基因治疗构建体和使用方法
阅读说明：本技术 基因治疗构建体和使用方法 (Gene therapy constructs and methods of use ) 是由 H·杜 史蒂文·塔斯克 拉塞尔·戈乔尔 刘策峰 于 2019-04-30 设计创作，主要内容包括：本文提供了改进的基因治疗载体和使用方法,在一些实施方案中,所述基因治疗载体包含用于改进治疗性蛋白的表达和细胞靶向的序列。(Provided herein are improved gene therapy vectors and methods of use, which in some embodiments comprise sequences for improving expression and cell targeting of therapeutic proteins.)
交叉参考
本申请要求2018年4月30日提交的美国临时申请第62/664,741号、2018年6月22日提交的美国临时申请第62/688,640号和2018年10月10日提交的美国临时申请第62/744,068号的权益，所述美国临时申请的每一者通过引用整体并入本文中。
背景技术
遗传病症是通过发生在基因组的基因编码区中的可遗传或新生突变而发生。在一些情况下，通过施用由患有遗传病症的个体中突变的基因编码的蛋白质来治疗此类遗传病症。然而，由于蛋白质的施用并不总是导致蛋白质到达需要其的器官、细胞或细胞器，因此这种治疗具有挑战性。此外，这种治疗通常还需要每两周输注一次，而基因治疗则不需要，在基因治疗中单次治疗可以提供持久的缓解。因此，与目前可用的遗传病症的治疗相比，基因治疗有可能提供改善的结果。
发明内容
本文提供了用于使用基因治疗来治疗遗传病症的组合物和方法。本文还提供了用于基因治疗的基因治疗载体组分和方法，所述基因治疗用于改善蛋白质表达和增加细胞吸收或递送以及由基因治疗载体提供的治疗性蛋白的细胞内或亚细胞靶向。
在某些方面，提供基因治疗载体，例如包含核酸构建体的基因治疗载体，所述核酸构建体以5'至3'顺序包含：(a)翻译起始序列，和(b)编码治疗性蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，翻译起始序列包含Kozak序列。在一些实施方案中，翻译起始序列和编码治疗性蛋白的核酸序列可以重叠，使得翻译起始序列的后三个核苷酸也是治疗性蛋白的起始密码子。在一些实施方案中，Kozak序列包含序列AX1X2ATGA(SEQ ID NO:28)，其中X1和X2中的每一者为任何核苷酸。在一些实施方案中，X1包含A。在一些实施方案中，X2包含G。在一些实施方案中，Kozak序列包含与AAGATGA(SEQ ID NO:29)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与AAGATGA(SEQ ID NO:29)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含AAGATGA(SEQ ID NO:29)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)具至少85％同一性的核酸序列，其中最后三个核苷酸(ATG)也是治疗性蛋白的起始密码子。在一些实施方案中，Kozak序列与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含GCAAGATG(SEQ ID NO:44)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与CACCATG(SEQ ID NO:47)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与CACCATG(SEQ ID NO:47)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含CACCATG(SEQ ID NO:47)。在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码信号肽的核酸序列，所述信号肽能够相较于无信号肽的治疗性蛋白增加治疗性蛋白的分泌。在一些实施方案中，信号肽选自结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽和Gaussia信号肽。在一些实施方案中，BiP信号肽包含与选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽与选自由SEQID No:13-17组成的组的序列相差5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸。在一些实施方案中，BiP信号肽包含选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含与SEQ ID NO:32具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽与SEQ ID NO:32的序列相差5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体还包含内部核糖体进入序列(IRES)。在一些实施方案中，IRES为蟋蟀麻痹病毒(CrPV)IRES。在一些实施方案中，IRES包含与SEQ ID NO:12具至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，IRES包含SEQ ID NO:12。
在另外的方面，提供基因治疗载体，所述基因治疗载体包含核酸构建体，所述核酸构建体以5'至3'顺序包含：(a)编码信号肽的核酸序列，和(b)编码治疗性蛋白的核酸序列，其中信号肽能够相较于无信号肽的治疗性蛋白增加治疗性蛋白的分泌。在一些实施方案中，信号肽选自结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽和Gaussia信号肽。在一些实施方案中，BiP信号肽包含与选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽与选自由SEQ ID No:13-17组成的组的序列相差5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸。在一些实施方案中，BiP信号肽包含选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含Gaussia信号肽。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含与SEQ ID NO:32具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽与SEQ ID NO:32的序列相差5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含SEQ IDNO:32。在一些实施方案中，核酸构建体还包含翻译起始序列。在一些实施方案中，翻译起始序列包含Kozak序列，所述Kozak序列包含AX1X2ATGA(SEQ ID NO:28)，其中X1和X2中的每一者为任何核苷酸。在一些实施方案中，X1包含A。在一些实施方案中，X2包含G。在一些实施方案中，Kozak序列包含与AAGATGA(SEQ ID NO:29)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与AAGATGA(SEQ ID NO:29)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含AAGATGA(SEQ ID NO:29)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含GCAAGATG(SEQ ID NO:44)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与CACCATG(SEQ ID NO:47)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与CACCATG(SEQ ID NO:47)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含CACCATG(SEQ IDNO:47)。在一些实施方案中，核酸构建体还包含内部核糖体进入序列(IRES)。在一些实施方案中，IRES包含选自由以下组成的组的IRES：蟋蟀麻痹病毒(CrPV)IRES、小核糖核酸病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)相关疱疹病毒IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、蟋蟀麻痹病毒属(Cripavirus)IRES、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)病毒IRES和梅雷克病(Merek's disease)病毒IRES。在一些实施方案中，IRES包含与SEQ ID NO:12具至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，IRES包含SEQ ID NO:12。
在其它方面，提供基因治疗载体，其包含核酸构建体，所述核酸构建体以5'至3'顺序包含：(a)内部核糖体进入序列(IRES)，和(b)编码治疗性蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，IRES包含选自由以下组成的组的IRES：蟋蟀麻痹病毒(CrPV)IRES、小核糖核酸病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、卡波西肉瘤相关疱疹病毒IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、蟋蟀麻痹病毒属IRES、禾谷缢管蚜病毒IRES和梅雷克病病毒IRES。在一些实施方案中，IRES为蟋蟀麻痹病毒(CrPV)IRES。在一些实施方案中，IRES包含与SEQ ID NO:12具至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，IRES包含SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，核酸构建体还包含翻译起始序列。在一些实施方案中，翻译起始序列包含Kozak序列，所述Kozak序列包含AX1X2ATGA(SEQ ID NO:28)，其中X1和X2中的每一者为任何核苷酸。在一些实施方案中，X1包含A。在一些实施方案中，X2包含G。在一些实施方案中，Kozak序列包含与AAGATGA(SEQ ID NO:29)具至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含AAGATGA(SEQ ID NO:29)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含GCAAGATG(SEQ IDNO:44)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与CACCATG(SEQ ID NO:47)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与CACCATG(SEQ ID NO:47)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含CACCATG(SEQ ID NO:47)。在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码信号肽的信号核酸序列，所述信号肽能够相较于无信号肽的治疗性蛋白增加治疗性蛋白的分泌。在一些实施方案中，信号肽选自结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽和Gaussia信号肽。在一些实施方案中，BiP信号肽包含与选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，BiP信号肽包含选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含与SEQ ID NO:32具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含SEQ ID NO:32。
在一些实施方案中，本文提供的任何核酸构建体还包含编码以高亲和力选择性结合CI-MPR的肽的核酸序列，其中治疗性蛋白和选择性结合CI-MPR的肽被表达为融合蛋白。在一些实施方案中，核酸构建体在编码与CI-MPR核苷酸序列选择性结合的肽的核酸和编码治疗性蛋白的核酸序列之间还包含编码接头肽的序列。在一些实施方案中，接头肽的序列可与治疗性肽的序列或与CI-MPR选择性结合的肽的序列或两者重叠。在一些实施方案中，以高亲和力与CI-MPR结合的肽为变体IGF2肽(vIGF2)。在一些实施方案中，vIGF2肽促进吸收至细胞中。在一些实施方案中，vIGF2肽包含与选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的氨基酸序列具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，vIGF2肽包含选自由SEQ ID NO:2-11组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，vIGF2核苷酸序列在编码治疗性蛋白的核酸序列的5'。在一些实施方案中，vIGF2核苷酸序列在编码治疗性蛋白的核酸序列的3'。在一些实施方案中，核酸构建体还包含在所述vIGF2核苷酸序列与编码治疗性蛋白的所述核酸序列之间的编码接头肽的序列。在一些实施方案中，接头肽由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头肽包含与SEQ ID NO:18-21、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:37具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头肽包含SEQ ID NO:18-21、SEQ ID NO:33或SEQ IDNO:37。在一些实施方案中，治疗性蛋白与溶酶体贮积症相关联。在一些实施方案中，治疗性蛋白是溶酶体酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白选自由以下组成的组：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为α-半乳糖苷酶，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为α-葡糖苷酶，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为棕榈酰基蛋白质硫酯酶(PPT)，包括棕榈酰基蛋白质硫酯酶1和2(分别为PPT1和PPT2)。在一些实施方案中，治疗性蛋白为棕榈酰基蛋白质硫酯酶1。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，治疗性蛋白与选自由以下组成的组的遗传病症相关联：CDKL5缺乏症、囊肿性纤维化、α-地中海型贫血和β-地中海型贫血、镰状细胞贫血、马凡氏综合征(Marfan syndrome)、脆性X综合征、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、血色素沉着病、先天性耳聋(非综合征性)、塔伊-萨克斯病(Tay-Sachs)、家族性高胆固醇血症、杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)、斯特格氏病(Stargardt disease)、尤塞氏综合征(Usher syndrome)、无脉络膜症、色盲、X性联视网膜劈裂症、血友病、韦-奥氏综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、X性联慢性肉芽肿病、芳族L-氨基酸脱羧酶缺乏症、隐性营养不良大疱性表皮松解、α1抗胰蛋白酶缺乏症、哈钦森-吉尔福德早衰综合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome；HGPS)、努南综合征(Noonan syndrome)、X性联重度联合免疫缺陷症(X-SCID)。在一些实施方案中，治疗性蛋白选自由以下组成的组：CDKL5、连接蛋白26、己糖苷酶A、LDL受体、抗肌萎缩蛋白、CFTR、β-球蛋白、HFE、亨廷顿蛋白、ABCA4、肌球蛋白VIIA(MYO7A)、Rab护送蛋白-1(REP1)、环状核苷酸闸控通道β3(CNGB3)、视网膜劈裂素1(RS1)、血红素次单元β(HBB)、因子IX、WAS、细胞色素B-245β链、多巴脱羧酶(DDC)、VII型胶原蛋白α1链(COL7A1)、丝氨酸蛋白酶抑制因子家族A成员1(SERPINA1)、LMNA、PTPN11、SOS1、RAF1、KRAS和IL2受体γ基因。