流道中。

单细胞电学参数测量原理

本实施例中的电学本征参数测量原理可以球形单壳模型为一种实例，实际上，任何模型都可以用本系统来实现。在球形单壳模型中，细胞可以表示为被电介质膜包裹的均匀导电细胞质。当悬浮的细胞处于交流电场中时，通过麦克斯韦的混合理论(MMT)，可以用单细胞和悬浮介质的特性来表示细胞-溶液混合体系的电学特性，其复数阻抗由式(1)给出：

其中κ是细胞常数，取决于几何参数，l是电极长度，是细胞-溶液混合体系的复介电常数，其中σ为电导率，ε为介电常数，ω为角频率，将其计算为如式(2)所示：

其中和是介质和细胞的复介电常数，是体积分数，是Clausius-Mossotti系数，由式(3)给出：

图4是单细胞等效电路模型及电阻抗谱，当细胞位于一对测量电极之间时，如图4(a)所示可以推导出等效电路模型ECM。在最简单的分析模型中，阻抗由溶液电阻R_med，溶液电容C_med，细胞质电阻R_i，细胞膜电容C_mem，双电层电容C_DL和杂散电容C_s组成。利用这些参数，计算细胞-溶液混合体系的阻抗如式(4)所示：

考虑到C_s和C_DL，模型总阻抗表示为如式(5)所示：

如图4(b)所示，计算出的电阻抗谱具有四个区域。在第一个区域(<0.1MHz)时，阻抗由C_DL主导，导致细胞-溶液混合体系的阻抗被淹没在高阻抗中；随着频率的增加，C_DL的影响在第二个区域(0.1MHz–0.5MHz)处呈指数下降，介电膜开始被电场穿透导致阻抗由膜电容调节，该膜的介电常数通常为10mF/m²；当频率在第三个区域(0.5MHz–5MHz)处连续增加时，介电膜被电场完全穿透，此时细胞质的电导率在阻抗谱中占主导地位；但是，第四个区域(>5MHz)的阻抗受C_s的影响，导致难以探索细胞核的性质。图4(b)展示了单细胞的电阻抗如何随本征参数的变化而变化，并为多频阻抗测量的频率选择提供了指导。根据上述讨论，本发明方法以其中四个频率(即45KHz，250KHz，750KHz和1200KHz)为例进行模型拟合和参数提取，其中45KHz和250KHz用于确定C_DL和细胞大小，750KHz用于确定细胞膜介电常数，1200KHz用于确定细胞质电导率和C_s。利用最小二乘法与梯度下降法，通过最小化测量阻抗值与模型估计值(模型总阻抗)之间的方差确定单细胞的本征参数如式(6)所示：

多频阻抗测量系统设计与原理

细胞穿过测量区域时将替换等体积的介质并扰动电场，从而导致电路中阻抗的变化。图5是单细胞通过测量电极产生的电信号示意图以及锁定放大器原理图。如图5(a)所示，该信号具有高斯形状，其中的峰值对应于特定频率下的细胞阻抗。如图5(b)所示，阻抗测量的基本原理是将电流信号通过跨阻放大器TIA转换为电压信号，并通过锁相放大器LIA检测所得的微弱响应信号，从而实现对单细胞阻抗的测量。本实施例基于混频原理单细胞测量原理中的四频点余弦信号通过加法器进行调制，表示为如式(7)所示：

S(t)＝cosω₁t+cosω₂t+cosω₃t+cosω₄t (7)，

随后分别通过四个解调器将响应信号R(t)解调为实电压和虚电压，如式(8)所示：

利用跨阻放大器TIA中使用的已知参考反馈电阻R_F和测量系统的校准系数，计算出复数阻抗。

图6是测量系统中多频阻抗测量硬件系统示意图及软件系统处理流程图，其中，多频阻抗测量硬件系统如图6(a)所示，其用于负责产生激励信号，解调响应信号并获取输出直流信号。作为一种实例，四频信号发生器基于DDS芯片AD9958(ADI，美国)搭建，跨阻放大器TIA基于高增益带宽、低偏置电流运算放大器芯片OPA657(TI，美国)搭建，解调器基于宽带四象限电压输出乘法器AD835芯片(ADI，美国)搭建和具有5KHz截止频率的低通滤波器和放大器由高精度，低噪声运算放大器OPA227(TI，美国)搭建。最终输出的直流信号由计算机通过数据采集卡(NI，PCI-6289)以20KHz的采样率进行采样获取，并在计算机上由软件系统进行后续处理。软件系统处理流程如图6(b)所示，用于负责实时处理，显示和记录数据。软件系统基于Python，Matlab(Math Works，美国)和LabView(NI，美国)混合编程，首先通过数字低通滤波器对数据流进行数字滤波，以进一步提高信噪比(SNR)，随后在Matlab脚本中检测单细胞事件并提取相应的单细胞阻抗峰值。提取的阻抗峰值通过TCP/IP协议发送到Python节点，以通过训练好的神经网络计算单细胞的本征参数，并将计算结果显示在图形界面中，整个工作流程都在实时在线模式下进行。

