阅读说明：本技术 一种绿脓杆菌胶体金检测卡及检测方法 (Pseudomonas aeruginosa colloidal gold detection card and detection method ) 是由 甄俊杰 吴靖华 龚俊宇 于 2019-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于传染病检测领域,涉及一种绿脓杆菌胶体金检测卡及检测方法。本发明所述的胶体金检测卡包括试纸条以及检测卡外壳,所述试纸条包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样品垫；所述硝酸纤维素膜粘结在所述底板的中部；所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有结合垫,另一端粘贴有吸水纸,所述结合垫上粘贴有样品垫；所述试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中,检测卡外壳上设有加样窗口和检测结果显示窗口,样品垫位于加样窗口,硝酸纤维素膜位于检测结果显示窗口。本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金检测卡能够快速检测绿脓杆菌,且具有灵敏度高、特异性强的优点。(The invention belongs to the field of infectious disease detection, and relates to a pseudomonas aeruginosa colloidal gold detection card and a detection method. The colloidal gold detection card comprises a test strip and a detection card shell, wherein the test strip comprises a bottom plate, a nitrocellulose membrane, a combination pad, absorbent paper and a sample pad; the nitrocellulose membrane is bonded in the middle of the bottom plate; one end of the nitrocellulose membrane is pasted with a combination pad, the other end of the nitrocellulose membrane is pasted with absorbent paper, and the combination pad is pasted with a sample pad; the test strip is arranged in a strip flat shell-shaped detection card shell, a sample adding window and a detection result display window are arranged on the detection card shell, the sample pad is positioned in the sample adding window, and the nitrocellulose membrane is positioned in the detection result display window. The colloidal gold detection card for pseudomonas aeruginosa can be used for rapidly detecting pseudomonas aeruginosa and has the advantages of high sensitivity and strong specificity.)

一种绿脓杆菌胶体金检测卡及检测方法

技术领域

本发明属于传染病检测领域，具体涉及一种绿脓杆菌胶体金检测卡及检测方法。

背景技术

绿脓杆菌（P.aeruginosa）或称铜绿色假单胞菌，是一种致病力较低但抗药性强的杆菌。它广泛存在于自然界，是伤口感染较常见的一种细菌，能引起化脓性病变，感染后，因脓汁和渗出液呈绿色，故名。绿脓杆菌（P.aeruginosa）属假单胞菌属(Pseudomonas)，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道。当人体免疫功能低下（如器官移植、各种原因引起的白细胞降低、长期使用肾上腺皮质激素、反复应用大量抗生素等）时，极易被其感染。

绿脓杆菌是临床检验的主要病原菌之一。世界卫生组织（WTO）将此菌作为瓶装水的污染危害指示菌，日本、英国、加拿大等国已经对瓶装矿泉水的绿脓杆菌的检出作出限定。近年来畜禽养殖中屡屡爆发绿脓杆菌病，且此菌常可以经水果、蔬菜而传染，绿脓杆菌已被确认为食源性和水源型病菌，是对人体健康的又一大威胁。因此，建立可行的绿脓杆菌检测方法势在必行。

CRISPR系统是目前已发现存在于大多数细菌中的一种细菌免疫系统，被用来识别和摧毁噬菌体和其它病原体入侵。CRISPR为细菌基因组中的独特DNA区域，储存有病毒DNA片段，从而允许细菌细胞能够识别试图再次感染它的病毒。CRISPR区域序列经转录后产生的短RNA序列(被称作crRNA)在识别并结合病毒核酸后，导致与crRNA结合的Cas蛋白(或称为Cas酶)对病毒核酸进行剪切。迄今已发现了多种CRISPR/Cas系统，例如CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a。不同于Cas9，Cas12a在激活后具有相应的核酸酶活性，除了能够对靶核酸切割之外，还具有附带切割(collateral cleavage)活性，能够继续切割附近其它的非靶单链DNA。基于这些特征，可以将Cas12a用于样品中靶核酸的检测。但是，其灵敏度难以满足检测要求。LAMP检测技术作为一种基于核酸扩增的新方法，自2000年出现以来为鉴别微生物病原提供了很大的帮助，其操作方法简单、反应时间短，只需要在恒温的水浴锅中就可以完成反应，与PCR方法相比，不需要昂贵的PCR仪进行温度循环，大大降低了检测成本。

本发明将LAMP扩增技术、Cas12a检测技术和胶体金试纸条技术结合起来，实现对绿脓杆菌快速、高特异性和灵敏性检测。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供一种绿脓杆菌胶体金检测卡及检测方法，具有操作方便、检测迅速、特异性高和灵敏度强等优点。

