阅读说明：本技术 三萜类化合物及其应用 (Triterpenoid and application thereof ) 是由 何祥久 王宜海 李海燕 徐静雯 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了三萜类化合物,其结构通式为：<Image he="506" wi="591" file="DDA0002216198380000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>或<Image he="469" wi="596" file="DDA0002216198380000012.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明的三萜类化合物对肿瘤细胞的细胞毒性具有不同程度的肿瘤抑制作用,表明其可以进一步作为新的抗肿瘤药物进行研究开发。(The invention discloses a triterpenoid compound, which has a structural general formula as follows: or The triterpenoid compound has tumor inhibition effects of different degrees on the cytotoxicity of tumor cells, and shows that the triterpenoid compound can be further used as a new anti-tumor medicament for research and development.)

三萜类化合物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一类新型的三萜类化合物及其应用。

背景技术

癌症是全球高致死率的病症之一，是一个全球关注持续的热点，因此，与癌症的斗争呈现出现代科学技术面临的重大挑战。抗癌药物领域的研究依然是热点宇难点。天然药物尤其是来源于植物的药物具有化学结构多样性和生物活性多样性，一直是人类预防和治疗疾病的主要来源。临床上应用的许多药物都直接或间接来源于天然产物，天然产物不仅可以作为药物半合成的前体物，而且可以作为药物化学合成的的模板，为新药设计提供新思路。天然产物已成为发现新药物或先导化合物的主要源泉之一。

骆驼蓬(Pegannum harmala L.)为蒺藜科(Zygophllaceae)骆驼蓬属(Peganum)多年生草本植物全草，因植株能散发出一种类似于骆驼体味的特殊气味而得名。骆驼蓬分布于亚洲、欧洲、北非等干旱或半干旱荒漠轻度盐碱化地区，是一种重要的荒漠植被植物。骆驼蓬全草或种子入药，为西北地区少数民族沿已久的民族药材，已被列入***药品标准维吾尔药分册。骆驼蓬性平，味苦，辛，有毒，主治筋脉软弱，关节骨痛，咳嗽痰多，神昏头痛等症。民间常用全草治关节炎、无名肿痛、癫痫、精神病等；种子可用于治咳嗽气喘，心慌烦躁，四肢麻木等。

骆驼蓬植物含有丰富的化学成分，其主要活性成分为生物碱类化合物，在种子中生物碱的含量高达4-6％。此外，骆驼蓬种子还含有少量的黄酮类、三萜类、蒽醌类以及甾醇极其苷类化学成分。现代药理实验研究表明骆驼蓬种子具有抗肿瘤、抗疟疾、抗炎、抗烟草花叶病毒和选择性激酶抑制作用等活性。现有研究对骆驼蓬种子化学成分研究仍不够彻底，对其富含的生物碱成分研究较多，而对其种子含有的三萜类、黄酮类研究甚少。因而骆驼蓬种子中三萜类化合物值得进一步研究和开发利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的三萜类化合物、其应用及制备方法。为达到上述目的，本发明采取如下的技术方案。

本发明第一方面的技术方案是：

一种三萜类化合物，其结构通式为：

式中，R1独立为乙酰氧基，

R2独立为氢、氧或羟基，

R3独立为羟基、羟甲基或

R4独立为乙酰氧基或羧基，

R5独立为羟基或乙酰氧基，

R6独立为羟甲基或

R7独立为羧基或乙酰氧基。

更进一步地，其结构式为：

本发明第二方面的技术方案是：

本发明第一方面的技术方案中所述的三萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述抗肿瘤药物中还含有药学上可接受的辅料。

进一步地，所述肿瘤是指人***、肝癌或胃癌中的至少一种。

本发明第三方面的技术方案是：

一种抗肿瘤药物，含有本发明第一方面的技术方案中所述的三萜类化合物。

进一步地，所述抗肿瘤药物中还含有药学上可接受的辅料。

进一步地，所述肿瘤是指人***、肝癌或胃癌中的至少一种。

本发明第四方面的技术方案是：

本发明第一方面的技术方案中所述的三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)取骆驼蓬种子，乙醇加热回流提取，合并提取液减压浓缩得到浸膏；

