基于rsv f蛋白融合前特异性抗体的双抗体夹心elisa方法及应用
阅读说明：本技术 基于rsv f蛋白融合前特异性抗体的双抗体夹心elisa方法及应用 (Double-antibody sandwich ELISA (enzyme-Linked immuno sorbent assay) method based on RSV (respiratory syncytial virus) F protein pre-fusion specific antibody and application ) 是由 李雄雄 王婉 陈玥如 唐悦 王名强 王宇 傅生芳 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及病毒检测技术领域,具体涉及一种基于RSV F蛋白融合前特异性抗体的双抗体夹心ELISA方法及应用,该双抗体夹心ELISA方法可以更为准确地检测RSV病毒滴度,同时提供直观数据,其分别选择融合前特异性抗体AM14作为包被抗体,选择D25作为检测抗体,包被抗体浓度为1000ng/孔,检测抗体稀释比例为1:3000。本发明建立的双抗体夹心ELISA方法与人轮状病毒、人3型副流感病毒以及牛血清均无交叉反应,特异性良好。本发明用该方法对不同稀释倍数的RSV病毒进行多次重复试验,结果证明该方法CV＜10%。本发明重复性、广谱性、灵敏度良好,具有易操作,周期短的特点。(The invention relates to the technical field of virus detection, in particular to a double-antibody sandwich ELISA method based on RSV F protein pre-fusion specific antibody and application thereof, wherein the double-antibody sandwich ELISA method can more accurately detect RSV virus titer and simultaneously provides visual data, the double-antibody sandwich ELISA method respectively selects the pre-fusion specific antibody AM14 as a coating antibody and selects D25 as a detection antibody, the concentration of the coating antibody is 1000 ng/hole, and the dilution ratio of the detection antibody is 1: 3000. The double-antibody sandwich ELISA method established by the invention has no cross reaction with human rotavirus, human parainfluenza virus 3 and bovine serum, and has good specificity. The method is used for carrying out repeated tests on RSV viruses with different dilution times, and the result proves that CV of the method is less than 10%. The method has the characteristics of good repeatability, broad spectrum, good sensitivity, easy operation and short period.)
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种基于RSV F蛋白融合前特异性抗体的双抗体夹心ELISA方法及应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus ,RSV)是一种引起婴幼儿、老年人及免疫缺陷者呼吸道严重感染的病原体，发病率高，流行范围广。因目前没有针对RSV感染的特异性预防措施，疫苗研发是当前的迫切需求。在疫苗研发过程中，病毒滴度检测是评估新的疫苗候选株感染力和毒力的重要工具。
目前，RSV病毒滴度的常用检测方法有CCID50,噬斑法、免疫荧光检测法、ELISA方法、RT-PCR等，每种方法都有自身的优缺点，RT-PCR方法出现假阳性的概率较高，其他试验需要专业的人员对病毒引起的细胞病变进行准确地判断，ELISA方法作为检测抗原的一种常用方法，易操作、周期短。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于RSV F蛋白融合前特异性抗体的双抗体夹心ELISA方法及应用，为实验室RSV病毒滴度检测提供了一种更精确、高效的检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
基于RSV F蛋白融合前特异性抗体的双抗体夹心ELISA方法，选择融合前特异性抗体AM14作为包被抗体、融合前特异性抗体D25作为检测抗体检测RSV滴度。其中，所述包被抗体AM14浓度为1000ng/孔，检测抗体D25稀释比例为1:3000。
本发明所述的基于RSV F蛋白融合前特异性抗体的双抗体夹心ELISA方法可以准确测定RSV滴度，同时提供直观数据，可用于不同型别RSV病毒滴度的检测。
本发明建立的双抗体夹心ELISA方法与人轮状病毒、人3型副流感病毒、牛血清无交叉反应，特异性良好。本发明用该方法对不同稀释倍数的RSV病毒进行多次重复试验，结果证明该方法CV＜10%；；用该方法检测RSV A，B不同亚型，均具有较高的灵敏度，证明本发明可以检测不同型别RSV病毒滴度。本发明也可以应用于重组RSV F蛋白的测定。
与CCID50比较，本发明建立的双抗体夹心ELISA方法具有更高的检测灵敏度。本发明建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的重复性、广谱性和灵敏度，为实验室测定RSV病毒滴度提供了一种高效、便捷的方法。
附图说明
图1为不同包被抗体的双抗体夹心ELISA测定RSV滴度结果；