在一些实施方案中，治疗性蛋白能够替代患有遗传病症的受试者中与所述遗传病症相关的缺陷性或不足的蛋白质。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病(Fabry disease)、I型戈谢病(Gaucher disease)、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病(Pompe disease)、泰-萨克斯病(Tay Sachs disease)、桑多霍夫病(Sandhoff disease)、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病(Hurler disease)、亨特病(Hunter disease)、A型圣菲利波病(Sanfilippo disease)、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病(Morquio disease)、B型莫奎病、马罗托-拉米病(Maroteau-Lamy disease)、斯利病(Sly disease)、A型尼曼-匹克病(Niemann-Pickdisease)、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病(Schindlerdisease)和II型辛德勒病。在一些实施方案中，溶酶体贮积症选自由以下组成的组：活化因子缺乏症、GM2-神经节苷脂贮积病；GM2-神经节苷脂贮积病、AB变型；α-甘露糖苷贮积病(2型，中度形式；3型，新生儿，重度)；β-甘露糖苷贮积病；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；胱氨酸病(晚发性幼年型或青年肾病类型；婴儿肾病性)；钱林-多尔夫曼综合征(Chanarin-Dorfmansyndrome)；伴随肌病的中性脂贮积病；NLSDM；达农病(Danon disease)；法布里病；晚发性II型法布里病；法伯病(Farber disease)；法伯脂肪肉芽肿病；岩藻糖苷贮积症；半乳糖唾液酸贮积症(合并神经氨糖酸苷酶和β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈谢病；II型戈谢病；III型戈谢病；IIIC型戈谢病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致的非典型戈谢病；GM1-神经节苷脂贮积病(晚发婴儿型/幼年型GM1-神经节苷脂贮积病；成人/慢性GM1-神经节苷脂贮积病)；球状细胞脑白质营养不良、克拉培病(Krabbe disease)(晚发性婴儿型；幼年发作型；成年发作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致的非典型克拉培病；异染性脑白质营养不良(幼年型；成人)；部分硫酸脑苷脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致的异染性脑白质营养不良；粘多糖贮积症：MPS I、贺勒综合征；MPS I、贺勒-沙伊综合征；MPS I、沙伊综合征；MPS II、亨特综合征；MPS II、亨特综合征；A型圣菲利波综合征/MPS IIIA；B型圣菲利波综合征/MPS IIIB；C型圣菲利波综合征/MPS IIIC；D型圣菲利波综合征/MPS IIID；莫奎综合征、A型/MPS IVA；莫奎综合征、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI马洛特-拉米综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)；MPS VII斯利综合征(Sly syndrome)；黏脂贮积症I、II型唾液腺病；I-细胞病、勒罗伊病(Leroy disease)、黏脂贮积症II；假贺勒多营养不良/III型黏脂贮积症；黏脂贮积症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂贮积症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神经疾病形式；C2型；D型/Nova Scotian型)；神经元蜡样质脂褐质沉积症：CLN6病，非典型晚期婴儿型、晚发作变型、早幼年型；巴斯沃三氏(Batten-Spielmeyer-Vogt)/幼年型NCL/CLN3病；芬兰变型晚期婴儿型CLN5；詹斯基-比尔朔夫斯基病(Jansky-Bielschowsky disease)/晚期婴儿型CLN2/TPP1病；库夫斯(Kufs)/成年发作型NCL/CLN4病(B型)；北方癫痫症/变型晚期婴儿型CLN8；桑塔沃里-哈尔蒂亚(Santavuori-Haltia)/婴儿型CLN1/PPT病；庞培氏病(II型糖原贮积病)；晚发型庞培氏病；密骨发育障碍；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；辛德勒病(III型/中度，可变)；神琦病(Kanzakidisease)；萨拉病(Salla disease)；婴儿型无唾液酸贮积病(ISSD)；伴随进展性肌痉挛癫痫症的脊髓性肌萎缩(SMAPME)；泰-萨克斯病/GM2神经节苷脂贮积病；幼发型泰-萨克斯病；晚发型泰-萨克斯病；克里斯蒂安综合征(Christianson syndrome)；劳威(Lowe)眼-脑-肾综合征；4J型恰克-马里-杜斯病(Charcot-Marie-Tooth)，CMT4J；尤里斯-凡伦综合征(Yunis-Varon syndrome)；双侧颞枕多小脑回(bilateral temporooccipitalpolymicrogyria；BTOP)；X性联高钙性肾石病，登特-1；和登特病2、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)和神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，遗传病症为庞培氏病。在一些实施方案中，遗传病症为神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，神经元蜡样质脂褐质沉积症选自由以下组成的组：婴儿型NCL(桑塔沃里-哈尔蒂亚病)、晚期婴儿型NCL(詹斯基-比尔朔夫斯基病)、巴腾病、成人NCL(库夫斯病)、芬兰晚期婴儿型NCL、变型晚期婴儿型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚期婴儿型NCL、9型NCL和CLN10。在一些实施方案中，基因治疗载体为病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体为腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体、腺病毒载体或疱疹病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体为AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，AAV载体选自由以下组成的组：AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAVrhS载体、AAVrh10载体、AAVrh33载体、AAVrh34载体、AAVrh74载体、AAV Anc80载体、AAVPHP.B载体、AAVhu68载体和AAV-DJ载体。
在某些方面，提供基因治疗载体，例如包含以下的基因治疗载体：(a)编码治疗性蛋白的核酸序列，和(b)编码以高亲和力与CI-MPR结合的肽的核酸序列。在一些实施方案中，肽为变体IGF2(vIGF2)肽。在一些实施方案中，vIGF2肽包含与SEQ ID NO:1具至少90％同一性并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置处具有至少一个取代的氨基酸序列：SEQ ID NO:1的位置6、26、27、43、48、49、50、54、55和65。在一些实施方案中，所述至少一个取代选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R和K65R。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在选自由以下组成的组的两个或更多个位置处的至少两个取代：SEQ ID NO:1的位置6、26、27、43、48、49、50、54和55。在一些实施方案中，所述至少两个取代选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R和L55R。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在SEQ ID NO:1的位置1处的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-2的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ IDNO:1的位置1-3的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-4的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-4的N端缺失和E6R、Y27L和K65R的取代。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-4的N端缺失以及E6R和Y27L的取代。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-5的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在SEQ ID NO:1的位置1-6处的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在SEQ ID NO:1的位置1-7处的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽相较于原生IGF2肽针对胰岛素受体和IGF1R具有降低的亲和力或无亲和力。在一些实施方案中，vIGF2肽能够促进将治疗性蛋白吸收至细胞中。在一些实施方案中，vIGF2肽能够促进将治疗性蛋白吸收至溶酶体中。在一些实施方案中，治疗性蛋白能够替代患有遗传病症的受试者中与所述遗传病症相关的缺陷性或不足的蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白为溶酶体酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病和II型辛德勒病。在一些实施方案中，溶酶体贮积症选自由以下组成的组：活化因子缺乏症、GM2-神经节苷脂贮积病；GM2-神经节苷脂贮积病、AB变型；α-甘露糖苷贮积病(2型，中度形式；3型，新生儿，重度)；β-甘露糖苷贮积病；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；胱氨酸病(晚发性幼年型或青年肾病类型；婴儿肾病性)；钱林-多尔夫曼综合征；伴随肌病的中性脂贮积病；NLSDM；达农病；法布里病；晚发性II型法布里病；法伯病；法伯脂肪肉芽肿病；岩藻糖苷贮积症；半乳糖唾液酸贮积症(合并神经氨糖酸苷酶和β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈谢病；II型戈谢病；III型戈谢病；IIIC型戈谢病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致的非典型戈谢病；GM1-神经节苷脂贮积病(晚期婴儿型/幼年型GM1-神经节苷脂贮积病；成人/慢性GM1-神经节苷脂贮积病)；球状细胞脑白质营养不良、克拉培病(晚发性婴儿型；幼年发作型；成年发作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致的非典型克拉培病；异染性脑白质营养不良(幼年型；成人)；部分硫酸脑苷脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致的异染性脑白质营养不良；粘多糖贮积症：MPS I、贺勒综合征；MPSI、贺勒-沙伊综合征；MPS I、沙伊综合征；MPS II、亨特综合征；MPS II、亨特综合征；A型圣菲利波综合征/MPS IIIA；B型圣菲利波综合征/MPS IIIB；C型圣菲利波综合征/MPS IIIC；D型圣菲利波综合征/MPS IIID；莫奎综合征、A型/MPS IVA；莫奎综合征、B型/MPS IVB；MPSIX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI马洛特-拉米综合征；MPS VII斯利综合征；黏脂贮积症I、II型唾液腺病；I-细胞病、勒罗伊病、黏脂贮积症II；假贺勒多营养不良/III型黏脂贮积症；黏脂贮积症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂贮积症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神经疾病形式；C2型；D型/Nova Scotian型)；神经元蜡样质脂褐质沉积症：CLN6病，非典型晚期婴儿型、晚发作变型、早幼年型；巴斯沃三氏/幼年型NCL/CLN3病；芬兰变型晚期婴儿型CLN5；詹斯基-比尔朔夫斯基病/晚期婴儿型CLN2/TPP1病；库夫斯/成年发作型NCL/CLN4病(B型)；北方癫痫症/变型晚期婴儿型CLN8；桑塔沃里-哈尔蒂亚/婴儿型CLN1/PPT病；庞培氏病(II型糖原贮积病)；晚发型庞培氏病；密骨发育障碍；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；辛德勒病(III型/中度，可变)；神琦病；萨拉病；婴儿型无唾液酸贮积病(ISSD)；伴随进展性肌痉挛癫痫症的脊髓性肌萎缩(SMAPME)；泰-萨克斯病/GM2神经节苷脂贮积病；幼发型泰-萨克斯病；晚发型泰-萨克斯病；克里斯蒂安综合征；劳威眼-脑-肾综合征；4J型恰克-马里-杜斯病，CMT4J；尤里斯-凡伦综合征；双侧颞枕多小脑回(BTOP)；X性联高钙性肾石病，登特-1；和登特病2、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)、慢性肉芽肿病(CGD)和神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，遗传病症为庞培氏病。在一些实施方案中，遗传病症为神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，神经元蜡样质脂褐质沉积症选自由以下组成的组：婴儿型NCL(桑塔沃里-哈尔蒂亚病)、晚期婴儿型NCL(詹斯基-比尔朔夫斯基病)、巴腾病、成人NCL(库夫斯病)、芬兰晚期婴儿型NCL、变型晚期婴儿型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚期婴儿型NCL、9型NCL和CLN10。在一些实施方案中，治疗性蛋白为可溶性溶酶体酶。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含选自由以下组成的组的酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，棕榈酰基蛋白质硫酯酶为棕榈酰基蛋白质硫酯酶1(PPT1)或2(PPT2)。在一些实施方案中，棕榈酰基蛋白质硫酯酶为棕榈酰基蛋白质硫酯酶1。在一些实施方案中，核酸构建体还包含翻译起始序列。在一些实施方案中，翻译起始序列包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含序列AX1X2ATGA(SEQ ID NO:28)，其中X1和X2中的每一者为任何核苷酸。在一些实施方案中，X1包含A。在一些实施方案中，X2包含G。在一些实施方案中，Kozak序列包含与AAGATGA(SEQ ID NO:29)具至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含AAGATGA(SEQ ID NO:29)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含GCAAGATG(SEQ ID NO:44)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与CACCATG(SEQ ID NO:47)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与CACCATG(SEQ ID NO:47)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含CACCATG(SEQ ID NO:47)。