阅读说明：本技术 多肽衍生物、纳米纤维及其应用 (Polypeptide derivative, nanofiber and application thereof ) 是由 杨志谋 王玲 商宇娜 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种多肽衍生物、纳米纤维及其应用,所述多肽衍生物可有效模拟IGF-1蛋白的生物学活性,作为IGF-1蛋白的替代物,且生产工艺较简单、产率较高,储存稳定性较好。所述多肽衍生物的序列为X-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg,其中,端基X为Nap或Npx,Phe同时为L构型或D构型,其余均为L构型。将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成纳米纤维。所述多肽衍生物能够与IGF-1蛋白受体结合,用于治疗肌肉萎缩和动脉粥样硬化。(The invention provides a polypeptide derivative, a nanofiber and application thereof, wherein the polypeptide derivative can effectively simulate the biological activity of IGF-1 protein and is used as a substitute of the IGF-1 protein, and the polypeptide derivative has the advantages of simple production process, high yield and good storage stability. The sequence of the polypeptide derivative is X-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg, wherein the end group X is Nap or Npx, Phe is in an L configuration or a D configuration at the same time, and the rest is in an L configuration. And heating and cooling the water mixture of the polypeptide derivative to form the nano-fiber. The polypeptide derivatives are capable of binding to the IGF-1 protein receptor and are useful for the treatment of muscle wasting and atherosclerosis.)

多肽衍生物、纳米纤维及其应用

技术领域

本发明涉及一种多肽衍生物、纳米纤维及其应用。

背景技术

***I(IGF-1)是一种生长激素，在人类发育、生长、代谢和体内平衡中起着至关重要的作用，在临床上以及生命科学研究领域有着十分广泛的研究。

动脉粥样硬化是引起心肌梗死、冠心病、高血压、中风等心血管疾病的重要原因，已成为危害人类健康的主要疾病之一。据世界卫生组织WHO的最新数据统计显示，死于心脑血管疾病的人数占所有非传染疾病总人数的48％，是死于癌症人数的两倍以上。在大多数观察性研究中，IGF-1的循环水平低与动脉粥样硬化并发症的增加有关。在一项关于IGF-1水平影响的前瞻性研究中，在患者的15年随访期间，低循环IGF-1水平与缺血性心脏病风险增加有关。在鹿特丹老年研究的参与者中，高游离IGF-1与颈动脉斑块和冠状动脉疾病的减少有关，因为游离的IGF-1可以很容易地穿过内皮细胞，与自己的受体相互结合，进而调控血脂平衡。因此，通过补充外源性IGF-1来恢复IGF-1的生理水平，是一种很有希望发挥抗动脉粥样硬化作用的方法。

肌肉萎缩是一种中老年常见的慢性疾病，主要表现特点为肌力减退、肌肉质量下降，是由遗传因素、长期过量服用激素类药物和机体衰老等多种因素引起的肌肉蛋白过度降解的病理状态。肌肉萎缩是许多慢性病和衰老过程本身的严重后果，因为它直接导致身体虚弱、丧失独立性和死亡风险增加。因此，对治疗肌肉萎缩专业药物的开发需求越来越大，成为世界范围内一个重要的研究课题。然而到目前为止，除运动方案外，还没有开发出有效的药物和治疗方案来治疗这一疾病。但运动方案的使用在老年人、卧床不起的人群或患有急性疾病的人群中受到了严重的限制。此外，现有的治疗肌肉萎缩的方法通常还依靠增加营养、添加食欲刺激剂或促合成化合物(例如睾酮)来提高肌肉量。但这些治疗方法的效果并不令人满意，并可能引起副作用。IGF-1作为胰岛素信号通路的激动剂，在维持肌肉质量方面发挥着重要作用。体外补充一些额外的IGF-1，能促进骨骼肌蛋白的合成，有效预防骨骼肌减少症的发生。

目前临床应用或商业化的IGF-1蛋白为天然或重组蛋白，存在生产成本高、质量难以保证、运输和保存条件苛刻等问题，同时由于蛋白本身在组织内滞留率低，直接向受损器官注射IGF-1无效。

中国专利文献CN109957000A公开了一种序列为Nap-FFGGYGSSSRRAPQT的多肽衍生物，用于模拟IGF-1蛋白的生物学活性，可以作为IGF-1蛋白的替代物。其生产过程采用FMOC-固相合成方法，产物化学结构明确、产率大、较天然或重组蛋白而言成本明显降低，同时易于保存和运输。由于该类多肽生物均能够在水溶液中自组装，形成纳米纤维，最终构成水凝胶，无需载体帮助就能起到提高体内滞留率、进一步提高生物学活性的作用。但是，其多肽链长为16肽，合成工艺较复杂且产率较低；最重要的是其自组装形成的水凝胶为白色不透明凝胶、水溶性差、放置3～5天后有少量析出不利于长期保存。

在实现本发明的过程中，本发明人发现现有技术中至少存在以下问题：提供一种新的多肽衍生物，可有效模拟IGF-1蛋白的生物学活性，作为IGF-1蛋白的替代物，且生产工艺较简单、产率较高，储存稳定性较好。

发明内容

鉴于此，本发明提供一种多肽衍生物、纳米纤维及其应用，所述多肽衍生物可有效模拟IGF-1蛋白的生物学活性，作为IGF-1蛋白的替代物，且生产工艺较简单、产率较高，储存稳定性较好。

具体而言，包括以下的技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种多肽衍生物，所述多肽衍生物的序列为X-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg(以下简称为X-FFGSSSR)，其中，端基X为Nap或Npx，Phe同时为L构型或D构型，其余均为L构型，端基结构式如下所示：