首先，本发明提供一种绿脓杆菌胶体金检测卡包括试纸条以及检测卡外壳，所述试纸条包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样品垫；其特征在于，所述硝酸纤维素膜，粘结在所述底板的中部；所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有结合垫，另一端粘贴有吸水纸，所述结合垫上粘贴有样品垫；所述试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中，检测卡外壳上设有加样窗口和检测结果显示窗口，样品垫位于加样窗口，硝酸纤维素膜位于检测结果显示窗口。

优选地，所述硝酸纤维素膜上设有测试线和控制线，所述测试线上喷洒有捕获探针，所述控制线上喷洒有生物素化兔多克隆抗体；所述测试线位于靠近结合垫一侧，所述控制线位于靠近吸水纸一侧。

优选地，所述结合垫上固定胶体金标记的链霉亲和素，所述结合垫上纳米金颗粒直径为15-20nm。

优选地，所述样品垫是按照如下方法制备的：将玻璃纤维浸泡在含有 1% BSA、2%Triton、2% PEG4000、20 mM Tris-Ac和 50mM NaAc的溶液中，晾干后，4℃储存备用。

优选地，所述捕获探针是与reporter 单链报告分子互补的单链DNA。

优选地，所述胶体金标记的链霉亲和素是按照如下方法制备的：

（1）在350mL的圆底烧瓶中加入100 mL 1 mM的氯金酸溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中加入3.5 mL 1%柠檬酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10min，停止加热，继续搅拌15min，得到胶体金AuNP溶液，4℃避光保存。

（2）向1mL步骤（1）制备的胶体金溶液中加入100 µL悬液缓冲剂(20 mM Na₃PO₄，5 %BSA，0.25 % Tween-20，10 % sucrose，和0.1 % NaN₃)，5min后加入0.5 mg/mL的SA（链霉亲和素），4℃震荡3 hours。加入10%BSA（100μL）封闭30min，4℃离心（12000 rpm, 25 min），用所述悬液缓冲剂进行洗涤移除未键合的SA，得到AuNP-SA（胶体金标记的链霉亲和素）探针。弃清液，用100 μL悬液缓冲剂重悬AuNP-SA探针。

其次，一种所述绿脓杆菌胶体金检测卡的检测方法，其操作步骤如下：

将绿脓杆菌的靶DNA或者整个细胞经LAMP方法进行扩增和Cas12a体系检测后，将所得溶液作为检测样品，滴加到所述胶体金检测卡的加样窗口上，5分钟内，用肉眼观察结果或者用便携式胶体金读卡仪读取结果；

优选地，所述LAMP方法为：将绿脓杆菌的靶DNA或者整个细胞加入反应体系（四条引物F3，B3，FIB，FIP，dNTP，MgSO₄；1×等温放大缓冲液），在95℃条件下加热5min后，冷却，再加入8U Bst DNA聚合酶，在65℃保温15-30min，然后在80℃的条件下加热10min，终止反应，得到扩增产物；

优选地，所述Cas12a体系检测方法为：将LbaCas12a-crRNA activator混合物（12 µL 1×***缓冲液 (150 mM KCl，10 mM MgCl₂，1 % glycerol，0.5 mM DTT，20 nM HEPES (pH7.5))，3 µL crRNA (300 nM)，1µL LbaCas12a (36 nM) 和 5 µL activator (40 nM)）在37℃条件下反应30min后，加入2 µL生物素化 reporter (20 nM)和2 µL所述LAMP扩增产物，均匀混合后，在37 ℃条件下反应15min，然后98℃条件下加热2min后，终止反应。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

（1）本发明的一种绿脓杆菌胶体金检测卡测定绿脓杆菌的操作方便，不需要特殊实验条件，在5分钟内用肉眼观察结果或者用便携式胶体金读卡仪读取结果，可用于临床检查，在医疗领域具有良好的应用前景。

（2）本发明的一种绿脓杆菌胶体金检测卡测定绿脓杆菌特异性强，其他病菌对检测信号不产生干扰。只有当样品中有绿脓杆菌细胞或者靶DNA时，reporter单链报告分子才会被切割而不能被测试线上包被的捕获探针所捕。

（3）本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金检测卡测定绿脓杆菌灵敏度高。将绿脓杆菌进行LAMP扩增后，再对其进行检测可显著提高检测的灵敏度。

附图说明

图1为本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金试纸条侧面结构示意图。

图2为本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金检测卡检测原理示意图。

图3为本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金检测卡灵敏度检测结果示意图。

图4为本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金检测卡特异性检测结果示意图。

图5为本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金检测卡对实际样品检测结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金检测卡，如图1所示，包括试纸条以及检测卡外壳，所述试纸条包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样品垫，其制备方法如下：