在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码信号肽的核酸序列，其中信号肽能够相较于无信号肽的治疗性蛋白增加治疗性蛋白的分泌。在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码信号肽的核酸序列，其中所述信号肽能够相较于具有天然信号肽的治疗性蛋白增加治疗性蛋白的分泌。在一些实施方案中，核酸构建体包含编码非天然信号肽的核酸序列，其中所述非天然信号肽相较于治疗性蛋白的原生信号肽能够增加治疗性蛋白的分泌。在一些实施方案中，信号肽选自结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽和Gaussia信号肽。在一些实施方案中，BiP信号肽包含与选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，BiP信号肽包含选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含Gaussia信号肽。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含与SEQ ID NO:32具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，vIGF2核酸序列在编码治疗性蛋白的核酸序列的5'。在一些实施方案中，vIGF2核酸序列在编码治疗性蛋白的核酸序列的3'。在一些实施方案中，核酸构建体还包含在所述vIGF2核苷酸序列与编码治疗性蛋白的所述核酸序列之间的编码接头肽的序列。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头肽包含SEQ ID NO:18-21或SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，基因治疗载体为病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或疱疹病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体为AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，AAV载体选自由以下组成的组：AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAVrhS载体、AAVrh10载体、AAVrh33载体、AAVrh34载体、AAVrh74载体、AAV Anc80载体、AAVPHP.B载体、AAVhu68载体和AAV-DJ载体。
一种基因治疗载体，所述基因治疗载体包含核酸构建体，所述核酸构建体包含：(a)编码治疗性蛋白的核酸序列，和(b)编码增加治疗性蛋白的内吞作用的肽的核酸序列。在一些实施方案中，增加所述治疗性蛋白的内吞作用的所述肽为与CI-MPR结合的肽。在一些实施方案中，肽为变体IGF2(vIGF2)肽、HIRMab或TfRMab或其它细胞靶向肽或蛋白质。在一些实施方案中，肽为vIGF2。在一些实施方案中，vIGF2肽包含与SEQ ID NO:1具至少90％同一性并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置处具有至少一个取代的氨基酸序列：SEQ ID NO:1的位置6、26、27、43、48、49、50、54、55和65。在一些实施方案中，所述至少一个取代选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R和K65R。在一些实施方案中，所述至少一个取代选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R和L55R。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在选自由以下组成的组的两个或更多个位置处的至少两个取代：SEQ ID NO:1的位置6、26、27、43、48、49、50、54和55。在一些实施方案中，所述至少两个取代选自由以下组成的组：SEQID NO:1的E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R和L55R。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在SEQ ID NO:1的位置1处的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在SEQ ID NO:1的位置1-6处的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-2的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-3的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-4的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-4的N端缺失以及E6R、Y27L和K65R的取代。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ IDNO:1的位置1-4的N端缺失以及E6R和Y27L的取代。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQID NO:1的位置1-5的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含SEQ ID NO:1的位置1-6的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在SEQ ID NO:1的位置1-7处的N端缺失。在一些实施方案中，所述vIGF2肽相较于原生IGF2肽针对阳离子非依赖性M6P受体(CI-MPR)具有增加的特异性。在一些实施方案中，vIGF2肽能够促进将治疗性蛋白吸收至细胞中的溶酶体中。在一些实施方案中，治疗性蛋白能够替代患有遗传病症的受试者中与所述遗传病症相关的缺陷性或不足的蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白为溶酶体酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病和II型辛德勒病。在一些实施方案中，溶酶体贮积症选自由以下组成的组：活化因子缺乏症、GM2-神经节苷脂贮积病；GM2-神经节苷脂贮积病、AB变型；α-甘露糖苷贮积病(2型，中度形式；3型，新生儿，重度)；β-甘露糖苷贮积病；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；胱氨酸病(晚发性幼年型或青年肾病类型；婴儿肾病性)；钱林-多尔夫曼综合征；伴随肌病的中性脂贮积病；NLSDM；达农病；法布里病；晚发性II型法布里病；法伯病；法伯脂肪肉芽肿病；岩藻糖苷贮积症；半乳糖唾液酸贮积症(合并神经氨糖酸苷酶和β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈谢病；II型戈谢病；III型戈谢病；IIIC型戈谢病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致的非典型戈谢病；GM1-神经节苷脂贮积病(晚期婴儿型/幼年型GM1-神经节苷脂贮积病；成人/慢性GM1-神经节苷脂贮积病)；球状细胞脑白质营养不良、克拉培病(晚发性婴儿型；幼年发作型；成年发作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致的非典型克拉培病；异染性脑白质营养不良(幼年型；成人)；部分硫酸脑苷脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致的异染性脑白质营养不良；粘多糖贮积症：MPS I、贺勒综合征；MPS I、贺勒-沙伊综合征；MPS I、沙伊综合征；MPS II、亨特综合征；MPS II、亨特综合征；A型圣菲利波综合征/MPS IIIA；B型圣菲利波综合征/MPS IIIB；C型圣菲利波综合征/MPS IIIC；D型圣菲利波综合征/MPS IIID；莫奎综合征、A型/MPS IVA；莫奎综合征、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI马洛特-拉米综合征；MPS VII斯利综合征；黏脂贮积症I、II型唾液腺病；I-细胞病、勒罗伊病、黏脂贮积症II；假贺勒多营养不良/III型黏脂贮积症；黏脂贮积症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂贮积症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神经疾病形式；C2型；D型/NovaScotian型)；神经元蜡样质脂褐质沉积症：CLN6病，非典型晚期婴儿型、晚发作变型、早幼年型；巴斯沃三氏/幼年型NCL/CLN3病；芬兰变型晚期婴儿型CLN5；詹斯基-比尔朔夫斯基病/晚期婴儿型CLN2/TPP1病；库夫斯/成年发作型NCL/CLN4病(B型)；北方癫痫症/变型晚期婴儿型CLN8；桑塔沃里-哈尔蒂亚/婴儿型CLN1/PPT病；庞培氏病(II型糖原贮积病)；晚发型庞培氏病；密骨发育障碍；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；辛德勒病(III型/中度，可变)；神琦病；萨拉病；婴儿型无唾液酸贮积病(ISSD)；伴随进展性肌痉挛癫痫症的脊髓性肌萎缩(SMAPME)；泰-萨克斯病/GM2神经节苷脂贮积病；幼发型泰-萨克斯病；晚发型泰-萨克斯病；克里斯蒂安综合征；劳威眼-脑-肾综合征；4J型恰克-马里-杜斯病，CMT4J；尤里斯-凡伦综合征；双侧颞枕多小脑回(BTOP)；X性联高钙性肾石病，登特-1；和登特病2、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)、慢性肉芽肿病(CGD)和神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，遗传病症为庞培氏病。在一些实施方案中，遗传病症为神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，神经元蜡样质脂褐质沉积症选自由以下组成的组：婴儿型NCL(桑塔沃里-哈尔蒂亚病)、晚期婴儿型NCL(詹斯基-比尔朔夫斯基病)、巴腾病、成人NCL(库夫斯病)、芬兰晚期婴儿型NCL、变型晚期婴儿型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚期婴儿型NCL、9型NCL和CLN10。在一些实施方案中，治疗性蛋白为可溶性溶酶体酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含选自由以下组成的组的酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为α-葡糖苷酶，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，棕榈酰基蛋白质硫酯酶为棕榈酰基蛋白质硫酯酶1(PPT1)或2(PPT2)。在一些实施方案中，棕榈酰基蛋白质硫酯酶为棕榈酰基蛋白质硫酯酶1。在一些实施方案中，核酸构建体还包含翻译起始序列。在一些实施方案中，翻译起始序列包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含序列AX1X2ATGA(SEQ ID NO:28)，其中X1和X2中的每一者为任何核苷酸。在一些实施方案中，X1包含A。在一些实施方案中，X2包含G。在一些实施方案中，Kozak序列包含与AAGATGA(SEQ ID NO:29)具至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含AAGATGA(SEQ ID NO:29)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含GCAAGATG(SEQ ID NO:44)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与CACCATG(SEQ IDNO:47)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与CACCATG(SEQ IDNO:47)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含CACCATG(SEQ IDNO:47)。在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码信号肽的信号核酸序列，其中信号肽能够相较于无信号肽的治疗性蛋白增加治疗性蛋白的分泌。在一些实施方案中，信号肽选自结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽和Gaussia信号肽。在一些实施方案中，BiP信号肽包含与选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，BiP信号肽包含选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含Gaussia信号肽。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含与SEQ ID NO:32具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Gaussia信号肽包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，vIGF2核酸序列在编码治疗性蛋白的核酸序列的5'。在一些实施方案中，vIGF2核酸序列在编码治疗性蛋白的核酸序列的3'。在一些实施方案中，核酸构建体还包含在所述vIGF2核苷酸序列与编码治疗性蛋白的所述核酸序列之间的编码接头肽的接头序列。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头肽包含SEQ ID NO:18-21或SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，基因治疗载体为病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或疱疹病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体为AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，AAV载体选自由以下组成的组：AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAVrhS载体、AAVrh10载体、AAVrh33载体、AAVrh34载体、AAVrh74载体、AAV Anc80载体、AAVPHP.B载体、AAVhu68载体和AAV-DJ载体。
在另外的方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含(i)治疗有效量的本文中的任何一种基因治疗载体，和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，载体或赋形剂包含非离子性低渗透化合物、缓冲剂、聚合物、盐或其组合。