2)将浸膏用水混悬，酸化，氯仿萃取，得到非生物碱层；

3)非生物碱层通过色谱分离得到三萜类化合物。

进一步地，所述酸化是指加入盐酸将pH值调制1～2。

本发明的有益效果是：

本发明从骆驼蓬种子中提取出7种新型的三萜类化合物，并通过理化常数和现代波谱学手段进行鉴定，所得的7种新型的三萜类化合物化学结构明确，为进一步研究和开发利用骆驼蓬种子中三萜类化学成分的价值提供有力的参考资料。动物药效学试验表明，本发明提供的7种新型的三萜类化合物具有较好体外抗肿瘤活性，对HeLa(人***细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、SGC-7901(人胃癌细胞)三种人体肿瘤细胞的细胞毒性具有不同程度的肿瘤抑制作用，表明其可以进一步作为新的抗肿瘤药物进行研究开发。

附图说明

图1、2、3为本发明三萜类化合物对不同肿瘤细胞的抑制作用。

图4、5、6为本发明化合物1的氢谱、碳谱、红外图谱。

图7、8、9为本发明化合物2的氢谱、碳谱、红外图谱。

图10、11、12为本发明化合物3的氢谱、碳谱、红外图谱。

图13、14、15为本发明化合物4的氢谱、碳谱、红外图谱。

图16、17、18为本发明化合物5的氢谱、碳谱、红外图谱。

图19、20、21为本发明化合物6的氢谱、碳谱、红外图谱。

图22、23、24为本发明化合物7的氢谱、碳谱、红外图谱。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

实施例1三萜类化合物的提取

取干燥骆驼蓬种子药材30.8kg，用70％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液减压浓缩得到浸膏。将浸膏用水混悬，加入盐酸将pH调至1.0，用等体积氯仿萃取3次，得到非生物碱层。其中非生物碱层部分通过反复硅胶柱色谱、反相MPLC柱色谱、SephadexLH-20柱色谱及半制备反相HPLC柱色谱等手段，分离得到化合物1～7。

实施例2化合物1的鉴定

通过理化常数和波谱学手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY谱)对化合物1进行鉴定，图4、5、6为本发明化合物1的氢谱、碳谱、红外图谱。

化合物1为白色无定形粉末(氯仿)，在紫外灯365nm下有淡蓝色荧光吸收，在254nm下有暗斑，与10％的硫酸-乙醇显色剂加热反应显粉红色。IR(KBr)中，υ_max 3408(OH)，2962、1725(C＝O)，1384、1261、1097、1025、859、802cm^-1处为主要吸收。HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰HR-ESI-MS m/z 705.4361[M+H]⁺(calcd for C₄₃H₆₁O₈,705.4360).提示其分子量为704,其分子式是C₄₃H₆₀O₈。

¹H-NMR(600Hz,CDCl₃)谱中，在高场区中存在2个甲氧基质子信号分别为δ_H 3.94(3H,s)、3.68(3H,s)，1个乙酰基的甲基氢信号δ_H 2.02(3H,s)以及5个季碳上的甲基质子信号分别为δ_H 0.82(3H,s)、0.82(3H,s)、0.88(3H,s)、0.97(3H,s)、1.70(3H,s)，其中δ_H 1.70(3H,s)为羽扇豆烷型三萜的30-CH₃的特征氢信号，初步推测该化合物为羽扇豆烷型三萜类化合物；δ_H 7.08(1H,dd,J＝8.2,1.8Hz)、7.03(1H,d,J＝1.8Hz)、6.92(1H,d,J＝8.2Hz)为芳香环上的烯氢质子信号，推测苯环上存在1，3，4取代；δ_H 7.58(1H,d,J＝15.9Hz)、6.28(1H,d,J＝15.9Hz)为一组双键的质子信号，根据耦合常数推测其与苯环的1位连接；δ_H4.75(1H,s)、4.61(1H,s)推测为一组末端双键的质子信号；δ_H 4.61(1H,s)、4.46(1H,s)、4.44(1H,s)推测为连氧碳上的质子信号；根据氢谱信息初步推测该化合物为羽扇豆烷型三萜。