或者，

优选的，所述多肽衍生物的序列为Nap-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg，所有氨基酸均为L构型。

作为本领域的常识，以下序列除特别说明外，均为L构型。

所述多肽衍生物采用公知的FMOC-短肽固相合成方法合成。具体的，该多肽衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)Fmoc-氨基酸的C端与树脂结合；

(2)Fmoc保护基的脱除，洗涤；

(3)下一个Fmoc-氨基酸的C端与树脂上的氨基酸或多肽的N端耦联，洗涤；

(4)重复(2)～(3)步，直到最后一个氨基酸偶联完毕，脱除Fmoc保护基，洗涤；

(5)X-OH与树脂上多肽的N端偶联、洗涤；

(6)多肽衍生物从树脂上切除，得到粗产品；

(7)使用高效液相色谱对粗产品进行提纯。

根据本发明的第二方面，本发明提供了所述多肽衍生物的纳米纤维，将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成纳米纤维。当所述多肽衍生物的水混合物浓度达到毫摩尔级别时，可以形成超分子水凝胶。作为本领域的公知常识，超分子水凝胶是由分子量小于2000的小分子化合物通过非共价键作用相互聚集，自组装得到网状结构并包裹水分子而形成的凝胶。试验发现，X-FFGSSSR溶解性较好，可以形成无色透明的水凝胶。

进一步的，将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成纳米纤维的具体方法为：将所述多肽衍生物加入到pH＝5.0～9.0的PBS溶液中，用碳酸钠溶液或盐酸溶液将其pH值调节至6.0～7.0，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即制得浓度为10nM～1μM的含有多肽衍生物的纳米纤维的混合物。

发明人发现，相比于现有技术中公开的多肽衍生物Nap-FFGGYGSSSRRAPQT，X-FFGSSSR具有更短的序列结构，相应地，根据公知常识可推知，X-FFGSSSR与IGF-1受体蛋白的结合力弱于Nap-FFGGYGSSSRRAPQT，但出人意料的是，X-FFGSSSR的纳米纤维表现出良好的生物活性，在模拟IGF-1用于肌肉萎缩和动脉粥样硬化的治疗方面效果突出。与此同时，由于X-FFGSSSR具有更短的序列结构，其生产工艺流程更短更简单、产率更高、质量也更加可控；另外，由于与Nap-FFGGYGSSSRRAPQT发挥相同活性所需的摩尔浓度相同，因X-FFGSSSR序列更短、分子量更低的缘故，发挥相同活性X-FFGSSSR所需的质量更少，从而进一步使成本大大降低；并且相比于Nap-FFGGYGSSSRRAPQT，X-FFGSSSR的溶解性更好、性能更加稳定，有利于其长期储存。

根据本发明的第三方面，本发明提供了所述的纳米纤维在制备治疗肌肉萎缩药物中的应用。

发明人发现，所述多肽衍生物能够与IGF-1蛋白受体结合，激活胰岛素信号通路，促进成肌细胞的增殖和分化，抵抗***为代表的糖皮质激素诱导的细胞凋亡，治疗肌肉萎缩。

优选的，所述多肽衍生物的序列为Nap-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg(以下简称为Nap-FFGSSSR)，所有氨基酸均为L构型，结构式如下所示；

根据本发明的第四方面，本发明提供了所述的纳米纤维在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用，所述多肽衍生物的序列为Npx-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg(以下简称为Npx-FFGSSSR)，其中，Phe同时为L构型或D构型，其余氨基酸均为L构型。具体的结构式如下所示：

或者，

所述多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR和Npx-FFGSSSR可以减少巨噬细胞的脂质积累，抑制血管平滑肌细胞向巨噬细胞样表型转化，增强斑块在体内的稳定性，在延缓动脉粥样硬化的发生中有重要的作用。

所述药物通过肌肉注射的方式进行治疗。

本发明实施例提供的技术方案的有益效果至少包括：

1、本发明制备工艺简单，产物化学结构明确，所用原料均为人体每天所必需的氨基酸，可以通过固相合成的方法制得多肽衍生物，生产工艺简单、产率大、成本低、生物相容性好；

2、纳米纤维的微观结构能够有效抵抗体内蛋白酶的降解，显著延长了其体内半衰期、提高了组织滞留率；

3、所述多肽衍生物能够与IGF-1蛋白受体结合，激活胰岛素信号通路；

4、所述多肽衍生物Nap-FFGSSSR形成的纳米纤维能够促进成肌细胞的增殖和分化，抵抗***为代表的糖皮质激素诱导的细胞凋亡，治疗肌肉萎缩；

5、所述多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR形成的纳米纤维用于动脉粥样硬化治疗时，可极大减少脂质的积累，增强斑块在体内的稳定性，延缓动脉粥样硬化的发生和发展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为通过利用EdU法检测阳性细胞数量来评价Nap-FFGSSSR促进小鼠成肌细胞(C2C12)增殖的效果图。

图2为通过利用TUNEL法检测阳性细胞数量来评价Nap-FFGSSSR抵抗Dex诱导的小鼠成肌细胞(C2C12)凋亡的效果图。

图3为通过利用Western Blot检测T-AKT、P-AKT(T308)和P-AKT(S473)的表达情况来评价Nap-FFGSSSR激活胰岛素信号通路的情况。