在其它方面，提供用于治疗遗传病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文提供的任何一种基因治疗载体或本文提供的任何一种药物组合物。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病和II型辛德勒病。在一些实施方案中，溶酶体贮积症选自由以下组成的组：活化因子缺乏症、GM2-神经节苷脂贮积病；GM2-神经节苷脂贮积病、AB变型；α-甘露糖苷贮积病(2型，中度形式；3型，新生儿，重度)；β-甘露糖苷贮积病；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；胱氨酸病(晚发性幼年型或青年肾病类型；婴儿肾病性)；钱林-多尔夫曼综合征；伴随肌病的中性脂贮积病；NLSDM；达农病；法布里病；晚发性II型法布里病；法伯病；法伯脂肪肉芽肿病；岩藻糖苷贮积症；半乳糖唾液酸贮积症(合并神经氨糖酸苷酶和β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈谢病；II型戈谢病；III型戈谢病；IIIC型戈谢病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致的非典型戈谢病；GM1-神经节苷脂贮积病(晚期婴儿型/幼年型GM1-神经节苷脂贮积病；成人/慢性GM1-神经节苷脂贮积病)；球状细胞脑白质营养不良、克拉培病(晚发性婴儿型；幼年发作型；成年发作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致的非典型克拉培病；异染性脑白质营养不良(幼年型；成人)；部分硫酸脑苷脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致的异染性脑白质营养不良；粘多糖贮积症：MPS I、贺勒综合征；MPS I、贺勒-沙伊综合征；MPS I、沙伊综合征；MPS II、亨特综合征；MPS II、亨特综合征；A型圣菲利波综合征/MPS IIIA；B型圣菲利波综合征/MPS IIIB；C型圣菲利波综合征/MPS IIIC；D型圣菲利波综合征/MPS IIID；莫奎综合征、A型/MPS IVA；莫奎综合征、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI马洛特-拉米综合征；MPS VII斯利综合征；黏脂贮积症I、II型唾液腺病；I-细胞病、勒罗伊病、黏脂贮积症II；假贺勒多营养不良/III型黏脂贮积症；黏脂贮积症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂贮积症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神经疾病形式；C2型；D型/Nova Scotian型)；神经元蜡样质脂褐质沉积症：CLN6病，非典型晚期婴儿型、晚发作变型、早幼年型；巴斯沃三氏/幼年型NCL/CLN3病；芬兰变型晚期婴儿型CLN5；詹斯基-比尔朔夫斯基病/晚期婴儿型CLN2/TPP1病；库夫斯/成年发作型NCL/CLN4病(B型)；北方癫痫症/变型晚期婴儿型CLN8；桑塔沃里-哈尔蒂亚/婴儿型CLN1/PPT病；庞培氏病(II型糖原贮积病)；晚发型庞培氏病；密骨发育障碍；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；辛德勒病(III型/中度，可变)；神琦病；萨拉病；婴儿型无唾液酸贮积病(ISSD)；伴随进展性肌痉挛癫痫症的脊髓性肌萎缩(SMAPME)；泰-萨克斯病/GM2神经节苷脂贮积病；幼发型泰-萨克斯病；晚发型泰-萨克斯病；克里斯蒂安综合征；劳威眼-脑-肾综合征；4J型恰克-马里-杜斯病，CMT4J；尤里斯-凡伦综合征；双侧颞枕多小脑回(BTOP)；X性联高钙性肾石病、登特-1；和登特病2、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)、慢性肉芽肿病(CGD)、CDKL5缺乏症和神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，遗传病症为庞培氏病。在一些实施方案中，遗传病症为神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，神经元蜡样质脂褐质沉积症选自由以下组成的组：婴儿型NCL(桑塔沃里-哈尔蒂亚病)、晚期婴儿型NCL(詹斯基-比尔朔夫斯基病)、巴腾病、成人NCL(库夫斯病)、芬兰晚期婴儿型NCL、变型晚期婴儿型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚期婴儿型NCL、9型NCL和CLN10。在一些实施方案中，施用是以鞘内、眼内、玻璃体内、经视网膜、静脉内、肌肉内、心室内、大脑内、小脑内、脑室内、脑实质内、经眼、皮下或其组合方式进行。在一些实施方案中，施用是以鞘内方式进行。在一些实施方案中，施用是以眼内、玻璃体内或经视网膜方式进行。
在另外的方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文中的任何一种基因治疗载体和药学上可接受的载体或赋形剂以用于治疗遗传病症。在其它方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文中的任何一种基因治疗载体和药学上可接受的载体或赋形剂以用于制备用于治疗遗传病症的药物。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病和II型辛德勒病。在一些实施方案中，溶酶体贮积症选自由以下组成的组：活化因子缺乏症、GM2-神经节苷脂贮积病；GM2-神经节苷脂贮积病、AB变型；α-甘露糖苷贮积病(2型，中度形式；3型，新生儿，重度)；β-甘露糖苷贮积病；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；胱氨酸病(晚发性幼年型或青年肾病类型；婴儿肾病性)；钱林-多尔夫曼综合征；伴随肌病的中性脂贮积病；NLSDM；达农病；法布里病；晚发性II型法布里病；法伯病；法伯脂肪肉芽肿病；岩藻糖苷贮积症；半乳糖唾液酸贮积症(合并神经氨糖酸苷酶和β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈谢病；II型戈谢病；III型戈谢病；IIIC型戈谢病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致的非典型戈谢病；GM1-神经节苷脂贮积病(晚期婴儿型/幼年型GM1-神经节苷脂贮积病；成人/慢性GM1-神经节苷脂贮积病)；球状细胞脑白质营养不良、克拉培病(晚发性婴儿型；幼年发作型；成年发作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致的非典型克拉培病；异染性脑白质营养不良(幼年型；成人)；部分硫酸脑苷脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致的异染性脑白质营养不良；粘多糖贮积症：MPS I、贺勒综合征；MPSI、贺勒-沙伊综合征；MPS I、沙伊综合征；MPS II、亨特综合征；MPS II、亨特综合征；A型圣菲利波综合征/MPS IIIA；B型圣菲利波综合征/MPS IIIB；C型圣菲利波综合征/MPS IIIC；D型圣菲利波综合征/MPS IIID；莫奎综合征、A型/MPS IVA；莫奎综合征、B型/MPS IVB；MPSIX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI马洛特-拉米综合征；MPS VII斯利综合征；黏脂贮积症I、II型唾液腺病；I-细胞病、勒罗伊病、黏脂贮积症II；假贺勒多营养不良/III型黏脂贮积症；黏脂贮积症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂贮积症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神经疾病形式；C2型；D型/Nova Scotian型)；神经元蜡样质脂褐质沉积症：CLN6病，非典型晚期婴儿型、晚发作变型、早幼年型；巴斯沃三氏/幼年型NCL/CLN3病；芬兰变型晚期婴儿型CLN5；詹斯基-比尔朔夫斯基病/晚期婴儿型CLN2/TPP1病；库夫斯/成年发作型NCL/CLN4病(B型)；北方癫痫症/变型晚期婴儿型CLN8；桑塔沃里-哈尔蒂亚/婴儿型CLN1/PPT病；庞培氏病(II型糖原贮积病)；晚发型庞培氏病；密骨发育障碍；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；辛德勒病(III型/中度，可变)；神琦病；萨拉病；婴儿型无唾液酸贮积病(ISSD)；伴随进展性肌痉挛癫痫症的脊髓性肌萎缩(SMAPME)；泰-萨克斯病/GM2神经节苷脂贮积病；幼发型泰-萨克斯病；晚发型泰-萨克斯病；克里斯蒂安综合征；劳威眼-脑-肾综合征；4J型恰克-马里-杜斯病，CMT4J；尤里斯-凡伦综合征；双侧颞枕多小脑回(BTOP)；X性联高钙性肾石病、登特-1；和登特病2、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)、慢性肉芽肿病(CGD)、CDKL5缺乏症和神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，遗传病症为庞培氏病。在一些实施方案中，遗传病症为神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，神经元蜡样质脂褐质沉积症选自由以下组成的组：婴儿型NCL(桑塔沃里-哈尔蒂亚病)、晚期婴儿型NCL(詹斯基-比尔朔夫斯基病)、巴腾病、成人NCL(库夫斯病)、芬兰晚期婴儿型NCL、变型晚期婴儿型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚期婴儿型NCL、9型NCL和CLN10。在一些实施方案中，组合物被配制成用于鞘内、眼内、玻璃体内、经视网膜、静脉内、肌肉内、心室内、大脑内、小脑内、经眼或皮下施用。在一些实施方案中，组合物被配制成用于鞘内施用。在一些实施方案中，组合物被配制成用于鞘内施用以用于治疗神经退化性病症。在一些实施方案中，组合物被配制成用于经眼、玻璃体内或经视网膜施用。
本文提供了基因治疗载体，所述基因治疗载体包含编码多肽的核酸构建体，所述多肽包含：(a)治疗性蛋白；(b)以高亲和力与阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸(M6P)受体(CI-MPR)结合的肽；和(c)所述治疗性蛋白与所述结合CI-MPR的肽之间的接头。在一些实施方案中，所述肽为变体IGF2(vIGF2)肽。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含与SEQ ID NO:1具至少90％同一性并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置处具有至少一个取代的氨基酸序列：SEQ ID NO:1的位置6、26、27、43、48、49、50、54、55和65。在一些实施方案中，所述至少一个取代选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R和K65R。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在选自由以下组成的组的两个或更多个位置处的至少两个取代：SEQ ID NO:1的位置6、26、27、43、48、49、50、54、55、65。在一些实施方案中，所述至少两个取代选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R、K65R。在一些实施方案中，所述vIGF2肽包含在SEQID NO:1的位置1-4处的N端缺失。在一些实施方案中，其中所述vIGF2肽相较于原生IGF2肽针对胰岛素受体和IGF1R具有降低的亲和力。在一些实施方案中，所述vIGF2肽能够促进将所述治疗性蛋白吸收至细胞中。在一些实施方案中，所述vIGF2肽能够促进将所述治疗性蛋白吸收至溶酶体中。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白能够替代患有遗传病症的受试者中与所述遗传病症相关的缺陷性或不足的蛋白质。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，所述遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)、慢性肉芽肿病(CGD)和神经元蜡样质脂褐质沉积症。在一些实施方案中，所述遗传病症为庞培氏病。在一些实施方案中，所述遗传病症为CLN1病。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白包含可溶性溶酶体酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白包含溶酶体酶或其酶促活性片段，其中所述溶酶体酶选自由以下组成的组：α-半乳糖苷酶A、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、棕榈酰基蛋白质硫酯酶、细胞周期蛋白依赖性激酶样5和α-葡糖苷酶。在一些实施方案中，治疗性蛋白是α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白是棕榈酰基蛋白质硫酯酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白是棕榈酰基蛋白质硫酯酶-1或其酶促活性片段。在一些实施方案中，核酸构建体还包含翻译起始序列。在一些实施方案中，翻译起始序列包含Kozak序列。在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码信号肽的核酸序列，其中所述信号肽能够相较于无所述信号肽的治疗性蛋白来增加治疗性蛋白的分泌。在一些实施方案中，信号肽选自结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽和Gaussia信号肽。在一些实施方案中，BiP信号肽包含与选自由SEQ ID NO:13-17组成的组的氨基酸序列具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，vIGF2肽包含SEQID NO:31的序列。在一些实施方案中，构建体包含SEQ ID NO:36。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，构建体包含SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，vIGF2在多肽的N末端。在一些实施方案中，vIGF2在多肽的C末端。在一些实施方案中，接头肽包含SEQ ID NO:18-21或SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，基因治疗载体是选自由以下组成的组的病毒载体：腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体、腺病毒载体和疱疹病毒载体。
在某些方面，提供了融合蛋白，例如包含变体IGF2肽和治疗性蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ IDNO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37，在本文中也称为“2GS”)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)的核酸编码。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，融合蛋白由包含Kozak序列的核酸编码。
在另外的方面，提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含信号肽和治疗性蛋白，其中所述信号肽在从细胞分泌时在翻译后去除。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)的核酸编码。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，融合蛋白由包含Kozak序列的核酸编码。
在其它方面，提供了编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含治疗性蛋白，其中融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)的核酸编码。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，融合蛋白由包含Kozak序列的核酸编码。
在另外的方面，提供了包含治疗性蛋白的融合蛋白，其中所述融合蛋白由包含Kozak序列的核酸编码。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ IDNO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)的核酸编码。
在另外的方面，提供了编码融合蛋白的核酸，例如编码包含变体IGF2肽和治疗性蛋白的融合蛋白的核酸。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ IDNO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。
在其它方面，提供了编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含信号肽和治疗性蛋白。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。
在另外的方面，提供了编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含治疗性蛋白，其中所述核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。