¹³C-NMR(150Hz,CDCl₃)谱中，共给出43个碳信号，其中δ_C 176.8、171.1、167.4为羰基碳信号，根据化学位移推测其为羧酸或酯羰基碳信号；δ_C 150.3、110.1和δ_C 144.8、114.8为两组双键碳信号，其中δ_C 150.3、110.1为羽扇豆烷型三萜20、29位的特征碳信号；δ_C148.1、146.9、127.0、123.1、115.9、109.6为6个SP²杂化碳信号；δ_C 80.8、63.3为连氧碳信号，其中δ_C 80.8为3位β羟基取代的特征碳信号；δ_C 51.9、51.5为2个甲氧基碳信号，δ_C 21.4为乙酰基甲基碳信号；δ_C 16.5、16.7、16.8、19.6、28.0为5个甲基碳信号；结合氢谱数据及上述碳谱化学位移值可推测此化合物存在一个阿魏酸酰基取代。

在HMBC谱中，δ_H 4.61(63.3)的质子信号与δ_C 167.4、41.6、24.2的碳有远程相关，确定阿魏酸酰基连接位置为C-27(δ63.3)；δ_H 2.02(21.4)的质子信号与δ_C 171.0、80.9的碳有远程相关，确定其C-3(80.9)的羟基乙酰化成酯；δ_H 3.68(51.5)的质子信号与δ_C 176.8存在远程相关，δ_H 1.41(36.8)的质子信号与δ_C 176.8、56.5、30.6存在远程相关，确定C-28为羧酸甲酯取代。综上信息鉴定化合物1为3β-acetoxy-27-(4-hgdroxy-3-Methoxy-E-cinnamoy-loxy)-en-28-oic acid methyl ester。化合物1的¹H和¹³C-NMR数据见表1，结构式为：

实施例3化合物2的鉴定

通过理化常数和波谱学手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY谱)对化合物2进行鉴定，图7、8、9为本发明化合物2的氢谱、碳谱、红外图谱。

化合物3为白色无定形粉末(氯仿)，在紫外灯365nm下有黄色荧光吸收，在254nm下无暗斑，与10％的硫酸-乙醇显色剂加热反应显棕色。IR(KBr)中，υ_max 3527(OH)，2944、1731(C＝O)，1472、1374、1246、1184、1058、1034、1019、978cm^-1处为主要吸收。HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰m/z 515.3735[M+H]⁺(Calcd for C₃₂H₅₃O₅,515.3736)，提示其分子量为514，其分子式是C₃₂H₅₂O₅。

¹H-NMR(600Hz,CDCl₃)谱中，在高场区中给出6个季碳上的甲基质子信号分别为δ_H0.70(3H,s)、0.83(3H,s)、0.85(3H,s)、0.89(3H,s)、0.91(3H,s)、0.96(3H,s)，推测该化合物可能为三萜类化合物；δ_H 2.08(3H,s)为一个乙酰基甲基质子信号；δ_H 5.85(1H,t,J＝3.3Hz)为烯氢质子信号；δ_H 4.62(1H,t,J＝3.3Hz)为连氧碳上的质子信号；δ_H 3.83(1H,d,J＝11.7Hz)、δ_H3.19(1H,d,J＝11.7Hz)为同一连氧碳上的质子信号；2.93(1H,dd,J＝13.7,4.3Hz)推测为季碳上的质子信号。

¹³C-NMR(150Hz,CDCl₃)谱中，给出32个碳信号。δ_C 183.6、171.1为羰基碳信号，根据化学位移值可推测δ_C 183.6为羧酸碳信号，δ_C 171.1为酯羰基；δ_C 78.1为3位α羟基取代的特征碳信号，若为β取代，化学位移约为δ_C 80；δ_C 63.1为羟甲基碳信号；δ_C 129.7、137.8为¹²-齐墩果烯12、13位的特征碳信号，在一般情况下12、13位的碳化学位移值为122、144左右，该化合物12位碳向低场位移约7ppm，13位碳向高场位移约6ppm，齐墩果烷型三萜理论上有7个季碳上的甲基质子信号，该化合物氢谱只给出6个季碳上的甲基质子信号，碳谱相应给出化学位移为δ_C 63.1的羟甲基碳信号，因此推测此化合物为27位被羟基取代的齐墩果烷型三萜。

通过HSQC谱及HMBC谱进行验证，确定了该化合物为27位被羟基取代，28位被羧酸取代，3位羟基被乙酰化成酯的齐墩果烷型三萜，鉴定化合物3为3α-acetoxy-27-hydroxyolean-12-en-28-oic acid。化合物2的¹H和¹³C-NMR数据见表1，结构式为：

实施例4化合物3的鉴定

通过理化常数和波谱学手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY谱)对化合物3进行鉴定，图10、11、12为本发明化合物3的氢谱、碳谱、红外图谱。