图4为小鼠肌肉质量改变图。

图5为制备实施例1-3及对比制备例4所得的超分子水凝胶的透射电镜图。其中A为制备实施例2多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR通过加热冷却方法制备成的超分子水凝胶(H1)的透射电镜图，B为制备实施例3多肽衍生物Npx-FFGSSSR通过加热冷却方法制备成的超分子水凝胶(H2)的透射电镜图，C为制备实施例1多肽衍生物Nap-FFGSSSR通过加热冷却方法制备成的超分子水凝胶(H3)的透射电镜图，D为对比制备例4多肽衍生物Nap-FFGSRSS通过加热冷却方法制备成的超分子水凝胶(H4)的透射电镜图。标尺为100nm。

图6为多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR、Npx-FFGSSSR、Nap-FFGSSSR及Nap-FFGSRSS与IGF-1受体的结合能力的测定。其中A为Npx-^DF^DFGSSSR与IGF-1受体蛋白结合常数测定图，B为Npx-FFGSSSR与IGF-1受体蛋白结合常数测定图，C为Nap-FFGSSSR与IGF-1受体蛋白结合常数测定图，D为Nap-FFGSRSS与IGF-1受体蛋白结合常数测定图。

图7为利用脂类油红O染色法检测ApoE基因敲除小鼠的腹膜巨噬细胞的脂质积累情况。其中A为对腹膜巨噬细胞进行脂类油红O染色来评估泡沫细胞的形成情况，B为通过Western Blot的结果测定ABCA1和ABCG1这两种主要的脂类转运体的基因表达情况。

图8为利用多肽衍生物治疗患有动脉粥样硬化的小鼠的主动脉病变情况。其中A为利用脂类油红O染色法测定主动脉病变代表性显微照片，B为A中各组的定量统计数据，C为将主动脉根部进行组织切片后，再利用油红O染色法检测主动脉根部横切面病变照片，D为C中各组的定量统计数据。

图9为采用酶联免疫吸附(ELISA)和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)测定小鼠血清和主动脉中促炎细胞因子的表达。其中A为用ELISA测定小鼠血清中TGF-α、IL-1β和IL-6的表达量，B为用RT-PCR法测定小鼠主动脉中TGF-α和IL-6的表达量。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种多肽衍生物，所述多肽衍生物的序列为X-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg(以下简称为X-FFGSSSR)，其中，端基X为Nap或Npx，Phe同时为L构型或D构型，其余均为L构型，端基结构式如下所示：

或者，

优选的，所述多肽衍生物的序列为Nap-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg，所有氨基酸均为L构型。

所述多肽衍生物采用公知的FMOC-短肽固相合成方法合成。具体的，该多肽衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)Fmoc-氨基酸的C端与树脂结合；

(2)Fmoc保护基的脱除，洗涤；

(3)下一个Fmoc-氨基酸的C端与树脂上的氨基酸或多肽的N端耦联，洗涤；

(4)重复(2)～(3)步，直到最后一个氨基酸偶联完毕，脱除Fmoc保护基，洗涤；

(5)X-OH与树脂上多肽的N端偶联、洗涤；

(6)多肽衍生物从树脂上切除，得到粗产品；

(7)使用高效液相色谱对粗产品进行提纯。

根据本发明的第二方面，本发明提供了所述多肽衍生物的纳米纤维，将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成纳米纤维。当所述多肽衍生物的水混合物浓度达到毫摩尔级别时，可以形成超分子水凝胶。作为本领域的公知常识，超分子水凝胶是由分子量小于2000的小分子化合物通过非共价键作用相互聚集，自组装得到网状结构并包裹水分子而形成的凝胶。

进一步的，将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成纳米纤维的具体方法为：将所述多肽衍生物加入到pH＝5.0～9.0的PBS溶液中，用碳酸钠溶液或盐酸溶液将其pH值调节至6.0～7.0，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即制得浓度为10nM～1μM的含有多肽衍生物的纳米纤维的混合物。

发明人发现，相比于现有技术中公开的多肽衍生物Nap-FFGGYGSSSRRAPQT，X-FFGSSSR具有更短的序列结构，相应地根据公知常识可推知，多肽衍生物X-FFGSSSR与IGF-1受体蛋白的结合力弱于Nap-FFGGYGSSSRRAPQT，但出人意料的是，X-FFGSSSR的超分子水凝胶表现出良好的生物活性，在模拟IGF-1用于肌肉萎缩和动脉粥样硬化的治疗方面效果突出。与此同时，由于X-FFGSSSR具有更短的序列结构，其生产工艺流程更短更简单、产率更高、质量也更加可控；另外，由于与Nap-FFGGYGSSSRRAPQT发挥相同活性所需的摩尔浓度相同，因X-FFGSSSR序列更短、分子量更低的缘故，发挥相同活性X-FFGSSSR所需的质量更少，从而进一步使成本大大降低；并且相比于Nap-FFGGYGSSSRRAPQT，X-FFGSSSR的溶解性更好、性能更加稳定，有利于其长期储存。

根据本发明的第三方面，本发明提供了所述的纳米纤维在制备治疗肌肉萎缩药物中的应用。

优选的，所述多肽衍生物的序列为Nap-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg(以下简称为Nap-FFGSSSR)，所有氨基酸均为L构型，结构式如下所示；

发明人发现，所述多肽衍生物Nap-FFGSSSR的纳米纤维能够与IGF-1蛋白受体结合，激活胰岛素信号通路，促进成肌细胞的增殖和分化，抵抗***为代表的糖皮质激素诱导的细胞凋亡，治疗肌肉萎缩。