在其它方面，提供了编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含治疗性蛋白，其中所述核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。
在另外的方面，提供了组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含变体IGF2肽和治疗性蛋白；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。
在另外的方面，提供了组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含信号肽和治疗性蛋白；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。
在其它方面，提供了组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含治疗性蛋白；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂，其中所述核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ IDNO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。
在其它方面，提供了组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含治疗性蛋白；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂，其中所述核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPVIRES)。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。
在另外的方面，提供了治疗个体的遗传病症的方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含变体IGF2肽和治疗性蛋白；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，所述遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)和慢性肉芽肿病(CGD)。在一些实施方案中，以离体方式处理来自个体的细胞，并且在离体处理后向所述个体施用所述细胞。
在另外的方面，提供了治疗个体的遗传病症的方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含信号肽和治疗性蛋白；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，所述遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)和慢性肉芽肿病(CGD)。在一些实施方案中，离体处理来自个体的细胞，并且在离体处理之后向所述个体施用所述细胞。
在其它方面，提供了治疗个体的遗传病症的方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含治疗性蛋白和靶向肽；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂，其中所述核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ IDNO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，所述遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)和慢性肉芽肿病(CGD)。在一些实施方案中，离体处理来自个体的细胞，并且在离体处理之后向所述个体施用所述细胞。
在另外的方面，提供了治疗个体的遗传病症的方法，所述方法包含施用组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含治疗性蛋白；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂，其中所述核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，所述遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)和慢性肉芽肿病(CGD)。在一些实施方案中，离体处理来自个体的细胞，并且在离体处理之后向所述个体施用所述细胞。
在其它方面，提供了治疗个体的遗传病症的方法，所述方法包括施用包含编码融合蛋白的核酸的细胞，所述融合蛋白包含变体IGF2肽和治疗性蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，所述遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)和慢性肉芽肿病(CGD)。在一些实施方案中，细胞来源于个体。
在另外的方面，提供了治疗个体的遗传病症的方法，所述方法包括施用包含编码融合蛋白的核酸的细胞，所述融合蛋白包含信号肽和治疗性蛋白。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，所述遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)和慢性肉芽肿病(CGD)。在一些实施方案中，细胞来源于个体。
在另外的方面，提供了治疗个体的遗传病症的方法，所述方法包括施用包含编码融合蛋白的核酸的细胞，所述融合蛋白包含治疗性蛋白，其中所述核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含脂质体、纳米粒子或细胞穿透肽。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，所述遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)和慢性肉芽肿病(CGD)。在一些实施方案中，细胞来源于个体。
在其它方面，提供了治疗个体的遗传病症的方法，所述方法包括施用包含编码融合蛋白的核酸的细胞，所述融合蛋白包含治疗性蛋白，其中所述核酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。在一些实施方案中，融合蛋白还包含接头。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGSGSGSTS(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白还包含变体IGF2肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含由以下组成的组的至少一种酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酶酸性神经鞘磷脂酶、甲酰基甘氨酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙酰基神经氨糖酸苷酶(唾液酸酶)、神经节苷脂唾液酸酶、磷酸转移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、棕榈酰基蛋白质硫酯酶和其它Batten相关蛋白(例如，蜡样质-脂褐质沉积症神经元蛋白6)，或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含α-葡糖苷酶或其酶促活性片段。在一些实施方案中，治疗性蛋白为N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，缓冲剂或赋形剂适合于基因治疗。在一些实施方案中，适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂包含病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，病毒外壳蛋白选自由以下组成的组：水泡性口炎病毒外壳蛋白、腺病毒外壳蛋白、腺相关病毒外壳蛋白、鼠类白血病病毒外壳蛋白、HIV外壳蛋白和流感病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，所述遗传病症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷症(ADA-SCID)和慢性肉芽肿病(CGD)。在一些实施方案中，细胞来源于个体。
本文还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含原生信号肽、ER蛋白质裂解域、变体IGF2肽和缺乏其原生信号肽的α-葡糖苷酶，其中所述融合蛋白由包含Kozak序列的核酸编码。
本文另外提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽、变体IGF2肽和α-葡糖苷酶，其中所述融合蛋白由包含Kozak序列的核酸编码。
本文另外提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽、变体IGF2肽和缺乏其原生信号肽的α-葡糖苷酶，其中所述融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)的核酸编码。
本文另外提供了一种编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含原生信号肽、ER蛋白质裂解域、变体IGF2肽和缺乏其原生信号肽的α-葡糖苷酶。
本文另外提供了一种编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽、变体IGF2肽和缺乏其原生信号肽的α-葡糖苷酶，其中所述核酸还包含Kozak序列。
本文另外提供了一种编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含变体IGF2肽和α-葡糖苷酶，其中所述核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。
本文另外提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含原生信号肽、ER蛋白质裂解域、变体IGF2肽和缺乏其原生信号肽的α-葡糖苷酶；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。
本文另外提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽、变体IGF2肽和缺乏其原生信号肽的α-葡糖苷酶，其中所述核酸还包含Kozak序列；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。
本文另外提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含变体IGF2肽和α-葡糖苷酶，其中所述核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。
本文另外提供了一种治疗个体的庞培氏病的方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含原生信号肽、ER蛋白质裂解域、变体IGF2肽和缺乏其原生信号肽的α-葡糖苷酶；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。
本文另外提供了一种治疗个体的庞培氏病的方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽、变体IGF2肽和缺乏其原生信号肽的α-葡糖苷酶，其中所述核酸还包含Kozak序列；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。
本文另外提供了一种治疗个体的庞培氏病的方法，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含：(a)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含变体IGF2肽和α-葡糖苷酶，其中所述核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)；和(b)适合于基因治疗的缓冲剂或赋形剂。
本文另外提供了一种治疗个体的庞培氏病的方法，所述方法包括施用包含编码融合蛋白的核酸的细胞，所述融合蛋白包含原生信号肽、ER蛋白质裂解域、变体IGF2肽和缺乏其原生信号肽的α-葡糖苷酶。
本文另外提供了一种治疗个体的庞培氏病的方法，所述方法包括施用包含编码融合蛋白的核酸的细胞，所述融合蛋白包含结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽、变体IGF2肽和α-葡糖苷酶或其酶促活性片段，其中所述核酸还包含Kozak序列。
本文另外提供了一种治疗个体的庞培氏病的方法，所述方法包括施用包含编码融合蛋白的核酸的细胞，所述融合蛋白包含变体IGF2肽和α-葡糖苷酶，其中所述核酸还包含蟋蟀麻痹病毒内部核糖体进入序列(CrPV IRES)。
通过引用并入
本说明书中所提及的所有公开、专利和专利申请均通过引用并入本文中，其引用的程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被特定和单独地指出通过引用并入一般。
附图说明
所述专利申请文件含有至少一个彩色制图。在请求并支付必要费用后，专利局将提供带有彩色图的本专利申请的副本。将参考阐述利用本公开原理的说明性实施方案及其附图的以下详细描述来获得对本公开的特征和优点的理解，在所述附图中：
图1示出具有和不具有M6P的阿葡糖苷酶-αrhGAA的GAA活性。图1示出能够结合CI-MPR的商业ERT的比例。第一峰为缺乏任何含有M6P的聚糖并且因此不能加以吸收并递送至溶酶体的rhGAA。第二峰为含有至少一个磷酸化聚糖并且具有由细胞吸收并递送至溶酶体以进行糖原水解的潜能的级分。
图2示出包括IGF2的不同结合域和单磷酸化和双磷酸化寡糖的CI-MPR的结构。
图3示出成熟的人类IGF2肽的序列和结构。提出位点特异性氨基酸取代以影响其它受体的结合。
图4示出野生型IGF2(wtIGF2)肽对于CI-MPR的结合，如通过表面等离子体共振所测量。
图5示出与CI-MPR结合的变体IGF2(vIGF2)肽的结合，如通过表面等离子体共振所测量。
图6示出将vIGF2添加至葡糖苷酶α以增加与IGF2/CI-MPR结合的益处。
图7示出将vIGF2添加至重组人类N-乙酰基-α-D-葡糖胺酶(rhNAGLU)以增加与IGF2/CI-MPR的结合的益处。
图8示出野生型人类IGF2与胰岛素受体的结合。
图9示出vIGF2与胰岛素受体无可检测的结合。
图10示出野生型IGF2与胰岛素样生长因子1受体的结合。
图11示出与野生型IGF2相比，vIGF2肽与胰岛素样生长因子1受体的结合降低。
图12示出编码天然hGAA和工程化hGAA的基因治疗表达盒的两个实例。天然hGAA的磷酸化较差，导致不良的CIMPR结合和细胞吸收。工程化hGAA具有添加用于改进的CIMPR结合的元件(vIGF2)、降低vIGF2-GAA蛋白与CIMPR的空间位阻的2GS接头和用于改进分泌的BiP信号肽。
图13示出来自表达重组人类PPT1(PPT1-1)、具有vIGF2靶向域的重组人类PPT1(PPT1-2)和具有vIGF2靶向域和BiP信号序列的重组人类PPT1(PPT1-29)的细胞的PPT1的蛋白质印迹。
图14示出PPT1构建体与CI-MPR的结合。
图15示出在表达工程化或天然hGAA的CHO细胞的条件培养基中的GAA活性。
图16示出在GAA基因敲除小鼠中的4周基因治疗小鼠研究的研究设计。
图17示出如所指示未处理的野生型(“正常”)小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠中的GAA血浆活性。
图18示出如所指示未处理的野生型(“正常”)小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠中测量的GAA水平。
图19示出如所指示来自获自经处理小鼠的血浆样本的rhGAA的细胞表面受体结合。
图20示出如所指示未处理的野生型(“正常”)小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的胫前肌的GAA活性和四糖原组织病理学评分。
图21示出如所指示来自未处理的野生型小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的胫前肌的糖原PAS。