将样品垫、硝酸纤维素膜、结合垫和吸水纸依次粘结在所述底板上，重叠部分为2mm，然后切成3.5mm宽的条带；

所述试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中，检测卡外壳上设有加样窗口和检测结果显示窗口，样品垫位于加样窗口，硝酸纤维素膜位于检测结果显示窗口；

所述硝酸纤维素膜上自靠近吸水纸端依次设有控制线、测试线，所述测试线上喷洒有捕获探针，所述捕获探针是与reporter 单链报告分子互补的单链DNA，所述控制线上喷洒有生物素化兔多克隆抗体；所述结合垫上固定胶体金标记的链霉亲和素AuNP-SA；

所述吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫的长度分别为18 mm、20 mm、9 mm和18mm；

所述控制线与测试线之间的距离为10 mm；

所述样品垫是按照如下方法制备的：将玻璃纤维浸泡在含有 1% BSA、2% Triton、2%PEG4000、20 mM Tris-Ac 和 50mM NaAc 的溶液中，晾干后，4℃储存备用。

所述胶体金标记的链霉亲和素中纳米金粒径为10~15 nm。

所述捕获探针序列为3’-AAAAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAATAA-5’。

实施例2

实施例1所述胶体金标记的链霉亲和素AuNP-SA，其制备方法包括以下步骤：

（1）在350mL的圆底烧瓶中加入100 mL 1 mM的氯金酸溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中加入3.5 mL 1%柠檬酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10min，停止加热，继续搅拌15min，得到胶体金AuNP溶液，4℃避光保存。

（2）向1mL步骤（1）制备的胶体金溶液中加入100 µL悬液缓冲剂(20 mM Na₃PO₄, 5% BSA, 0.25 % Tween-20, 10 % sucrose和0.1 % NaN₃)，5min后加入0.5 mg/mL的SA（链霉亲和素），4 ℃震荡3 hours。加入10%BSA（100μL）封闭30min，4℃离心（12000 rpm, 25min），用所述悬液缓冲剂进行洗涤移除未键合的SA，得到AuNP-SA（胶体金标记的链霉亲和素）探针。弃清液，用100 μL悬液缓冲剂重悬AuNP-SA探针。

实施例3

一种所述绿脓杆菌胶体金检测卡的检测方法

A、构建检测的反应体系：反应体系包含LAMP扩增体系和Cas12a检测体系；LAMP扩增体系：四条引物F3，B3，FIB，FIP，dNTP，MgSO₄；1×等温放大缓冲液；Cas12a检测体系包括LbaCas12a-crRNA-activator混合物和reporter探针；具体操作方法：首先，提取绿脓杆菌的靶DNA或者整个细胞，加入到LAMP扩增体系中，在95℃条件下加热5min后，冷却，再加入8UBst DNA聚合酶，在65℃保温15-30min，然后在80℃的条件下加温10min终止反应，得到扩增产物dsDNA；接着，将LbaCas12a-crRNA-activator混合物（12 µL 1×***缓冲液 (150 mMKCl, 10 mM MgCl₂，1 % glycerol，0.5 mM DTT，20 nM HEPES (pH 7.5))，3 µL crRNA(300 nM)，1 µL LbaCas12a (36 nM) 和 5µL activator (40 nM)）在37℃条件下反应30min后，加入2 µL生物素化 reporter (20 nM)和2 µL所述LAMP扩增产物，均匀混合后，在37 ℃条件下反应15min，然后98℃条件下加热2min，终止反应。

其中，所述绿脓浓杆菌靶DNA序列为

5’-GGGGAGGATGTCGGGCGCGCACGTTTTCCCTTCGCTGAGCACGCTGCGCGCGTCGCCTACGTGAATGCGCTGTTCGATGCGTTGGCCGAAGGCAACCCGCGGGTGAGCGTGCTCGACCCCTCCAGCGTGCTCTGCGATGGCCTGGATTGTTTCGCCGAACGTGATGGCTGGTCGCTGTACATGGATAACA-3’

引物对序列为

F3 GGGATGATCGAAAGGCTG

B3 TCGAGGCTCTGTAGCATC

FIP(F1c+F2) TACGACTCAGCCGCACCACATGTCTGGCTGGTCAAG

BIP(B1c+B2) CTCTGCGATGGCCTGGATTAGGTGGTTGTTATCCATGTACC

生物素化Reporter序列为Bio-5’-TTTTTTTTATT-3’