根据本发明的第四方面，本发明提供了所述的纳米纤维在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用，所述多肽衍生物的序列为Npx-Phe-Phe-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg(以下简称为Npx-FFGSSSR)，其中，Phe同时为L构型或D构型，其余氨基酸均为L构型。具体的结构式如下所示：

或者，

所述多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR(D构型)和Npx-FFGSSSR(L构型)的纳米纤维可以减少巨噬细胞的脂质积累，抑制血管平滑肌细胞向巨噬细胞样表型转化，增强斑块在体内的稳定性，在延缓动脉粥样硬化的发生中有重要的作用。

所述药物通过肌肉注射的方式进行治疗。

以下实施例中所涉及制剂来源如下：

2-Cl-Trt树脂购自天津南开和成科技有限公司，活性1.2mmol/mL；

N,N-二异丙基乙胺(以下用DIEPA表示)，购自阿达玛斯公司(Adamas)，纯度99％；

苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(以下用HBTU表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度98％；

三氟乙酸(以下用TFA表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；

三异丙基硅烷(以下用TIS表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；

所有氨基酸均购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；

EdU染色试剂盒、TUNEL染色试剂盒、苏木素-伊红染色液、脂类红油O染色液均购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；

DMEM高糖培养基、胎牛血清购自天津智得生物科技有限公司；

小鼠成肌细胞C2C12，购自上海歌凡生物；

6-8周龄雌性C57BL/6小鼠、6-8周龄雄性ApoE基因缺陷小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司；

IGF-1蛋白,购自Acro biosystems公司,纯度98％。

制备实施例1：

多肽衍生物Nap-FFGSSSR及其纳米纤维的合成与制备

(1)Nap-FFGSSSR的固相合成

具体步骤如下：

1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，放置在摇床上摇晃5min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；

2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；

3)将0.75mmol Fmoc-Arg溶解在10mL的无水DCM里，加入0.75mmol的DIPEA，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.75mmol的DIPEA，在室温下反应1h；

4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM∶DIPEA∶甲醇＝17∶1∶2的溶液20mL，在室温下反应10min；

5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，再用N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，加入10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应25min，再用10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF反应5min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，进行下一步反应；

6)加入的Fmoc-Ser 1mmol、HBTU 1.5mmol、DIPEA 2mmol和10mLDMF，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h；

7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-Ser、Fmoc-Ser、Fmoc-Gly、Fmoc-Phe、Fmoc-Phe、2-萘乙酸，然后用DMF洗涤5遍，DCM洗5遍，进行下步反应；

8)按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H₂O体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时(或者TFA与DCM的体积比为1∶99，配制成体积百分比浓度为1％的TFA溶液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为1min)，把产物从2-Cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，得到多肽衍生物Nap-FFGSSSR，产率为75％。

(2)多肽衍生物的纳米纤维的制备

称取1.0mg纯化后的多肽衍生物Nap-FFGSSSR，置于2mL的玻璃瓶中，加入500μLPBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得无色透明可倒置水凝胶。成胶与否通过本领域公知的方法判断，如采用倒置瓶子的方法判断，保留在瓶子底部为水凝胶，如果是流动的则为液体。所述水凝胶无色透明、可以常温放置1个月以上，显示其溶解性和储存稳定性较好。

称取1.1mg纯化后的多肽衍生物Nap-FFGSSSR，置于2mL的玻璃瓶中，加入1mL PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，用微量取样器吸取1μL加入到999μL的PBS溶液中，再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到1μM的Nap-FFGSSSR溶液；用微量取样器吸取10μL浓度为1μM的Nap-FFGSSSR溶液加入到990μL的PBS溶液中，再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到10nM的Nap-FFGSSSR溶液。经电镜照片显示浓度为1μM和10nM的Nap-FFGSSSR溶液的内部结构均为纳米纤维。

对比制备例1

无菌1×PBS

称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。用高压灭菌锅灭菌后，保存于室温或4℃冰箱中。

对比制备例2

称取0.47mg纯化后的多肽衍生物Ac-SSSR，置于2mL的玻璃瓶中，加入1mL PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却下来后将瓶子倒置过来发现没有形成水凝胶而是流动的溶液，得到浓度为1mM的Ac-SSSR溶液。

对比制备例3

称取1.8mg IGF-1蛋白粉末，置于2mL的玻璃瓶中，加入500μL PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，得到浓度为2mM的IGF-1蛋白溶液。

细胞实施例1：

多肽衍生物Nap-FFGSSSR的水凝胶在细胞层面的活性测试

(1)促进小鼠成肌细胞(C2C12)增殖实验

1)把水浴锅提前升温至37℃，将培养基、血清等放入水浴锅预热，并且同时打开超净台紫外灯照射半小时；

2)从液氮罐中取出冻存的小鼠成肌细胞C2C12，迅速放置在37℃的水浴锅中使细胞解冻，之后迅速转移到超净台里进行如下操作：把含细胞的溶液用移液器小心地转移到含有培养基的离心管中，离心3min，去上清，用含有10％的胎牛血清的DMEM培养基重悬，转移到培养皿中，然后放入37℃培养箱中培养；

3)第二天观察细胞状态，待细胞状态良好后，传一代以后进行下面的实验；

4)加2mL胰酶，轻轻晃动，均匀覆盖，轻敲培养皿底，37℃消化3min，显微镜下观察大多数细胞悬浮，1mL枪吹打5-10下，加2mL培养基，吹打均匀，收集细胞培养液，吸入到离心管中，1000rpm转速下离心3min，之后弃掉上清溶液，加入含有10％的胎牛血清的DMEM培养基用枪吹打均匀，用细胞计数板计数为每毫升含有5×10⁷个细胞。