图2 为不同浓度包被抗体的双抗体夹心ELISA测定RSV滴度结果：图中: A: 125ng/孔；B: 250 ng/孔；C: 500 ng/孔；D: 1000 ng/孔；
图3 为不同浓度检测抗体的双抗体夹心ELISA测定RSV滴度结果：图中： A:1:1000；B:1:2000；C:3000；D:4000；
图4为双抗体夹心ELISA方法特异性验证结果：图中：1： B亚型RSV；2：人轮状病毒G1型；3：人3型副流感病毒；4：牛血清；5：阴性对照；
图5为双抗体夹心ELISA方法广谱性试验结果：
图中：1：B亚型RSV；2：A亚型RSV；3：重组RSV F蛋白；4：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
试验材料：
RSV F蛋白融合前特异性抗体(AM14抗体、D25抗体），由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室制备。RSV A、B亚型毒株、人轮状病毒G1型、人3型副流感病毒均为兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室提供。
PBST洗液、显色液、酶稀释液由兰州生物制品研究所有限责任公司诊断试剂室提供。PBS、MEM培养液由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室提供。HRP抗体标记试剂盒购自abcam公司。牛血清购自兰州荣晔生物公司。酶标板购自Costar公司。Spectra MaxM3酶标仪购自美国MD公司。
试验方法：
包被抗体的选择
分别用AM14、D25抗体包被96孔板，37℃作用1h，用含20%牛血清的封闭液37℃封闭2h。将RSV毒株进行10倍系列稀释，稀释范围101-108,按照50µL/孔加入板中，37℃作用1h。同样倍数稀释检测抗体，37℃作用1h。在同样的条件下进行试验，显色读数，比较两种不同抗体作为包被抗体测定RSV滴度的A 450nm值。
包被抗体浓度的确定
分别选择不同的抗体包被量（125 ng/孔、250 ng/孔、500 ng/孔、1000ng/孔）进行包被，检测RSV毒株的滴度。将RSV毒株进行10倍系列稀释，稀释范围101-1010,按照50µL/孔加入板中，37℃作用1h。在同样的条件下进行试验，显色读数，结果判定标准：以大于阴性值的2.1倍作为阳性值，判定包被抗体的最佳工作浓度。
检测抗体浓度的确定
将抗体按照abcam公司HRP Conjugation Kit说明书进行HRP标记后，分别进行1：1000、1:2000、1:3000、1:4000稀释，37℃作用1h，检测RSV毒株的滴度，在同样的条件下进行试验，显色读数。将RSV毒株稀释至101-1010，研究RSV的稀释倍数与A 450nm值的相关性，以确定检测抗体的最佳稀释比例。
双抗体夹心ELISA方法的验证
特异性验证
选取人轮状病毒G1型、人3型副流感病毒、牛血清与B亚型RSV同时进行检测，用建立的双抗体夹心ELISA方法验证其特异性。用融合前特异性抗体AM14作为包被抗体，浓度为1000ng/孔，在37℃条件下作用1h，用含20%牛血清的封闭液，37℃封闭2h。按50µL/孔的量加入上述病毒，37℃条件下作用1h。D25作为检测抗体，稀释比例为1:3000，按50µL/孔加入板中，37℃条件下作用1h。最后按常规方法显色读值。
重复性试验
取同一批次包被的 ELISA 板，按建立的双抗体夹心 ELISA 方法检测RSV病毒。将RSV病毒稀释至101、102、104倍进行检测，测定A 450nm值，用统计学中的常规公式，变异系数=（标准偏差/平均值）×100%，计算变异系数，评估该方法的重复性。
广谱性试验
利用建立的双抗体夹心ELISA方法检测不同亚型的RSV及表达的重组RSV F蛋白，评价该方法的广谱性。
灵敏度试验
将RSV毒株10倍倍比稀释（101-1010倍），利用建立的双抗体夹心 ELISA 方法进行检测，同时进行该毒株CCID50的测定，评价该方法的灵敏度。
结果
包被抗体的选择
不同的包被抗体检测到RSV滴度的A450nm值略有不同，稀释倍数越高，A 450nm值的差异性越小，说明在病毒滴度较高的情况下，不同的包被抗体与RSV的结合存在一定的差异性，结果见图1。用AM14抗体作为包被抗体检测得出的A 450nm值略高于D25抗体， 因此，选择AM14抗体作为包被抗体，开展双抗体夹心ELISA方法建立的一系列后续试验。
包被抗体浓度的确定
将RSV毒株进行10倍系列稀释，稀释范围101-1010，用不同的包被抗体与检测抗体浓度进行检测，包被抗体浓度为1000ng/孔时可以检测到109为阳性，见图2。
检测抗体浓度的确定
在确定包被抗体浓度后，用不同的检测抗体稀释比例检测RSV的病毒滴度，在检测抗体稀释比例为1:3000时，RSV稀释倍数与A 450nm值有较高的相关性，见图3。
特异性验证
选取人轮状病毒G1型、人3型副流感病毒、牛血清与B亚型RSV同时进行检测，见图4，人轮状病毒G1型、人3型副流感病毒、牛血清检测结果均为阴性。该方法与其他病毒、辅料成分无交叉反应，说明特异性良好。
重复性试验
将不同稀释倍数的RSV病毒按照建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测，每个稀释倍数重复5次，变异系数在2.1%-7.6%之间，CV＜10%，结果显示重复性较好，见表1。
表1 重复性试验结果
广谱性试验
利用建立的双抗体夹心ELISA方法，可以检测不同亚型的RSV以及表达的重组RSVF蛋白，说明该方法广谱性强，可检测范围广，见图5。
灵敏度试验
将RSV毒株10倍倍比稀释（101-1010倍），利用建立的双抗体夹心 ELISA 方法进行检测，可以检测病毒滴度至109，该毒株进行CCID50的测定，只能检测到108，可见，该方法的灵敏度高于CCID50。
表2 灵敏度试验结果
可见，本发明建立的双抗体夹心ELISA方法与轮状病毒、人3型副流感病毒、牛血清无交叉反应，特异性良好。将不同稀释倍数的RSV病毒重复进行试验，CV＜10%；不同亚型的RSV及蛋白进行试验，均能检测到结果；检测结果与CCID50比较，其可以检测病毒滴度至109，高于CCID50。综上，本发明的双抗体夹心ELISA方法具有易操作，周期短的特点，重复性、广谱性、灵敏度良好。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。