图22示出如所指示来自未处理的野生型小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的胫前肌的hGAA免疫组织化学。
图23示出如所指示来自未处理的野生型(“正常”)小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的大脑和脊髓的大脑GAA活性、脑糖原和脊髓糖原的组织病理学评分。
图24示出如所指示来自未处理的野生型小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的大脑的糖原PAS。
图25示出如所指示来自未处理的野生型(“正常”)小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的脑干和脉络丛的hGAA免疫组织化学。
图26示出如所指示来自未处理的野生型小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的脊髓的糖原PAS。
图27示出如所指示来自未处理的野生型小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的脊髓的hGAA免疫组织化学。
图28示出如所指示来自未处理的野生型(“正常”)小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的四头肌GAA活性和糖原组织病理学评分。
图29示出如所指示来自未处理的野生型小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的四头肌的糖原luxol/PAS。
图30示出如所指示来自未处理的野生型小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的四头肌的hGAA免疫组织化学。
图31示出如所指示来自未处理的野生型(“正常”)小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的三头肌GAA活性和组织病理学评分。
图32示出如所指示来自未处理的野生型小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的三头肌的糖原luxol/PAS。
图33示出如所指示来自未处理的野生型小鼠或用基因治疗载体或媒介物处理的GAA基因敲除小鼠的三头肌的hGAA免疫组织化学。
具体实施方式
单一基因遗传病症的基因治疗为疾病和病症提供了潜在的单次治疗，所述疾病和病症中的一些具有可能在生命早期出现并且有时导致终生残疾的破坏性症状。神经遗传病症，例如溶酶体贮积症，通常用酶替代疗法治疗，所述酶替代疗法向患者施用在疾病或病症状态中有缺陷或不足的活性蛋白质形式的治疗性蛋白。然而，当前疗法存在挑战，包括频繁治疗，对治疗性蛋白的免疫反应的发展，和难以将治疗性蛋白靶向受影响的组织、细胞或亚细胞区室。基因治疗提供包括减少治疗次数和持久功效的优势。
本文提供了用于基因治疗载体的组分，所述基因治疗载体为基因治疗提供改进，例如在需要的地方提供更多治疗性蛋白，因此改善了治疗功效。通过改进治疗性蛋白的表达和细胞吸收或递送和胞内或亚细胞靶向，本文解决了此类挑战。本文提供的特定工具或组分包括(但不限于)：用于增加分泌的信号肽(例如，结合免疫球蛋白蛋白(BiP)和Gaussia信号肽)；和增加治疗性蛋白的内吞作用的肽(例如，以高亲和力与CI-MPR结合的肽，以增加细胞吸收和溶酶体递送)。此类肽与由基因治疗载体编码的治疗性蛋白融合。在一些实施方案中，肽为IGF2(胰岛素样生长因子2)肽或其变体。在一些实施方案中，预期本文提供的基因治疗载体包含编码治疗性蛋白的核酸，所述治疗性蛋白与以高亲和力和CI-MPR结合的肽融合以优化基因治疗的功效。
设计用于酶替代基因疗法的基因治疗构建体。翻译起始序列包括(但不限于)位于构建体的5'端处的Kozak序列或IRES序列，例如CrPV IRES；接着是编码GAA信号肽中的一者或多者的信号肽的核酸；编码抗胰蛋白酶抑制剂的核酸；和编码BiP序列的核酸。这些之后接着为编码细胞靶向域的核酸，所述细胞靶向域可为vIGF-2、HIRMab或TfRMab或其它细胞靶向肽或蛋白质。基因治疗构建体还包含编码接头的核酸和编码校正酶或其酶促活性片段的核酸，其中所述接头将细胞靶向域连接至所述校正酶或其酶促活性片段。合适的校正酶包括但不限于α-葡糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、艾杜糖醛酸酶(IDUA)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、PPT1或其酶促活性片段，和在个体中发现不足的其它酶。
治疗性蛋白的胞内靶向
大多数溶酶体蛋白质的N-连接碳水化合物被修饰以含有称为甘露糖6-磷酸(M6P)的特定碳水化合物结构。M6P为使得能够经由膜结合M6P受体将溶酶体蛋白转运至溶酶体的生物学信号。溶酶体贮积症的酶替代疗法使用M6P受体以用于将治疗性蛋白吸收和递送至溶酶体。某些疗法并不利用M6P受体，包括和其它重组人类GCase形式，利用能够结合蛋白质聚糖上的末端甘露糖并递送至溶酶体的甘露糖受体。某些酶替代治疗面临的问题为：少量的M6P存在于酶治疗剂上，而其需要较高剂量来达到治疗功效。这导致基本上较长的输注时间、较高的产生对于治疗剂的免疫反应的概率和较高的药物需求，从而需要增加的蛋白质制造，导致成本增加。
CI-MPR从循环捕获含M6P的溶酶体酶。受体具有针对M6P和胰岛素样生长因子的不同的结合域(域1-3和7-9，参见图2)，并且因此还称为IGF2/甘露糖-6-磷酸受体或IGF2/CI-MPR。这种受体可用于靶向含M6P或IGF2或IGF2变体的酶替代治疗。这种受体针对这些配体(包括胰岛素样生长因子)的结合亲和力提供于表1中。值得注意的是，IGF2肽针对CI-MPR比单磷酸化或双磷酸化寡糖具有更高的结合亲和力。
用于基因治疗的治疗性融合蛋白
本文提供了由基因治疗载体产生的治疗性融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白由用编码融合蛋白的基因治疗载体转导的细胞分泌。在一些实施方案中，被转导的细胞是在组织或器官(例如肝)内。一旦从细胞分泌，融合蛋白经由患者的血管系统转运并且到达相关组织。在一些实施方案中，治疗性融合蛋白被工程化以具有改善的分泌。在一些实施方案中，融合蛋白包含用于相较于对应治疗性蛋白或包含治疗性蛋白但缺乏信号肽的融合蛋白提高分泌水平的信号肽。
在一些实施方案中，所提供的基因治疗载体被工程化以解决伴随基因治疗关于递送治疗性蛋白的问题。例如，在一些情况下，如果将不足量的治疗性蛋白递送到需要治疗性蛋白的细胞中，则由于例如阻碍治疗性蛋白向所需部位的分布的物理和/或生物屏障，基因疗法可能无法仅通过在患者体内产生足够量的治疗性蛋白来实现预期的治疗。因此，即使基因治疗能够用高浓度的治疗性蛋白浸没血液或组织至饱和点，基因治疗也可能不是充分治疗性的。另外，非生产性清除途径可能会除去绝大多数的治疗性蛋白。即使将治疗性蛋白从脉管系统转运至组织(例如肌纤维)内的间隙空间，也不能确保充分的治疗效果。为了有效地治疗溶酶体贮积症，必须对治疗有效量的治疗性蛋白进行细胞内吞和溶酶体递送以产生有意义的功效。本公开通过提供编码融合蛋白的基因治疗载体来解决这些问题，所述融合蛋白包含能够使治疗性蛋白内吞到治疗靶细胞中以产生有效治疗的肽。在一些实施方案中，能够进行内吞作用的肽为结合CI-MPR的肽。在一些实施方案中，结合CI-MPR的肽为vIGF2肽。
本文提供了编码融合蛋白的基因治疗载体，所述融合蛋白包含能够使治疗性蛋白内吞至治疗靶细胞中的肽。在一些实施方案中，基因治疗载体编码包含治疗性蛋白和结合CI-MPR的肽的融合蛋白。这些融合蛋白当由基因治疗载体表达时，将治疗性蛋白(例如酶替代治疗剂)靶向至需要其的细胞，增加了向这些细胞中的递送或这些细胞的细胞吸收，并且将治疗性蛋白靶向至亚细胞位置(例如溶酶体)。在一些实施方案中，肽为IGF2肽或其变体，其可将治疗性蛋白靶向至溶酶体。此外，在一些实施方案中，本文中的融合蛋白还包含增加分泌的信号肽，例如BiP信号肽或Gaussia信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含接头序列。在一些实施方案中，编码本文中的融合蛋白的核酸包含内部核糖体进入序列。
本文提供了用于基因治疗的治疗性蛋白，其包含vIGF2肽。示例性蛋白提供于下表2中。
本文提供的融合蛋白的组分在下文进一步描述。
结合CI-MPR的肽(例如，vIGF2肽)
本文提供了结合CI-MPR的肽。包含这些肽和治疗性蛋白的融合蛋白当由基因治疗载体表达时，将治疗性蛋白靶向至需要其的细胞，增加了这些细胞的细胞吸收，并且将治疗性蛋白靶向至亚细胞位置(例如溶酶体)。在一些实施方案中，肽与治疗性肽的N末端融合。在一些实施方案中，肽与治疗性蛋白的C末端融合。在一些实施方案中，肽为vIGF2肽。一些vIGF2肽维持与CI-MPR的高亲和力结合，而其针对IGF1受体、胰岛素受体和IGF结合蛋白(IGFBP)的亲和力降低或消除。因此，相较于wt IGF2，一些变体IGF2肽基本上更具选择性并且具有降低的安全性风险。本文中的vIGF2肽包括具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的那些肽。变体IGF2肽还包括在位置6、26、27、43、48、49、50、54、55或65处相较于wt IGF2(SEQ IDNO:1)具有变体氨基酸的那些肽。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有来自由以下组成的组的一个或多个取代的序列：E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R和K65R。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有E6R取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有F26S取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有Y27L取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有V43L取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有F48T取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有R49S取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有S50I取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有A54R取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有L55R取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有K65R取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有带有E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R和L55R取代的序列。在一些实施方案中，vIGF2肽具有N端缺失。在一些实施方案中，vIGF2肽具有一个氨基酸的N端缺失。在一些实施方案中，vIGF2肽具有两个氨基酸的N端缺失。在一些实施方案中，vIGF2肽具有三个氨基酸的N端缺失。在一些实施方案中，vIGF2肽具有四个氨基酸的N端缺失。在一些实施方案中，vIGF2肽具有四个氨基酸的N端缺失以及E6R、Y27L和K65R的取代。在一些实施方案中，vIGF2肽具有四个氨基酸的N端缺失以及E6R和Y27L的取代。在一些实施方案中，vIGF2肽具有五个氨基酸的N端缺失。在一些实施方案中，vIGF2肽具有六个氨基酸的N端缺失。在一些实施方案中，vIGF2肽具有七个氨基酸的N端缺失。在一些实施方案中，vIGF2肽具有七个氨基酸的N端缺失以及Y27L和K65R的取代。
内部核糖体进入序列
本文提供了可用于治疗病症的基因治疗构建体，所述基因治疗构建体还包含用于通过绕过翻译起始的瓶颈而增加基因表达的内部核糖体进入序列(IRES)。用于优化基因治疗表达的合适的内部核糖体进入序列包括(但不限于)蟋蟀麻痹病毒(CrPV)IRES、小核糖核酸病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、卡波西肉瘤相关疱疹病毒IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、蟋蟀麻痹病毒属IRES、禾谷缢管蚜病毒IRES、梅雷克病病毒IRES和其它合适的IRES序列。在一些实施方案中，基因治疗构建体包含CrPV IRES。在一些实施方案中，CrPV IRES具有以下核酸序列：AAAAATGTGATCTTGCTTGTAAATACAATTTTGAGAGGTTAATAAATTACAAGTAGTGCTATTTTTGTATTTAGGTTAGCTATTTAGCTTTACGTTCCAGGATGCCTAGTGGCAGCCCCACAATATCCAGGAAGCCCTCTCTGCGGTTTTTCAGATTAGGTAGTCGAAAAACCTAAGAAATTTACCTGCT(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，CrPV IRES序列与SEQ ID NO:12具至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
信号肽
在一些实施方案中，本文提供的基因治疗构建体还包含信号肽，所述信号肽改善了治疗性蛋白从用基因治疗构建体转导的细胞的分泌。在一些实施方案中，信号肽改善了治疗性蛋白的蛋白质加工，并且有助于初生多肽-核糖体复合物易位至ER，并且确保适当的共翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，信号肽位于(i)信号翻译起始序列的上游位置，(ii)翻译起始序列与治疗性蛋白之间，或(iii)治疗性蛋白的下游位置。可用于基因治疗构建体的信号肽包括(但不限于)来自HSP70蛋白质家族(例如，HSPA5，热休克蛋白家族A成员5)的结合免疫球蛋白蛋白(BiP)信号肽和Gaussia信号肽，及其变体。这些信号肽对于信号识别粒子具有超高亲和力。BiP和Gaussia氨基酸序列的实例提供于下表5中。在一些实施方案中，信号肽具有与选自由SEQ ID No:13-17组成的组的序列具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽与选自由SEQ ID No:13-17组成的组的序列相差5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸。
BiP信号肽-信号识别粒子(SRP)相互作用促进易位至ER。这种相互作用在图20中说明。
Gaussia信号肽来源于海洋桡脚类动物(Gaussia princeps)荧光素酶，并且引导与这种信号肽融合的治疗性蛋白的蛋白质合成和分泌增加。在一些实施方案中，Gaussia信号肽具有与SEQ ID NO:32具至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽与SEQ ID NO:32相差5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸。
接头
在一些实施方案中，本文提供的基因治疗构建体包含在靶向肽与治疗性蛋白之间的接头。在一些实施方案中，这些接头维持适当间距并减少vIGF2肽与治疗性蛋白之间的空间对撞。在一些实施方案中，接头包含重复甘氨酸残基、重复甘氨酸-丝氨酸残基，及其组合。在一些实施方案中，接头由5-20个氨基酸、5-15个氨基酸、5-10个氨基酸、8-12个氨基酸、或约5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸组成。本文中的基因治疗构建体的合适接头包括(但不限于)下表6中提供的那些。
翻译起始序列
本文提供的基因治疗构建体包含具有翻译起始序列(例如Kozak序列，其有助于起始mRNA的翻译)的核酸。本文中涵盖的Kozak序列具有(gcc)RccATGG(SEQ ID NO:27)的共同序列，其中小写字母表示在所述位置处的最常见碱基并且碱基变化，大写字母指示仅极少变化的高度保守碱基。R指示在所述位置处始终观测到的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)。圆括号中的序列(gcc)具有不明意义。在一些实施方案中，Kozak序列包含序列AX1X2ATGA(SEQ ID NO:28)，其中X1和X2中的每一者为任何核苷酸。在一些实施方案中，X1包含A。在一些实施方案中，X2包含G。在一些实施方案中，Kozak序列包含与AAGATGA(SEQ ID NO:29)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与AAGATGA(SEQ ID NO:29)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的Kozak序列具有AAGATGA(SEQ ID NO:29)的序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与GCAAGATG(SEQ ID NO:44)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含GCAAGATG(SEQ ID NO:44)。在一些实施方案中，Kozak序列包含与CACCATG(SEQ ID NO:47)具至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列与CACCATG(SEQ ID NO:47)的序列相差一个或两个核苷酸。在一些实施方案中，Kozak序列包含CACCATG(SEQ ID NO:47)。