实时算法设计与原理

本实施例利用神经网络技术快速分析复杂的输入数据并以高精度预测输出的优势。图7是本实施例所应用的神经网络结构示意图，如图7所示，在开源框架Pytorch下搭建了一个深层全连接神经网络FCN用于处理阻抗数据流，从而实现对单细胞本征参数的实时求解。设计的FCN由五层组成，第一层为输入层(负责接收输入数据)，中间三层为隐藏层(负责将输入数据映射到输出数据)，最后一层是输出层(负责导出输出结果)。每一层都由多个神经元组成，这些神经元获得前一层的加权总和，并利用线性整流ReLU激活函数将加权总和转换为输出。ReLU激活函数将非线性特性引入了神经网络系统。为了求解单细胞的本征参数，FCN的输入为四频点的单细胞阻抗幅度，输出则为本征参数，因此选择均方误差函数作为损失函数计算标签值与输出值的偏差，并通过使用随机梯度下降(SGD)优化器反向传播误差对FCN进行监督训练。通过传统的基于梯度下降算法模型拟合获得的本征参数估计值用作训练数据的目标标签。完整的数据集分为训练集(70％)与测试集(30％)两个数据集，分别用于训练和测试。在测试过程中，单细胞事件的推导时间约为0.3ms，而基于梯度下降的模型拟合方法则需要几秒钟才能解算得本征参数，从而使处理速度提高了数个数量级，从而实现了实时在线单个细胞的本征参数求解。

图8是本发明所述高通量实时单细胞电学本征参数实时测量系统的使用流程框图。如图所示，使用所述测量系统实时测量单细胞电学本证参数时，依次包括以下步骤：

步骤S1：流道修饰，具体是将微通道用1wt％，即1x PBS的Pluronic F-127表面活性剂预处理15分钟；

步骤S2：细胞进给，具体是使用注射泵将单细胞样品以1μL/min的恒定流速通入微通道中，其中，在测量区域的等效速度为20mm/s，从而实现超过1000个细胞/分钟的高通量；

步骤S3：信号测量，具体是当单细胞在流道中列队通过测量区域时，所产生的电信号由阻抗测量系统采集并经过实时处理算法求解得到单细胞本征参数；

步骤S4：将步骤S3中所得到的单细胞本征参数实时显示在用户界面上。

在电学测量过程外，系统使用过程中也可使用配备CCD相机的倒置显微镜监视和记录细胞的运动，并通过时间戳与电信号同步，从而可以离线分析以将电阻抗信号与微观观察相关联。

相较于现有技术，本发明具有如下优势：

1)利用微流控技术、阻抗流式分析技术与锁定放大技术，提高单细胞电学表征系统的通量的同时降低测量系统的复杂程度，构筑了一套样本入-结果出的单细胞表征方法和系统；

2)利用多频锁定放大原理，通过测量四个频点的阻抗值基于梯度下降的模型拟合方法离线解算出电学本征参数；

3)利用神经网络技术快速分析复杂的输入数据并以高精度预测输出的优势，将解算时间由秒级下降至亚毫秒级，实现对单细胞进行高通量实时在线电学本征参数测量。

综上所述，本发明结合阻抗流式芯片结构设计、电学本征参数提取方法与人工智能与机器学习等数据分析方法，实现对单细胞电学特性本征参数的在线实时测量，构筑样本入-结果出的单细胞表征系统，并为后续的特异性分选与进一步的代谢组学分析构建技术基础。本发明具有多重意义，既能解决单细胞本征参数高通量实时精确测量的难题，还可为进一步通过组学研究探索细胞生物物理特性的深层次分子水平调控机制提供技术基础，推动单细胞分析向即时诊断和临床应用纵深发展。这种包含微流控技术、单细胞测量和人工智能和机器学习等多领域交叉的技术方案有望将单细胞分析提升到新的水平，对生命科学研究、疾病诊断和个性化医学具有重大意义。