5)将细胞重悬于底部放有玻璃片的24孔板中，每孔5万个细胞1mL含有10％的胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养箱中过夜培养。

6)取10μL浓度为1mM的***(以下简称Dex)母液加入990μL含有10％的胎牛血清的DMEM培养基中，制得1ml的含有10μM Dex的培养基。取10μL浓度为1mM的Dex母液和10μL浓度为1μM的Ac-SSSR溶液加入980μL含有10％的胎牛血清的DMEM培养基中，制得1ml的含有10μMDex和10nM Ac-SSSR的培养基。同样类似的制备方法得到含有10μM Dex和10nM Nap-FFGSSSR的培养基、含有10μM Dex和10nM IGF-1的培养基。向control组中加入1ml的不含Dex和任何多肽衍生物并且只含有10％的胎牛血清的DMEM培养基。

7)第二天吸出含有10％的胎牛血清的DMEM培养基，各组分别加入第6步中预先配置好的培养基每孔1mL，37℃培养箱中孵育24h之后按照EdU染色试剂盒的说明书对细胞进行染色，再用共聚焦显微镜在每组中随机选取3个视野进行拍照，最后用Image J软件进行EdU阳性细胞计数，统计各组之间的差异性。

图1为通过利用EdU法检测阳性细胞数量来评价Nap-FFGSSSR水凝胶促进小鼠成肌细胞(C2C12)增殖的效果图。图中Control柱状图代表C2C12在不含Nap-FFGSSSR的细胞培养基中培养24h再用EdU孵育3h后染色EdU阳性细胞数目，其他柱状图代表C2C12分别在含有***(Dex)、Dex+Ac-SSSR、Dex+Nap-FFGSSSR、Dex+IGF-1的培养基中培养24h再用EdU孵育3h后染色EdU阳性细胞数目，Dex组EdU阳性细胞数目明显减少表明其确实能够抑制C2C12细胞增殖，Dex+Nap-FFGSSSR和Dex+IGF-1组EdU阳性细胞数目远大于细胞处于正常生长状态的Control组，说明Nap-FFGSSSR具有促进C2C12增殖的功能。而Dex+Ac-SSSR组EdU阳性细胞数目比Dex组稍微多点儿，但远少于Control组、Dex+Nap-FFGSSSR和Dex+IGF-1组，说明Ac-SSSR具有微弱的促进C2C12增殖的功能。

(2)抵抗小鼠成肌细胞(C2C12)凋亡实验

1)重复上面细胞增殖实验的1)-4)步骤后，将细胞重悬于24孔板，每孔5万个细胞和1mL含有10％的胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养箱中过夜培养。

2)取10μL浓度为1mM的***(以下简称Dex)母液加入990μL含有10％的胎牛血清的DMEM培养基中，制得1ml的含有10μM Dex的培养基。取10μL浓度为1mM的Dex母液和10μL浓度为1μM的Ac-SSSR溶液加入980μL含有10％的胎牛血清的DMEM培养基中，制得1ml的含有10μM Dex和10nM Ac-SSSR的培养基。同样类似的制备方法得到含有10μM Dex和10nM Nap-FFGSSSR的培养基、含有10μM Dex和10nM IGF-1的培养基。向control组中加入1ml的不含Dex和任何多肽衍生物并且只含有10％的胎牛血清的DMEM培养基。

3)第二天吸出含有10％的胎牛血清的DMEM培养基，各组分别加入第2步中预先配置好的培养基每孔1mL，37℃培养箱中孵育24h之后按照TUNEL染色试剂盒的说明书对细胞进行染色，再用共聚焦显微镜在每组中随机选取3个视野进行拍照，最后用Image J软件对TUNEL阳性细胞计数，统计各组之间的差异性。

图2为通过利用TUNEL法检测阳性细胞数量来评价Nap-FFGSSSR水凝胶抵抗Dex诱导的小鼠成肌细胞(C2C12)凋亡的效果图。图中Control柱状图代表C2C12在不含Nap-FFGSSSR的细胞培养基中培养24h再用TUNEL孵育1h后染色TUNEL阳性细胞数目，其他柱状图代表C2C12分别在含有***(Dex)、Dex+Ac-SSSR、Dex+Nap-FFGSSSR、Dex+IGF-1的培养基中培养24h再用TUNEL孵育1h后染色TUNEL阳性细胞数目，Dex组TUNEL阳性细胞数目明显增多表明其确实能够诱导C2C12细胞凋亡，Dex+Nap-FFGSSSR和Dex+IGF-1组TUNEL阳性细胞数目与细胞处于正常生长状态的Control组相当，说明Nap-FFGSSSR具有抵抗Dex诱导的C2C12凋亡的功能。而Dex+Ac-SSSR组TUNEL阳性细胞数目比Dex组稍微少点儿，但远多于Control组、Dex+Nap-FFGSSSR和Dex+IGF-1组，说明Ac-SSSR具有微弱的抵抗Dex诱导的C2C12凋亡的功能。

(3)治疗肌肉萎缩的多肽水凝胶激活胰岛素信号通路的实验

1)重复上面细胞增殖实验的1)-4)步骤后，将细胞重悬于6孔板，每孔10万个细胞和1mL含有10％的胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养箱中过夜培养。