化合物4为白色无定形粉末(氯仿)，在紫外灯365nm下有淡蓝色荧光吸收，与10％的硫酸-乙醇显色剂加热反应显紫色。IR(KBr)中，υ_max 3556(OH)，2949、2875、1723(C＝O)，1372、1247、1154、1015、982、885cm^-1处为主要吸收。HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰m/z545.3468[M+H]⁺(calcd for C₃₂H₄₉O₇,545.3478)，提示其分子量为544，其分子式是C₃₂H₄₈O₇。

¹H-NMR(600Hz,CDCl₃)谱中，在高场区中给出个季碳上的甲基质子信号分别为δ_H0.72(3H,s)、0.84(3H,s)、0.84(3H,s)、1.13(3H,s)、1.66(3H,s)，其中δ_H 1.66(3H,s)为羽扇豆烷型三萜的30位甲基的特征氢信号，初步推测该化合物为羽扇豆烷型三萜；δ_H 2.06(3H,s)为乙酰基甲基质子信号，δ_H 3.75(3H,s)为甲氧基质子信号；δ_H 4.61(1H,s)、4.75(1H,s)为一组末端双键的质子信号；δ_H 4.61(1H,s)推测为连氧碳上的质子信号；δ_H 2.56(1H,ddd,J＝13.1,6.3,2.2Hz)、2.94(1H,t,J＝11.3Hz)、3.11(1H,td,J＝10.6,4.9Hz)推测为季碳上的质子信号。

¹³C-NMR(150Hz,CDCl₃)谱中，共给出32个碳信号。低场区δ_C 213.8为酮羰基碳信号；δ_C175.8、170.8为酯羰基或者羧酸碳信号；δ_C 148.9、111.1为羽扇豆烷型三萜20、29位的特征碳信号；δ_C 78.3、73.9、62.0为连氧碳信号，其中δ_C 78.3为3位α羟基取代的特征碳信号，结合DEPT135°谱可知δ_C 73.9为连氧季碳信号，δ_C 62.0为连氧叔碳信号；δ_C 52.0为甲氧基碳信号，δ_C 21.4为乙酰基甲基碳信号；δ_C 15.4、18.7、21.6、24.6、27.9为5个甲基碳信号，羽扇豆烷型三萜理论上有7个季碳上的甲基质子信号，该化合物氢谱只给出6个季碳上的甲基质子信号，结合δ_C 73.9为连氧季碳信号，推测此化合物可能有一个角甲基缺失或者被羟基取代。

HMBC谱中，δ_H 2.31(39.7)的质子信号与δ_C 55.7、213.8的碳有远程相关，δ_H 1.72(29.7)的质子信号与δ_C 55.7、175.8、213.8的碳有远程相关，δ_C 55.7、39.7、29.7分别为17、15、22位碳信号，确定δ_C 213.8酮羰基为16位碳信号；δ_H 1.13(24.6)的质子信号与δ_C 42.2、62.0、73.9的碳有远程相关，δ_H 1.16(42.2)的质子信号与δ_C 24.6、49.8、73.9的碳有远程相关，δ_H 1.25(24.4)的质子信号与δ_C 38.3、62.0、73.9的碳有远程相关，δ_C 24.4、24.6、42.2分别为12、26、7位碳信号，确定δ_C 73.9连氧季碳为14位碳信号，因此该化合物的27位甲基缺失，14位季碳上的氢被羟基取代；δ_H 1.41(49.8)的质子信号与δ_C 15.4、42.2、62.0的碳有远程相关及δ_H 1.25(24.4)的质子信号与δ_C 38.3、62.0、73.9的碳有远程相关，可确定11位被羟基取代化学位移为δ_C 62.0；δ_H 2.06(21.4)的质子信号与δ_C 171.0、78.3的碳有远程相关，确定3位羟基乙酰化成酯；δ_H 3.75(52.0)的质子信号与δ_C 175.8有远程相关，δ_H 1.72(29.7)的质子信号与δ_C 55.7、175.8、213.8的碳有远程相关，确定28位羧酸甲酯化。该化合物2、3位的相对构型通过NOESY谱图确定，在NOESY谱图中分别观察到1.17(H-11)和1.41(H-9α)、H-3和0.84(H-24β)存在NOE效应，确定该化合物的相对构型为3α-acetoxy-11β,14α-dihydroxy-olean.