Activator序列为 TTTAGGCAACCCGCGGGTGAGCGTG

CrRNA序列为

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACAGCACGCUCACCCGCGGGUUGCCU

B、一种绿脓杆菌胶体金检测卡的检测方法

取60 µL步骤A反应所得溶液作为检测样品，滴加到实施例2所制备的胶体金检测卡的样品垫上，5分钟后，用肉眼观察结果或者用便携式胶体金读卡仪读取结果。

检测原理：如图2所示，LAMP扩增产物加入Cas12a检测体系中，一旦Cas12a和crRNA复合体识别切割靶序列之后，可以触发对于reporter单链报告分子的切割活性，从而对其进行切割。样品中绿脓杆菌靶DNA含量越高，切割后，待测液中的生物素化reporter含量越低。

将待测液滴加到样品垫后，由于层析作用，待测液向吸水纸方向层析，当生物素化reporter到达结合垫时，与其包被的胶体金标记链霉亲和素结合形成复合物，扩散到测试线上，复合物被测试线上包被的捕获探针捕获，并且被固定在测试线上，当测试线处聚集了一定量的复合物时，就会出现肉眼可见的红色条带，未结合的复合物和过量的胶体金标记链霉亲和素经过测试线到达控制线与包被在上边的生物素化兔多克隆抗体结合形成肉眼可见的红色条带。当样品中没有生物素化reporter或者其含量很少时，不能在测试线处形成肉眼可见的红色条带。用便携式胶体金读卡仪对滴加过待测液的胶体金试纸条进行检测，测试线和控制线上聚集的胶体金含量越高，检测到的信号越强。

实施例4

本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金检测卡，其灵敏度检测方法如下：

对绿脓杆菌靶DNA进行梯度稀释（10^-9M、10^-11 M、10^-13 M、10^-15 M、10^-17 M、10^-19 M、10^-21M、10^-23 M、10^-25 M），按照实施例3所述试验方法，对不同浓度的绿脓杆菌进行检测，结果如图3a（从左到右依次为10^-9 M、10^-11 M、10^-13 M、10^-15 M、10^-17 M、10^-19 M、10^-21 M、10^-23 M、10^-25 M），为10^-9 M、10^-11 M、10^-13 M、10^-15 M对应的检测卡只有C区显红色，T区不显色；10^-17 M、10^-19 M、10^-21 M、10^-23 M、10^-25 M对应的检测卡C区和T区都显红。用便携式胶体金读卡仪对本实施例所述的9种浓度的绿脓杆菌对应的胶体金检测卡进行检测，结果如图3b所示，10^-9M、10^-11 M、10^-13 M、10^-15 M对应的测试线峰强度基本为零，控制线峰强度无明显改变。该检测卡检测绿脓杆菌的检出限为10^-15M。

按照实施例3所述方法，对梯度稀释的绿脓杆菌重组菌落（10⁸ cfu/mL，10⁷ cfu/mL，10⁶ cfu/mL，10⁵ cfu/mL，10⁴ cfu/mL，10³cfu/mL，10² cfu/mL，10 cfu/mL，1 cfu/mL和0cfu/mL）进行检测，重组菌落的检出限为1 cfu/mL。

实施例5

本发明所述的一种绿脓杆菌胶体金检测卡，其特异性检测方法如下：

按照实施例3所述检测方法，分别使用1 cfu/mL的大肠杆菌O157：H7，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲杆菌，伤寒沙门氏杆菌，痢疾杆菌作为对照，在相同浓度下，分析本发明制备的检测卡对绿脓杆菌检测的特异性（本发明检测绿脓杆菌的灵敏度为1 cfu/mL）。检测结果如图4a（从上往下依次为大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、伤寒沙门氏杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌）所示，对照细菌的T区可以看到明显的红色条带，而绿脓杆菌对应的T区看不到颜色变化。胶体金读卡仪检测结果显示，绿脓杆菌对应的测试线对应的峰强度基本为零，而其他5种对照细菌对应的测试线峰很明显（图4b）。说明该检测卡对绿脓杆菌的检测具有特异性。

实施例6

实际样品检测

收集40份疑似绿脓杆菌患者的痰样，并经过氧化酶试验和传统培养基培养，确认阳性标本20份，阴性标本20份。将这40份样本分别取1 mL进行加热(95℃, 5 min)和离心(12000 × g, 5 min)，保留上层溶液（含粗基因组DNA），按照实施例3所述的方法进行实验，实验结果（图5）表明，该方法（dCIA-based LFB）的检测结果与传统培养基培养（Culture）检测结果一致，且检测所需时间短，不需要电泳、荧光仪以及单克隆抗体。