2)取10μL浓度为1mM的***(以下简称Dex)母液加入990μL含有10％的胎牛血清的DMEM培养基中，制得1ml的含有10μM Dex的培养基。取10μL浓度为1mM的Dex母液和10μL浓度为1μM的Ac-SSSR溶液加入980μL含有10％的胎牛血清的DMEM培养基中，制得1ml的含有10μM Dex和10nM Ac-SSSR的培养基。同样类似的制备方法得到含有10μM Dex和10nM Nap-FFGSSSR的培养基、含有10μM Dex和10nM IGF-1的培养基。向control组中加入1ml的不含Dex和任何多肽衍生物并且只含有10％的胎牛血清的DMEM培养基。

3)第二天吸出含有10％的胎牛血清的DMEM培养基，各组分别加入第2步中预先配置好的培养基每孔1mL，37℃培养箱中孵育24h之后提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳、转膜后加入T-AKT、P-AKT(T308)和P-AKT(S473)的一抗4℃孵育过夜，再加入二抗孵育1h后加显色液，用曝光仪进行曝光后拍照保存图片。用Image J软件进行定量计算，评价AKT的磷酸化程度，以及激活胰岛素信号通路的情况。

通过利用Western Blot检测T-AKT、P-AKT(T308)和P-AKT(S473)的表达情况来评价Nap-FFGSSSR水凝胶激活胰岛素信号通路的情况。结果如图3所示，用加号(+)和减号(-)来表示是否添加相应的物质，从图中可以看出均未添加Dex、Ac-SSSR、Nap-FFGSSSR和IGF-1这四种物质的组别为细胞处于正常生长状态的Control组三种基因均正常表达，一旦添加Dex后P-AKT(T308)和P-AKT(S473)这两种基因的表达量明显降低，再加入Nap-FFGSSSR和IGF-1后这两种基因的表达又开始上调，说明Nap-FFGSSSR能够激活胰岛素信号通路，加入Ac-SSSR后这两种基因的表达量略有升高，说明Ac-SSSR对胰岛素信号通路能够部分激活。

动物实施例1：

治疗小鼠肌肉萎缩的实验

1)模型建立：选用6～8周龄雌性C57BL/6小鼠，体重为20g±3g，连续28天每天按照0.2mg/kg/day的剂量注射Dex，构建肌肉萎缩小鼠模型。

2)给药治疗与统计：建模成功后，将小鼠随机分为5组，每组6只，每周给不同组别的小鼠腿部肌肉注射一次PBS缓冲溶液和含10μM的Ac-SSSR、Nap-FFGSSSR、IGF-1蛋白的溶液，注射量为100μL。其中注射PBS缓冲溶液的为control组。4周之后用双能X射线检测仪监测治疗前后小鼠的肌肉质量改变情况。统计各组小鼠肌肉质量的改变情况，统计学分析各组之间的差异性。

图4为小鼠肌肉质量改变图。从图中可以看出Dex组小鼠的肌肉质量明显下降，Nap-FFGSSSR和IGF-1组的小鼠肌肉质量与正常小鼠相当，表明Nap-FFGSSSR能够治疗小鼠肌肉萎缩。Ac-SSSR组小鼠的肌肉质量略有上升，说明Ac-SSSR对小鼠的肌肉萎缩有略微的治疗作用。

制备实施例2：

多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR及其水凝胶的合成与制备

(1)Npx-^DF^DFGSSSR的固相合成

具体步骤如下：

1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的无水DCM，放置在摇床上摇晃5min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；

2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；

3)将0.75mmol Fmoc-Arg溶解在10mL的无水DCM里，加入0.75mmol的DIPEA，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.75mmol的DIPEA，在室温下反应1h；

4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM∶DIPEA∶甲醇＝17∶1∶2的溶液20mL，在室温下反应10min；

5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，再用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，加入10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应25min，再用10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF反应5min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，进行下一步反应；

6)加入的Fmoc-Ser 1mmol、HBTU 1.5mmol、DIPEA 2mmol和10mL DMF，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h；

7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-Ser、Fmoc-Ser、Fmoc-Gly、Fmoc-D-Phe、Fmoc-D-Phe、(+)-α-甲基-6-甲氧基-2-萘乙酸，然后用DMF洗涤5遍，DCM洗5遍，进行下步反应；

8)按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H₂O体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时(或者TFA与DCM的体积比为1∶99，配制成体积百分比浓度为1％的TFA溶液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为1min)，把产物从2-Cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，得到多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR，产率约为80％。

(2)多肽衍生物的纳米纤维的制备

称取1.0mg纯化后的多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR，置于2mL的玻璃瓶中，加入500μLPBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得无色透明可倒置水凝胶。成胶与否采用倒置瓶子的方法判断，保留在瓶子底部为水凝胶，如果是流动的则为液体。所述水凝胶的溶解性好、可以常温放置1个月以上。所述水凝胶无色透明、可以常温放置1个月以上，显示其溶解性和储存稳定性较好。

制备实施例3：

多肽衍生物Npx-FFGSSSR及其纳米纤维的合成与制备

步骤同制备实施例2，区别仅在于(1)固相合成的步骤7)中加入的Fmoc-D-Phe改为Fmoc-Phe。

对比制备例4：

多肽衍生物Nap-FFGSRSS及其纳米纤维的合成与制备

步骤同制备实施例2，区别仅在于(1)固相合成的步骤3)中加入的Fmoc-Arg改为Fmoc-Ser，步骤7)中依次加入Fmoc-Ser、Fmoc-Ser、Fmoc-Gly、Fmoc-D-Phe、Fmoc-D-Phe、(+)-α-甲基-6-甲氧基-2-萘乙酸，改为依次加入Fmoc-Arg、Fmoc-Ser、Fmoc-Gly、Fmoc-Phe、Fmoc-Phe、2-萘乙酸。