治疗性蛋白
本文提供的基因治疗构建体包含编码治疗性蛋白的核酸，所述治疗性蛋白是用于治疗因个体中的遗传缺陷造成不存在蛋白质或缺陷蛋白质所致的遗传病症。从基因治疗构建体所表达的治疗性蛋白来替代不存在蛋白质或缺陷蛋白质。因此，基于个体中需要治疗的遗传缺陷，选择治疗性蛋白。在一些实施方案中，治疗性蛋白为结构蛋白。在一些实施方案中，治疗性蛋白为酶。在一些实施方案中，治疗性蛋白为调节蛋白。在一些实施方案中，治疗性蛋白为受体。在一些实施方案中，治疗性蛋白为肽激素。在一些实施方案中，治疗性蛋白为细胞因子或趋化因子。
在一些实施方案中，本文中的基因治疗构建体可编码酶，例如在患有溶酶体贮积症的个体中具有遗传缺陷的酶。在一些实施方案中，基因治疗构建体编码溶酶体酶，例如糖苷酶、蛋白酶或硫酸酯酶。在一些实施方案中，由本文提供的基因治疗构建体编码的酶包括(但不限于)：α-D-甘露糖苷酶；N-天冬氨酰基-β-氨基葡糖苷酶；β-半乳糖苷酶；神经酰胺酶；岩藻糖苷酶；半乳糖脑苷脂酶；芳基硫酸酯酶A；N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸转移酶；艾杜糖醛酸硫酸酯酶；N-乙酰基氨基葡糖苷酶；乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶；N-乙酰基葡糖胺6-硫酸酯酶；β-葡糖醛酸酶；玻尿酸酶；唾液酸酶；硫酸酯酶；神经鞘磷脂酶；酸性β-甘露糖苷酶；组织蛋白酶K；3-己糖苷酶A；β-己糖苷酶B；α-N-乙酰基半乳糖胺酶；唾液酸转运蛋白(sialin)；己糖苷酶A；β-葡糖苷酶；α-艾杜糖醛酸酶；α-半乳糖苷酶A；β-葡糖脑苷脂酶；溶酶体酸性脂肪酶；葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶；艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸酯酶；葡糖胺聚糖N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯酶；α-葡糖苷酶；乙酰肝素硫酸酰胺酶；NADPH氧化酶的gp-91次单元；腺苷脱氨酶；细胞周期素依赖性激酶样5；和棕榈酰基蛋白质硫酯酶1。在一些实施方案中，由本文提供的基因治疗构建体编码的酶包含α-葡糖苷酶。在一些实施方案中，治疗性蛋白与选自由以下组成的组的遗传病症相关联：CDKL5缺乏症、囊肿性纤维化、α-地中海型贫血和β-地中海型贫血、镰状细胞贫血、马凡氏综合征、脆性X综合征、亨廷顿氏病、血色素沉着病、先天性耳聋(非综合征性)、塔伊-萨克斯病、家族性高胆固醇血症、杜氏肌营养不良、斯特格氏病、尤塞氏综合征、无脉络膜症、色盲、X性联视网膜劈裂症、血友病、韦-奥氏综合征、X性联慢性肉芽肿病、芳族L-氨基酸脱羧酶缺乏症、隐性营养不良大疱性表皮松解、α1抗胰蛋白酶缺乏症、哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)、努南综合征、X性联重度联合免疫缺陷症(X-SCID)。在一些实施方案中，治疗性蛋白选自由以下组成的组：CDKL5、连接蛋白26、己糖苷酶A、LDL受体、抗肌萎缩蛋白、CFTR、β-球蛋白、HFE、亨廷顿蛋白、ABCA4、肌球蛋白VIIA(MYO7A)、Rab护送蛋白-1(REP1)、环状核苷酸闸控通道β3(CNGB3)、视网膜劈裂素1(RS1)、血红素次单元β(HBB)、因子IX、WAS、细胞色素B-245β链、多巴脱羧酶(DDC)、VII型胶原蛋白α1链(COL7A1)、丝氨酸蛋白酶抑制因子家族A成员1(SERPINA1)、LMNA、PTPN11、SOS1、RAF1、KRAS和IL2受体γ基因。
基因治疗载体实例
基因治疗载体和组合物
本文提供了基因治疗载体，其中编码治疗性融合蛋白(例如vIGF2融合体)的核酸(例如DNA)任选地具有信号肽。所述基因治疗载体任选地包含内部核糖体进入序列。来源于逆转录病毒(例如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，这是由于它们允许长期稳定整合转基因及其在子细胞中的增殖。慢病毒和腺相关病毒载体具有优于来源于致癌逆转录病毒的载体的额外优点，所述致癌逆转录病毒例如鼠类白血病病毒，其中它们能够转导非增殖细胞，例如肝细胞和神经元。它们还具有低免疫原性的额外优点。
本文中的示例性基因治疗载体编码治疗性蛋白和包含vIGF2肽的治疗性融合蛋白。编码示例性融合蛋白氨基酸序列的核酸提供于下表7中。
在一些实施方案中，本文提供的包含编码所需治疗性融合蛋白(例如vIGF2融合体或信号肽融合体)，任选地具有内部核糖体进入序列的核酸的载体，为腺相关病毒载体(A5/35)。
在一些实施方案中，将编码治疗性融合蛋白(例如vIGF2融合体)并任选地具有内部核糖体进入序列的核酸克隆到多种类型的载体中。例如，在一些实施方案中，将核酸克隆到载体中，所述载体包括(但不限于)质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和黏粒。尤其受关注的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，在一些实施方案中，将编码所需治疗性融合蛋白(例如vIGF2融合体或信号肽融合体)并任选地具有内部核糖体进入序列的表达载体以病毒载体形式提供至细胞。病毒载体技术描述于例如Sambrook等,2012,Molecular Cloning:A Laborator y Manual,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)和其它病毒学与分子生物学手册中。适用作载体的病毒包括(但不限于)逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点，启动子序列，适宜的限制性核酸内切酶位点，和一种或多种可选标记物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
本文还提供了用于基因转移的组合物和系统。已针对基因转移至哺乳动物细胞中开发出多个基于病毒的系统。例如，逆转录病毒提供基因传递系统的适宜平台。在一些实施方案中，使用合适的技术将所选择基因插入至载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后分离重组病毒并且体内或离体递送至个体的细胞中。多种逆转录病毒系统适合于基因治疗。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。多种腺病毒载体适合于基因治疗。在一些实施方案中，使用腺相关病毒载体。多种腺相关病毒适合于基因治疗。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
本文提供的基因治疗构建体包含载体(或基因治疗表达载体)，其中将相关基因克隆到所述载体中，或者所述载体以使得载体的核苷酸序列允许表达(组成性表达或者以某种方式调节)相关基因的方式包括相关基因。本文提供的载体构建体包括能够递送至相关组织并且将在所选择的相关组织中提供表达相关基因的任何合适的基因表达载体。
在一些实施方案中，载体为腺相关病毒(AAV)载体，这是由于AAV载体跨越血脑屏障和转导神经元组织的能力。在本文提供的方法中，考虑使用任何血清型的AAV。在某些实施方案中，所使用的血清型的病毒载体选自由以下组成的组：AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAVrhS载体、AAVrh10载体、AAVrh33载体、AAVrh34载体、AAVrh74载体、AAV Anc80载体、AAVPHP.B载体、AAVhu68载体、AAV-DJ载体和适合于基因治疗的其它载体。
AAV载体是对于哺乳动物为非病原性的DNA细小病毒。简言之，基于AAV的载体去除了代表病毒基因组96％的rep和cap病毒基因，留下了用于起始病毒DNA复制、包装和整合的两个侧翼145个碱基对的反向末端重复序列(ITR)。
其它实施方案包括使用其它血清型衣壳以产生：AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAVrhS载体、AAVrh10载体、AAVrh33载体、AAVrh34载体、AAVrh74载体、AAV Anc80载体、AAVPHP.B载体、AAV-DJ载体和适合于基因治疗的其它载体。任选地，AAV病毒衣壳为AAV2/9、AAV9、AAVrhS、AAVr h10、AAVAnc80或AAV PHP.B。
额外启动子元件(例如增强子)调节转录起始频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp区中，尽管已显示许多启动子还在起始位点下游含有功能元件。启动子元件之间的间距通常为柔性的，使得当元件倒置或相对于彼此移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距在活性开始下降之前通常增加至相隔50bp。取决于启动子，单独的元件看起来合作地或独立地起活化转录功能。
能够表达治疗性融合蛋白(例如vIGF2融合体或信号肽融合体)并任选地具有内部核糖体进入序列、哺乳动物T细胞中的转基因的启动子的实例为EF1a启动子。原生EF1a启动子驱动延长因子-1复合物的α次单元的表达，所述复合物负责将氨基酰基tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已在哺乳动物表达中广泛使用，并且已显示在驱动从克隆到慢病毒载体中的转基因表达中有效(参见例如Milone等,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009))。启动子的另一实例为立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这种启动子序列为强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，有时还可使用其它组成型启动子序列，包括(但不限于)鸡β肌动蛋白启动子、P546启动子、猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺乏病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)立即早期启动子、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒启动子，以及人类基因启动子，例如(但不限于)肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延长因子-1a启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。此外，预期基因治疗载体不限于使用组成型启动子。此处还涵盖诱导性启动子。诱导性启动子的使用提供分子开关，所述分子开关能够在需要这种表达时开启其可操作地连接的多核苷酸序列的表达或在不需要表达时关闭表达。诱导性启动子的实例包括(但不限于)金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调节启动子。
为了评估任选地具有内部核糖体进入序列或其部分的治疗性融合蛋白(例如vIGF融合体或信号肽融合体)的表达，待引入至细胞中的表达载体通常含有可选标记基因或报道基因或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可选标记物通常携载于独立DNA段上并且用于共转染程序。可选标记物与报道基因有时侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。可用的可选标记物包括例如耐抗生素基因，例如neo等。
用于引入至细胞中和表达基因的方法和组合物适合于本文中的方法。在表达载体的情形下，载体通过本领域中的任何方法容易地引入至宿主细胞(例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞)中。例如，通过物理、化学或生物方式，将表达载体转移至宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法和组合物包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、基因枪、电穿孔等。用于制造包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法适合于本文中的方法(参见例如Sambrook等,2012,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)。将多核苷酸引入宿主细胞中的一种方法为磷酸钙转染。
将多核苷酸引入宿主细胞中的化学方式和组合物包括胶态分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、微胞、混合微胞、核酸-脂质粒子和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶态系统为脂质体(例如人工膜泡)。可获得目前先进技术中靶向递送核酸的其它方法，例如用靶向纳米粒子或其它合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物为脂质体。涵盖脂质制剂的使用，以用于将核酸引入至宿主细胞(体外、离体或体内)中。在另一方面，核酸与脂质缔合。在一些实施方案中，与脂质缔合的核酸囊封于脂质体的水性内部中，穿插于脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸缔合的连接分子与脂质体连接，包覆于脂质体中，与脂质体复合，分散于含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式含于脂质中，含于微胞或与微胞复合，或以其它方式与脂质缔合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，在一些实施方案中，它们存在于双层结构中，以微胞形式存在或具有“塌陷”结构。替代地，它们可简单地穿插于溶液中，可能形成大小或形状上不均匀的聚集体。脂质为脂肪物质，其在一些实施方案中为天然存在或合成脂质。例如，脂质包括细胞质中天然存在的脂肪液滴以及含有长链脂族烃及其衍生物的化合物类别(例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)。
适用的脂质是获自商业来源。例如，在一些实施方案中，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)是获自Sigma,St.Louis,Mo.；在一些实施方案中，磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)是获自K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)；在一些实施方案中，胆固醇(“Choi”)是获自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质通常获自Avanti PolarLipids,Inc.(Birmingham,Ala.)。脂质于氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液通常储存在约-20℃。氯仿用作唯一溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”为通用术语，其涵盖通过产生经包封的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征通常为具有囊泡结构，其具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有通过水性介质分隔开的多个脂质层。它们在磷脂悬浮于过量水溶液中时自发地形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自身重排，并且在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等,1991Glycobiology5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，在一些实施方案中，脂质呈现微胞结构或仅以脂质分子的非均匀聚集体形式存在。还涵盖脂染胺-核酸复合物。