综上鉴定化合物3为3α-acetoxy-11α,14α-dihydroxy-olean-20(29)-en-16-on-28-oic acid methyl ester。化合物3的¹H和¹³C-NMR数据见表1，结构式为：

实施例5化合物4的鉴定

通过理化常数和波谱学手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY谱)对化合物4进行鉴定，图13、14、15为本发明化合物4的氢谱、碳谱、红外图谱。

化合物4为白色块状结晶(氯仿)，在紫外灯365nm下有淡黄色荧光吸收，与10％的硫酸-乙醇显色剂加热反应显紫色。IR(KBr)中，υ_max 3514(OH)，2949、2863、1707(C＝O)，1639(C＝C)，1377、1273、1186、1147、880cm^-1处为主要吸收。HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰m/z 529.3538[M+H]⁺(Calcd for C₃₂H₄₉O₆,529.3529)，提示其分子量为529，其分子式是C₃₂H₄₈O₆。

¹H-NMR(600Hz,CDCl₃)谱中，高场区中给出5个季碳上的甲基质子信号分别为δ_H0.84(3H,s)、0.88(3H,s)、0.91(3H,s)、1.27(3H,s)、1.66(3H,s)，其中δ_H 1.66(3H,s)为羽扇豆烷型三萜的30位甲基的特征氢信号；δ_H 4.60(1H,s)、4.73(1H,s)为一组末端双键的质子信号；δ_H 4.62(1H,s)推测为连氧碳上的质子信号；δ_H 2.07(3H,s)为乙酰基甲基质子信号，δ_H 3.75(3H,s)为甲氧基质子信号。

¹³C-NMR(150Hz,CDCl₃)谱中，共给出32个碳信号，δ_C 148.9、110.9为羽扇豆烷型三萜20、29位的特征碳信号，结合氢谱确定该化合物母核结构为羽扇豆烷型三萜；δ_C 212.4、175.8、170.7羰基碳信号，根据化学位移可知δ_C 212.4为酮羰基碳信号，δ_C 175.8、170.7酯羰基或者羧酸碳信号；δ_C 78.4、73.2为连氧碳信号，其中δ_C 78.4为3位α羟基取代的特征碳信号，结合DEPT135°谱可知δ_C 73.2为连氧季碳信号；δ_C 52.0为甲氧基碳信号，δ_C 21.3为乙酰基甲基碳信号；δ_C 14.9、18.9、21.9、28.0、30.7为5个季碳甲基碳信号；羽扇豆烷型三萜理论上有7个季碳上的甲基质子信号，该化合物氢谱只给出6个季碳上的甲基质子信号，结合δ_C 73.9为连氧季碳信号，推测此化合物可能有一个角甲基缺失。

HMBC谱中，δ_H 2.30(39.7)的质子信号与δ_C 34.0、55.7、73.2、175.8的碳有远程相关，δ_H 1.76(42.0)的质子信号与δ_C 50.2、59.4、73.2的碳有远程相关，δ_H 1.27(30.7)的质子信号与δ_C 14.9、38.7、42.0、59.4、73.2的碳有远程相关，δ_C 73.2与δ_H 1.76(C-7,42.0)、2.30(C-15,39.7)、1.27(C-26,30.7)均存在远程相关,从而确定δ_C 73.2为14位碳信号，与上述推断该化合物有一个甲基缺失的推论相符，即27位甲基缺失，14位存在一个羟基取代。δ_H 1.54(24.9)的质子信号与δ_C 212.4、54.9、38.6的碳有远程相关，δ_H 2.94(53.2)的质子信号与δ_C 212.4、29.7、24.9的碳有远程相关，δ_C 212.4与δ_H 1.54(C-12,24.9)、δ_H 2.94(C-13,53.2)均存在远程相关,确定11位为酮羰基；δ_H 2.07(21.4)的质子信号与δ_C 170.7、78.4的碳有远程相关，确定3位羟基乙酰化成酯；δ_H 3.75(52.0)的质子信号与δ_C 175.8有远程相关以及δ_H 2.08(29.7)的质子信号与δ_C 31.7、48.5、55.7、175.8、的碳有远程相关，确定28位羧酸甲酯化。

综上鉴定该化合物为3α-acetoxy-14α-hydroxy-olean-20(29)-en-11-on-28-oicacid methyl ester。化合物4的¹H和¹³C-NMR数据见表2，结构式为：