采用负染色技术观察制备实施例1-3及对比制备例4所得多肽衍生物形成的水凝胶的微观结构。首先，用微量取样器吸取10μL水凝胶添加到碳涂层铜网格。半分钟后用滤纸擦干水凝胶，再用水冲洗铜网两次，然后用滤纸擦干水。用微量取样器吸取10μL醋酸铀染色1min后，用滤纸吸干染液，将铜网置于干燥器中干燥过夜。。第二天用透射显微镜观察水凝胶的微观形貌，结果如图5所示，其中A、B、C、D分别对应Npx-^DF^DFGSSSR(H1)、Npx-FFGSSSR(H2)、Nap-FFGSSSR(H3)、Nap-FFGSRSS(H4)形成的水凝胶的电镜样品。可以看到四种水凝胶均有大量均一的纳米纤维互相缠绕形成三维网状结构，但纤维直径分别约为26.8nm、14.6nm、9.8nm、17.3nm。

称取1.1mg纯化后的多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR，置于2mL的玻璃瓶中，加入1mL PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，用微量取样器吸取1μL加入到999μL的PBS溶液中，再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到1μM的Npx-^DF^DFGSSSR溶液；用微量取样器吸取10μL浓度为1μM的Npx-^DF^DFGSSSR溶液加入到990μL的PBS溶液中，再加热至沸腾使化合物完全溶解即得到10nM的Npx-^DF^DFGSSSR溶液。经电镜照片显示两种溶液的内部结构均为纳米纤维。按照同样的方法制备1μM、10nM的Npx-FFGSSSR溶液。经电镜照片显示两种溶液的内部结构均为纳米纤维。

采用微尺度热泳法测定多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR(H1)与IGF-1受体蛋白的结合常数，使用单分子NT蛋白标记试剂盒，用荧光染料NT-647标记IGF-1受体蛋白。采用含0.05％吐温-20(pH 7.4)的PBS缓冲液作为检测缓冲液。保持带有荧光标记的IGF-1受体蛋白的浓度为10μM不变,而Npx-^DF^DFGSSSR(H1)形成的水凝胶的浓度从2μM开始倍比稀释至0.054nM，得到一系列浓度梯度的溶液。然后将荧光蛋白溶液与不同浓度的溶液按1:1体积比混合。孵育1分钟后，将样品装入NT.115标准玻璃毛细管中，利用NT.115单体体系进行分析。KD值采用NanoTemper软件包计算。采用同样的方法测定Npx-FFGSSSR(H2)、Nap-FFGSSSR(H3)、Nap-FFGSRSS(H4)与IGF-1受体蛋白的结合常数，结果如图6所示，其中A、B、C、D分别对应Npx-^DF^DFGSSSR(H1)、Npx-FFGSSSR(H2)、Nap-FFGSSSR(H3)、Nap-FFGSRSS(H4)的测试结果。图中所示Npx-^DF^DFGSSSR(H1)、Npx-FFGSSSR(H2)、Nap-FFGSSSR(H3)与IGF-1受体蛋白的结合常数分别为145.36nM、172.54nM和229.75nM，说明Npx-^DF^DFGSSSR(H1)、Npx-FFGSSSR(H2)和Nap-FFGSSSR(H3)均与IGF-1受体蛋白有特异性的相互结合作用，并且Npx-^DF^DFGSSSR与IGF-1受体蛋白的结合能力最强，Npx-FFGSSSR(H2)其次，Nap-FFGSSSR(H3)最弱。Nap-FFGSRSS(H4)与IGF-1受体蛋白无结合常数，说明其无法结合。

细胞实施例2：

(1)抑制小鼠腹膜巨噬细胞向泡沫细胞转化的实验

1)小鼠腹腔一次性注射3ml高温灭菌的4％硫胶质处理4-5天；

2)安乐死后剖开腹部外皮，腹腔内注射10ml灭菌的PBS共两次，取得含巨噬细胞的PBS溶液；

3)1000rpm离心3分钟、弃上清，用RPMI 1640培养基重悬细胞，铺板；

4)1h后用灭菌PBS洗细胞(去悬浮的单核细胞及血细胞)，贴壁的巨噬细胞稳定两天后，进行处理。

5)取10μL浓度为1μM的Npx-^DF^DFGSSSR溶液，加入990μL含有10％的胎牛血清的RPMI1640培养基中，制得1ml的含有10nM Npx-DF^DFGSSSR(H1)的培养基。同样的方法制备含有10nM Npx-FFGSSSR(H2)、Nap-FFGSSSR(H3)、Nap-FFGSRSS(H4)或者IGF-1蛋白的培养基。

6)使用解剖镊子将玻璃片从无水乙醇中取出，在酒精灯上烤干，不要将玻璃片烤碎，然后在24孔板中每孔铺一片；使用3ml含有10％的胎牛血清的RPMI1640培养基将腹腔巨噬细胞吹打均匀，然后加入到铺好片的24孔板中，不同组别的孔内分别加入第5步中配好的培养基，向control(C)组中加入1ml的不含任何多肽衍生物的含有10％的胎牛血清的RPMI1640培养基，再放入37℃CO₂培养箱；