实施例6化合物5的鉴定

通过理化常数和波谱学手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY谱)对化合物5进行鉴定，图16、17、18为本发明化合物5的氢谱、碳谱、红外图谱。

化合物5为白色无定形粉末(氯仿),在紫外灯365nm下有蓝色荧光吸收，在254nm下有暗斑，与10％的硫酸-乙醇显色剂加热反应显紫色。IR(KBr)中，υ_max 3514(OH)，2942、1707(C＝O)，1631、1601、1515(C＝C)，1465、1261、1159、1031、803cm^-1处为主要吸收。HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰m/z 663.4238[M+H]⁺(Calcd for C₄₁H₅₉O₇,663.4261)，提示其分子量为662，其分子式是C₄₁H₅₈O₇。

¹H-NMR(600Hz,CDCl₃)谱中，高场区存在6个季碳上的甲基质子信号分别为δ_H 0.72(3H,s)、0.82(3H,s)、0.83(3H,s)、0.90(3H,s)、0.92(3H,s)、0.93(3H,s)；δ_H 3.94(3H,s)、3.68(3H,s)为2个甲氧基质子信号；δ_H 7.54(1H,d,J＝15.9Hz)、6.92(1H,dd,J＝8.1Hz)为一组环外双键的质子信号，δ_H 6.21(1H,d,J＝15.9Hz)、7.05(1H,dd,J＝8.1,1.8Hz)、7.01(1H,d,J＝1.8Hz)为芳香环上的烯氢质子信号，根据耦合常数推测其苯环存在1、3、4位取代，且1位与环外双键连接。δ_H 4.33(1H,d,J＝12.6Hz)；4.33(1H,d,J＝12.6Hz)、3.37(1H,t,J＝2.5Hz)推测为连氧碳上的质子信号。

¹³C-NMR(150Hz,CDCl₃)谱中，共给出41个碳信号，δ_C 178.3、167.1为羰基碳信号；δ_C137.7、127.0为齐墩果烯型三萜13、12位的特征碳信号；δ_C 144.7、114.8为一组环外双键的碳信号；δ_C 148.0、146.9、127.1、123.1、116.0、109.5为6个SP²杂化碳信号，根据化学位移及氢谱结合可知芳香环存在1、3、4位取代，推测此化合物存在一个阿魏酸酰基取代；δ_C 76.1、65.9为连氧碳信号，其中δ_C 76.1为3位α羟基取代的特征碳信号；δ_C 51.8为甲氧基碳信号；δ_C 15.4、18.1、22.3、23.7、28.3、33.0为6个甲基碳信号。HMBC谱中，δ_H 4.34(65.9)、δ_H 4.21(65.9)的质子信号与δ_C 167.1、137.7、45.4、40.2的碳有远程相关，确定阿魏酸酰基连接位置在27位(δ_C 65.9)，δ_H 3.64(51.8)的质子信号与δ_C 178.3存在远程相关，δ_H 1.96(23.5)的质子信号与δ_C 178.3、46.7、23.1存在远程相关，确定C-28为羧酸甲酯取代。综上信息该化合物鉴定为3α-hydroxy-27-(4-hgdroxy-3-Methoxy-E-cinnamoyloxy)-12-en-28-oi-cacid methyl ester。化合物5的¹H和¹³C-NMR数据见表2，结构式为：

实施例7化合物6的鉴定

通过理化常数和波谱学手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY谱)对化合物6进行鉴定，图19、20、21为本发明化合物6的氢谱、碳谱、红外图谱。

化合物6为白色无定形粉末(氯仿)，在紫外灯365nm照射下无荧光吸收，在254nm下有暗斑，与硫酸乙醇试剂加热反应显紫色。IR(KBr)中，υ_max 3455(OH)，2948、1714(C＝O)，1027、1183、977、885cm^-1处为主要吸收。HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰m/z515.3749[M+H]⁺(Calcd for C₃₂H₅₁O_7,515.3736)，提示其分子量为514,其分子式是C₃₂H₅₀O₅。