7)培养16h后吸走24孔板中培养基，加入1ml 1×PBS清洗细胞两次，吸走PBS后，加入500μl 4％多聚甲醛，室温固定30min；吸走多聚甲醛后使用PBS清洗细胞两次，然后加入600μl油红O工作液，室温下染色45-60min；使用超纯水清洗细胞3-4次，洗掉多余染液，然后加入450μl苏木素染液染色30s；将细胞放置于超纯水中静置6min，被使苏木素染色的细胞核由紫色变为蓝色；将适量封片剂滴加到载玻片上，然后使用解剖镊子小心将玻璃片取出，在滤纸上轻轻将上面的液体吸干，然后小心地将玻璃片有细胞的一侧覆盖于封片剂上，注意避免出现气泡；将片子放置于干净的实验台风干后，在正置显微镜下摄取图像并保存；含有脂滴数>20的巨噬细胞定义为泡沫细胞，计算泡沫细胞形成比例。结果如图7A所示。

(2)提高脂类转运体ABCA1和ABCG1的表达水平的实验

1)重复上面细胞实验的1)-5)步骤后，将细胞重悬于6孔板，每孔10万个细胞和1mL含有10％的胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃培养箱中过夜培养。

2)第二天吸出含有10％的胎牛血清的RPMI1640培养基，加入含有10nM Npx-^DF^DFGSSSR(H1)、10nM Npx-FFGSSSR(H2)、10nM Nap-FFGSSSR(H3)、10nM Nap-FFGSRSS(H4)和IGF-1蛋白的含有10％的胎牛血清的RPMI1640培养基每孔1mL，control(C)组为加入1ml不含有任何多肽衍生物的并且只含有10％的胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃培养箱中孵育24h之后提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳、转膜后加入ABCA1和ABCG1的一抗4℃孵育过夜，再加入二抗孵育1h后加显色液，用曝光仪进行曝光后拍照保存图片。用Image J软件进行定量计算，评价脂类转运体的表达水平。结果如图7B所示。

泡沫细胞的大量增多是动脉粥样硬化发生的重要信号，因此我们将泡沫细胞染色可以发现。如图7A所示，在加入IGF-1蛋白、多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR(H1)、Npx-FFGSSSR(H2)和Nap-FFGSSSR(H3)的组别中泡沫细胞的含量明显低于Control(C)组，由此可以看出IGF-1蛋白和这三种多肽衍生物具有减少巨噬细胞脂质积累的功能。而加入多肽衍生物Nap-FFGSRSS(H4)的组别中泡沫细胞的含量与Control(C)组差别不大，说明其无法减少巨噬细胞的脂质积累。并且我们发现H1组的泡沫细胞数量远小于IGF-1蛋白组，说明其减少巨噬细胞脂质积累的能力要强于IGF-1蛋白。从图7B中可以看出，在加入多肽衍生物Npx-^DF^DFGSSSR(H1)或Npx-FFGSSSR(H2)的组别中ABCA1和ABCG1这两个蛋白的的表达量明显提高，并且H1明显好于IGF-1蛋白组,H2和IGF-1蛋白组效果相当。Nap-FFGSSSR(H3)组的蛋白表达量虽也有提高，但明显弱于IGF-1蛋白组。Nap-FFGSRSS(H4)组的蛋白表达量没有提高，与Control(C)组效果相当。

动物实施例2：

治疗ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验

1)模型建立：选取促动脉粥样硬化模型小鼠，雄性ApoE基因缺陷小鼠，随机分组(每组15只)，分别喂食含有21％的脂肪和0.5％的胆固醇的高脂食物，喂食处理16周，构建小鼠动脉粥样硬化模型。

2)给药治疗与统计：在构建模型的16周内每周给小鼠肌肉注射一次PBS缓冲溶液和含1μM的Npx-^DF^DFGSSSR(H1)、Npx-FFGSSSR(H2)、Nap-FFGSSSR(H3)、Nap-FFGSRSS(H4)和IGF-1蛋白的溶液，注射量为100μL。其中注射PBS缓冲溶液的为control(C)组。

3)组织切片染色：实验结束时，所有小鼠均采用过量2,2,2-三溴乙醇(640mg/kg)安乐死，然后收集主动脉、血液和腹腔巨噬细胞。制备主动脉根部横切面切片，用脂类油红O染色检测窦部病变。结果如图8所示。

从图8中可以看出，经过Npx-^DF^DFGSSSR(H1)治疗的小鼠的主动脉斑块明显减少，效果优于IGF-1蛋白组。Npx-FFGSSSR(H2)和Nap-FFGSSSR(H3)组与Control(C)组比虽也能减少斑块数，但效果弱于Npx-^DF^DFGSSSR(H1)和IGF-1蛋白。Nap-FFGSRSS(H4)无法减少主动脉斑块。

用ELISA法测定收集的小鼠血清的细胞因子含量，结果如图9A所示。利用RT-PCR法测定主动脉中促炎细胞因子的表达，结果如图9B所示。可以发现Nap-FFGSRSS(H4)组炎症因子表达含量较高，与Control(C)组类似。而Npx-^DF^DFGSSSR(H1)组、Npx-FFGSSSR(H2)组和Nap-FFGSSSR(H3)组、IGF-1组的TNFα、IL-1β、IL-6这三种细胞因子含量均有所下降。其中Npx-^DF^DFGSSSR(H1)组含量最低，说明其能够有效降低促炎细胞因子的表达、从而抑制炎症的发生和发展，治疗动脉粥样硬化。

综上所述，多肽衍生物的抗动脉粥样硬化效果是：Npx-^DF^DFGSSSR(H1)明显优于IGF-1蛋白、Npx-FFGSSSR(H2)与IGF-1蛋白效果相当、Nap-FFGSSSR(H3)略微劣于IGF-1蛋白，而Nap-FFGSRSS(H4)几乎没有任何效果，与Control(C)组效果相当。

以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。