¹H-NMR(400Hz,CDCl₃)谱中，在高场区存在五个季碳甲基质子信号分别为δ_H 0.82(3H,s)、0.83(3H,s)、0.87(3H,s)、0.95(3H,s)、1.68(3H,s)，其中δ_H 1.68(3H,s)为羽扇豆烷型三萜的30-CH₃的特征氢信号，初步推测该化合物为羽扇豆烷型三萜类化合物；1个乙酰基的甲基质子信号δ_H 2.04(3H,s)，δ_H 4.75(1H,s)、4.61(1H,s)为一组末端双键的质子信号；4.46(1H,dd,J＝10.9,5.3Hz)为连氧次甲基质子信号；4.23(1H,d,J＝12.4Hz)、3.81(1H,d,J＝12.4Hz)为连氧亚甲基质子信号。

¹³C-NMR(101Hz,CDCl₃)谱中，共给出32个碳信号，其中δ_C 181.4、171.1为羰基碳信号，根据化学位移推测其为羧酸或酯羰基碳信号；δ_C 150.3、110.1为双键碳信号，其中δ_C150.3、110.1为羽扇豆烷型三萜20、29位的特征碳信号；δ_C 81.0、61.2为连氧碳信号，其中δ_C81.0为3位β羟基取代的特征碳信号，δ_C 61.2为羟甲基碳信号；δ_C 21.4为乙酰基甲基碳信号。与化合物3-acetoxy-27-hydroxylup-20(29)-en-28-oic acid methyl ester相比较，结合¹H-NMR和¹³C-NMR该化合物缺少一个甲氧基，且该化合物中的羰基碳信号δ_C 181.4与3-acetoxy-27-hydroxylup-20(29)-en-28-oic acid methyl ester的其中一个羰基碳信号δ_C 176.8相比较，向低场位移了约4.5ppm，推测该化合物的C-28位为一个羧酸取代。通过HSQC谱及HMBC谱进行验证，确定了该化合物为28位被羧酸取代，27位被羟基取代，3位羟基被乙酰化成酯的羽扇豆烷型三萜，鉴定其为3-acetoxy-27-hydroxylup-20(29)-en-28-oicacid。化合物6的¹H和¹³C-NMR数据见表3，结构式为：

实施例8化合物7的鉴定

通过理化常数和波谱学手段(HRESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC及¹H-¹H COSY谱)对化合物7进行鉴定，图22、23、24为本发明化合物7的氢谱、碳谱、红外图谱。

化合物7为无定形白色粉末(氯仿)，在紫外灯365nm下有蓝色荧光吸收，在254nm下有暗斑，与10％的硫酸-乙醇显色剂加热反应显紫色。IR(KBr)中，υ_max 3442(OH)，2943、2876、1724(C＝O)，1642、1251、1015、976cm^-1处为主要吸收。HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰HR-ESI-MS m/z 543.3680[M+H]⁺(calcd for C₃₃H₅₁O₆,542.3607).提示其分子量为514,其分子式是C₃₃H₅₀O₆。

¹H-NMR(400Hz,CDCl₃)谱中，高场区存在6个季碳上的甲基质子信号分别为δ_H 0.83(3H,s)、0.88(3H,s)、0.88(3H,s)、0.94(3H,s)、0.97(3H,s)、1.05(3H,s)；δ_H 2.08(3H,s)为乙酰基质子信号；3.65(3H,s)为甲氧基质子信号；δ_H 5.97(1H,s)为烯氢质子信号；δ_H 4.61(1H,s)为连氧碳上的质子信号；δ_H 4.20(1H,d,J＝14.4Hz)；3.5(1H,d,J＝14.4Hz)推测为同一连氧碳上的两个质子信号。

¹³C-NMR(101Hz,CDCl₃)谱中，共给出33个碳信号，δ_C 201.3推测为酮羰基碳信号，δ_C177.3、171.0为羧酸或酯羰基碳信号；δ_C 78.0为3位α羟基取代的特征碳信号；δ_C 63.1为羟甲基碳信号；δ_C 132.4、160.8为齐墩果烯型三萜12、13位的特征碳信号，一般情况下12、13位的碳化学位移为122、144，但化合物PH-90的13位向低场位移约16ppm，12位向低场位移约10ppm，齐墩果烯型三萜理论上应有7个角甲基，而PH-90仅有6个角甲基，对应的多了一个羟甲基信号δ_C 63.1，以及一个酮羰基信号δ_C 201.3，因此推测化合物PH-90为27位被羟基取代，11位被酮羰基取代；结合HMBC谱，δ_H 5.97(132.4)的质子信号与δ_C 41.2、δ_C 62.0的碳存在远程相关，且δ_H 3.06(62.0)的质子信号与δ_C 16.6、20.8、201.3的碳存在远程相关，确定酮羰基连接在11位；δ_H 4.20(63.1)、δ_H 3.50(63.1)的质子信号与δ_C 24.7、45.9、46.0、160.8的碳有远程相关，确定羟甲基连接位置在27位(δ_C 63.1)；δ_H 3.65(52.1)的质子信号与δ_C 177.1碳有远程相关，δ_H 1.93(22.6)、δ_H 1.74(31.6)的质子信号与δ_C 177.1均存在远程相关，确定28位为羧酸甲酯取代；δ_H 2.08(21.6)的质子信号与δ_C 171.0存在远程相关，结合HSQC谱确定3位α羟基被乙酰化成酯。综上信息该化合物鉴定为3α-acetoxy-27-hydroxyolean-12-en-16-on-28-oic acid methyl ester。化合物7的¹H和¹³C-NMR数据见表3，结构式为：

表1：本发明化合物1-3的¹H-NMR和¹³C-NMR谱数据

表2：本发明化合物4-5的¹H-NMR和¹³C-NMR谱数据

表3：本发明化合物6和7的¹H-NMR和¹³C-NMR谱数据

实施例9抗肿瘤活性试验

本发明化合物对人体3个瘤株的体外抑瘤活性实验，这3个瘤株包括HeLa(人***细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、SGC-7901(人胃癌细胞)三种人体肿瘤细胞的细胞毒性。抗癌药cis-dichlorodiamineplatinum(II)(顺铂)作为阳性对照。基于MTT法的研究结果对本发明化合物3和7通过克隆形成实验(Clone formation法)和Hochest染色法检测其对HeLa细胞(人***细胞)的抑制作用。

抑制肿瘤细胞增殖(MTT法)：将肿瘤细胞接种于96孔板中，培养24h后加入待测试样品，再培养48h后用MTT法测定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。

克隆形成实验(Clone formation法)：将肿瘤细胞接种于24孔板中，接种80个细胞，培养12h，待细胞贴壁后，加入待测试样品，再培养48h后加入完全培养基，经四次换液后，弃上清，用结晶紫染色20min，PBS冲洗3次，统计克隆形成数目，并比较各组克隆形成的差异。

荧光显微镜分析(Hochest染色法)：将肿瘤细胞接种于48孔板中，培养12h，待细胞贴壁后，加入待测试样品，作用48h后，显微镜观察细胞形态；弃上清，PBS冲洗3次，将细胞于4％聚甲醛固定20分钟，PBS冲洗3次，加入10μg/ml Hochest染色15分钟，PBS冲洗3次，荧光显微镜观察细胞核形态。

Western Blot实验：将处于指数生长期的细胞种于6孔板中，分别加入不同浓度的化合物2(10.0、20.0、40.0μmol·L-1)、化合物6(5.0、10.0、20.0μmol·L-1)，经刺激后，于相应时间点提取各组总蛋白，在10％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，再转到NC膜上，封闭，孵育，采用ECL试剂盒显影并成像。每组实验重复3次。

细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(阴性对照组OD值平均值-空白对照组OD值平均值)×100％，实验结果见表4。

表4本发明化合物对三种肿瘤细胞增殖的抑制作用

从表4的实验数据可知，化合物2、3、5、6、7对HeLa、HepG2和SGC-7901三种不同的肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，表明化合物2、3、5、6、7可以进一步作为新的抗肿瘤药物进行研究开发。

化合物2和6抑制HeLa细胞(人***细胞)的克隆形成能力，结果见图1。

图1克隆形成实验结果显示，HeLa细胞经不同浓度的化合物2和6处理后，细胞的克隆形成能力明显下降。且较高浓度处理组(20～40μM)的HeLa细胞几乎不能形成肉眼可见的细胞克隆。

化合物2和6诱导的HeLa细胞的细胞和细胞核形态发生凋亡特征，实验结果见图2。

图2Hochest染色法实验结果显示，HeLa细胞经不同浓度的化合物2和6处理后，随浓度增加细胞凋亡特征更显著。

图3为Western blot分析细胞凋亡相关蛋白的表达。实验结果显示化合物2和6诱导HeLa细胞凋亡。其中图中的“*”表示三萜类化合物相对于HeLa细胞相关蛋白的显著性。其中^*p＜0.05，^**＜0.01，^***p＜0.001。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。