不管用于将外源性核酸引入宿主细胞中或者将细胞暴露于本文提供的任选地具有内部核糖体进入序列的治疗性融合蛋白(例如vIGF2融合体或信号肽融合体)的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，考虑进行各种测定法。这样的测定法包括例如适合于本文中的方法的“分子生物学”测定法，例如Southern和Northern印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定法，例如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方式(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所描述的测定法来鉴定落在本文范围内的试剂。
本公开还提供了一种载体，所述载体包含治疗性融合蛋白(例如vIGF2融合体或信号肽融合体)，任选地具有内部核糖体进入序列，编码核酸分子。在一个方面，治疗性融合蛋白载体能够直接转导至细胞中。在一个方面，载体为克隆或表达载体，例如包括(但不限于)以下的载体：一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆载体、微环、微载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物细胞中表达vIGF2-治疗性融合蛋白构建体。在一个方面，哺乳动物细胞为人类细胞。
用途和治疗方法
本文还提供了使用基因治疗来治疗遗传病症的方法，所述方法包括向个体施用本文所公开的编码治疗性融合蛋白(例如vIGF2融合体或信号肽融合体或信号肽-vIGF2融合体)并任选地具有内部核糖体进入序列的核酸。适合于使用本文方法进行治疗的遗传病症包括个体中由基因组中的一个或多个突变引起的病症，所述一个或多个突变引起缺乏表达蛋白质或由突变型基因表达功能异常蛋白质。
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物包含基因治疗载体，例如包含本文所公开的编码治疗性融合蛋白(例如vIGF2融合体或信号肽融合体或信号肽-vIGF2融合体)并任选地具有内部核糖体进入序列的核酸的基因治疗载体，和药学上可接受的载体或赋形剂，以用于制备用于治疗遗传病症的药物。
适合于通过本文中的方法治疗的遗传病症包括(但不限于)：软骨发育不全、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、抗磷脂综合征、常染色体显性多囊性肾病、恰克-马里-杜斯病(Charcot-Marie-Tooth)、结肠癌、猫叫综合征(Cri du chat)、克罗恩病(Crohn's Disease)、囊肿性纤维化、德尔肯病(Dercum Disease)、杜恩综合征(Duane Syndrome)、杜氏肌营养不良、因子V莱顿易栓病(Factor V Leiden Thrombophilia)、家族性高胆固醇血症、家族性地中海热、脆性X综合征、戈谢病、血色素沉着病、血友病、前脑无裂畸形、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、克氏综合征(Klinefelter syndrome)、马凡氏综合征、肌紧张性营养障碍、神经纤维瘤、努南综合征、成骨不全、帕金森氏病(Parkinson's disease)、苯酮尿症、波兰异常(Poland Anomaly)、卟啉症、早老症、色素性视网膜炎、重度联合免疫缺陷症(SCID)、镰状细胞疾病、脊髓性肌萎缩、泰-萨克斯病、地中海贫血、三甲基胺尿症、特纳综合征(TurnerSyndrome)、颚心脸综合征、WAGR综合征或威尔逊病(Wilson Disease)。在一些实施方案中，遗传病症选自由以下组成的组：CDKL5缺乏症、囊肿性纤维化、α-地中海型贫血和β-地中海型贫血、镰状细胞贫血、马凡氏综合征、脆性X综合征、亨廷顿氏病、血色素沉着病、先天性耳聋(非综合征性)、塔伊-萨克斯病、家族性高胆固醇血症、杜氏肌营养不良、斯特格氏病、尤塞氏综合征、无脉络膜症、色盲、X性联视网膜劈裂症、血友病、韦-奥氏综合征、X性联慢性肉芽肿病、芳族L-氨基酸脱羧酶缺乏症、隐性营养不良大疱性表皮松解、α1抗胰蛋白酶缺乏症、哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)、努南综合征、X性联重度联合免疫缺陷症(X-SCID)。
在一些实施方案中，适合于使用本文提供的方法治疗的遗传病症为溶酶体贮积症。在一些实施方案中，本文中使用基因治疗递送缺失或缺陷酶至患者来治疗溶酶体贮积症。在一些实施方案中，本文中的方法将与vIGF2融合或与信号肽融合的酶递送至患者，以便将酶递送至需要其的细胞中。在一些实施方案中，溶酶体贮积症选自由以下组成的组：天冬氨酰葡糖胺尿症、巴腾病、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病、II型戈谢病、III型戈谢病、庞培氏病、泰-萨克斯病、桑多霍夫病、异染性脑白质营养不良、I型黏脂贮积症、II型黏脂贮积症、III型黏脂贮积症、IV型黏脂贮积症、贺勒病、亨特病、A型圣菲利波病、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、马罗托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病和II型辛德勒病。在一些实施方案中，溶酶体贮积症选自由以下组成的组：活化因子缺乏症、GM2-神经节苷脂贮积病；GM2-神经节苷脂贮积病、AB变型；α-甘露糖苷贮积病(2型，中度形式；3型，新生儿，重度)；β-甘露糖苷贮积病；天冬氨酰葡糖胺尿症；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；胱氨酸病(晚发性幼年型或青年肾病类型；婴儿肾病性)；钱林-多尔夫曼综合征；伴随肌病的中性脂贮积病；NLSDM；达农病(Danon disease)；法布里病；晚期发作II型法布里病；法伯病；法伯脂肪肉芽肿病；岩藻糖苷贮积症；半乳糖唾液酸贮积症(合并神经氨糖酸苷酶和β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈谢病；II型戈谢病；III型戈谢病；IIIC型戈谢病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致的非典型戈谢病；GM1-神经节苷脂贮积病(晚期婴儿型/幼年型GM1-神经节苷脂贮积病；成人/慢性GM1-神经节苷脂贮积病)；球状细胞脑白质营养不良、克拉培病(晚发性婴儿型；幼年发作型；成年发作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致的非典型克拉培病；异染性脑白质营养不良(幼年型；成人)；部分硫酸脑苷脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致的异染性脑白质营养不良；粘多糖贮积症：MPS I、贺勒综合征；MPS I、贺勒-沙伊综合征；MPS I、沙伊综合征；MPS II、亨特综合征；MPS II、亨特综合征；A型圣菲利波综合征/MPS IIIA；B型圣菲利波综合征/MPS IIIB；C型圣菲利波综合征/MPS IIIC；D型圣菲利波综合征/MPS IIID；莫奎综合征、A型/MPS IVA；莫奎综合征、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI马洛特-拉米综合征；MPS VII斯利综合征；黏脂贮积症I、II型唾液腺病；I-细胞病、勒罗伊病、黏脂贮积症II；假贺勒多营养不良/III型黏脂贮积症；黏脂贮积症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂贮积症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神经疾病形式；C2型；D型/Nova Scotian型)；神经元蜡样质脂褐质沉积症：CLN6病，非典型晚期婴儿型、晚发作变型、早幼年型；巴斯沃三氏/幼年型NCL/CLN3病；芬兰变型晚期婴儿型CLN5；詹斯基-比尔朔夫斯基病/晚期婴儿型CLN2/TPP1病；库夫斯/成年发作型NCL/CLN4病(B型)；北方癫痫症/变型晚期婴儿型CLN8；桑塔沃里-哈尔蒂亚/婴儿型CLN1/PPT病；庞培氏病(II型糖原贮积病)；晚发型庞培氏病；密骨发育障碍；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；桑多霍夫病/GM2神经节苷脂贮积病；辛德勒病(III型/中度，可变)；神琦病；萨拉病；婴儿型无唾液酸贮积病(ISSD)；伴随进展性肌痉挛癫痫症的脊髓性肌萎缩(SMAPME)；泰-萨克斯病/GM2神经节苷脂贮积病；幼发型泰-萨克斯病；晚发型泰-萨克斯病；克里斯蒂安综合征；劳威眼-脑-肾综合征；4J型恰克-马里-杜斯病，CMT4J；尤里斯-凡伦综合征；双侧颞枕多小脑回(BTOP)；X性联高钙性肾石病、登特-1；和登特病2。在一些实施方案中，治疗性蛋白与溶酶体贮积症相关联，并且治疗性蛋白选自由以下组成的组：GM2-活化因子蛋白质；α-甘露糖苷酶；MAN2B1；溶酶体β-甘露糖苷酶；糖基天冬酰胺酶；溶酶体酸性脂肪酶；胱氨酸转运蛋白(cystinosin)；CTNS；PNPLA2；溶酶体相关膜蛋白-2；α-半乳糖苷酶A；GLA；酸性神经酰胺酶；α-L-岩藻糖苷酶；保护性蛋白质/组织蛋白酶A；酸性β-葡糖苷酶；GBA；PSAP；β-半乳糖苷酶-1；GLB1；半乳糖苷基神经酰胺β-半乳糖苷酶；GALC；PSAP；芳基硫酸酯酶A；ARSA；α-L-艾杜糖醛酸酶；艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶；乙酰肝素N-硫酸酯酶；N-α-乙酰基氨基葡糖苷酶；乙酰肝素乙酰CoA:α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶；N-乙酰基葡糖胺6-硫酸酯酶；半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶；β-半乳糖苷酶；玻尿酸酶；芳基硫酸酯酶B；β-葡糖醛酸酶；神经氨糖酸苷酶；NEU1；N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸转移酶的γ次单元；mucolipin-1；硫酸酯酶修饰因子-1；酸性神经鞘磷脂酶；SMPD1；NPC1；和NPC2。
在一些实施方案中，经由本文中的方法的治疗将编码治疗性蛋白的基因递送至需要治疗性蛋白的细胞中。在一些实施方案中，治疗将基因递送至个体中的所有体细胞中。在一些实施方案中，治疗替代靶向细胞中的缺陷基因。在一些实施方案中，将离体治疗以表达治疗性蛋白的细胞递送至个体。
用于本文所公开的病症的基因治疗提供优于常规治疗，包括酶替代疗法的治疗结果，因为其不需要长期输注治疗。另外，它降低了个体对治疗性蛋白产生免疫反应的风险，这在接受酶替代疗法的个体中经常发生。
定义
如本文所用，“离体基因治疗”是指其中患者细胞在受试者外部被基因修饰以例如表达治疗性基因的方法。具有新遗传信息的细胞然后返回至其来源的受试者。
如本文所用，“体内基因治疗”是指其中直接向受试者施用携带治疗性基因的载体的方法。
如本文所用，“融合蛋白”和“治疗性融合蛋白”在本文中可互换使用，并且是指具有与其连接的至少一个额外蛋白质、肽或多肽的治疗性蛋白。在一些情况下，融合蛋白为含有两个或更多个蛋白质或其片段的单一蛋白质分子，所述两个或更多个蛋白质或其片段经由其相应肽链内的肽键而无化学接头下共价连接。在一些实施方案中，融合蛋白包含治疗性蛋白和信号肽(一种增加融合蛋白的内吞作用的肽)或两者。在一些实施方案中，增加内吞作用的肽为结合CI-MPR的肽。
如本文所用，在本文中可互换使用的“载体”或“基因治疗载体”，是指将治疗性基因递送至细胞的基因治疗递送媒介物或载体。基因治疗载体为适用于基因治疗的任何载体，例如适合于将核酸聚合物(编码多肽或其变体)治疗性递送至患者的靶细胞(例如，感觉神经元)中的任何载体。在一些实施方案中，基因治疗载体将编码治疗性蛋白或治疗性融合蛋白的核酸递送至表达治疗性蛋白或融合体并且从细胞分泌的细胞。载体可具有任何类型，例如其可为质粒载体或小环DNA。通常，载体为病毒载体。这些包括基因失能病毒(例如腺病毒)载体和非病毒载体(例如脂质体)两者。病毒载体可例如衍生自腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或腺病毒。AAV源性载体。载体可包含AAV基因组或其衍生物。
如本文所用，“构建体”是指编码治疗性蛋白或融合蛋白并且任选地包含额外序列(例如翻译起始序列或IRES序列)的核酸分子或序列。
如本文所用，“质粒”是指在细胞内独立于染色体DNA进行复制的环状双链DNA单元。
如本文所用，“启动子”是指DNA上与酶RNA聚合酶结合并且起始DNA转录为RNA的位点。
如本文所用，“体细胞疗法”是指其中操纵将对于患者为校正性而非遗传至下一代的细胞中的基因表达的方法。体细胞包括人体中的所有非生殖细胞。
如本文所用，“体细胞”是指除生殖细胞外的所有身体细胞。
如本文所用，“趋向性”是指载体(例如病毒)对于某一细胞或组织类型的偏好。各种因素决定载体感染特定细胞的能力。病毒例如必须与特定细胞表面受体结合以进入细胞。如果细胞不表达必需受体，则病毒通常不能感染细胞。
术语“转导”用于指，经由本公开的复制缺陷型rAAV，向靶细胞体内或体外施用/递送编码治疗性蛋白的核酸，从而引起接受细胞表达功能性多肽。用本公开的基因治疗载体(例如rAAV)转导细胞，导致由rAAV编码的多肽或RNA的持续表达。因此，本公开提供了通过鞘内、视网膜内、眼内、玻璃体内、脑室内、脑实质内或静脉内途径或其任何组合，向受试者施用/递送编码治疗性蛋白的基因治疗载体(例如rAAV)的方法。“鞘内”递送是指递送至大脑或脊髓的蜘蛛膜下的空间中。在一些实施方案中，鞘内施用是经由脑池内施用。
术语“接受者”、“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且在一些情况下，是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人类。出于治疗的目的的“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家养动物和农畜，以及实验室、动物园、体育或宠物动物，例如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、猴等。在一些实施方案中，哺乳动物为人类。
如本文所用，在一些情况下，术语“治疗(treatment/treating)”、“改善症状”等，是指出于以统计学上显著方式或以临床上显著方式获得治疗效果(包括抑制、缓解、降低、预防或改变病症的至少一个方面或标志物)的目的，施用药剂或进行程序。术语“改善”或“治疗”不表明或暗示治愈潜在疾患。如本文所用，“治疗”或“改善”(等)可包括治疗哺乳动物，特别是人类，并且包括：(a)预防病症或病症的症状在可能易患所述病症但尚未诊断患病(例如，包括可能与原发性病症相关联或由其引起的病症)的受试者中发生；(b)抑制病症，即遏制其发展；(c)减轻病症，即引起病症消退；和(d)改善病症的至少一个症状。治疗可指在治疗或改善或预防病症中的任何成功指标，包括任何客观或主观参数，例如消除；缓解；减弱症状或使病症状态对于患者为更可容忍的；减缓退化或衰退的速率；或使退化的最终点不太衰弱。治疗或改善症状是基于一个或多个客观或主观参数；包括通过医师检查的结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物或药剂以预防或延迟、减轻或遏制或抑制与病症相关的症状或疾患的发展。术语“治疗效果”是指减少、消除或预防受试者的病症、病症的症状或病症的副作用。
术语“亲和力”是指分子与其结合搭配物或受体之间的结合强度。
如本文所用，短语“高亲和力”是指例如含有结合CI-MPR的这种肽的治疗性融合体，所述治疗性融合体与CI-MPR的亲和力为无所述肽的治疗性蛋白的约100至1,000倍或500至1,000倍。在一些实施方案中，所述亲和力为无所述肽情况下的至少100、至少500或至少1000倍。例如，当治疗性蛋白和CI-MPR以相对相等浓度组合时，具有高亲和力的肽将与可获得的CI-MPR结合以便使平衡朝向高浓度的所得复合物偏移。
如本文所用，“分泌”是指蛋白质从细胞释放至例如待运载至相关组织或治疗性蛋白作用部位的血流中。当基因治疗产物分泌至器官的间隙空间中时，分泌可允许邻近细胞的交叉校正。
如本文所用，“递送”意谓药物递送。在一些实施方案中，递送过程意指将药物物质(例如，由基因治疗载体产生的治疗性蛋白或融合蛋白)从细胞外部(例如，血液、组织或间隙空间)转运至药物物质的治疗活性的靶细胞中。
如本文所用，“工程化”或“蛋白质工程化”是指通过提供编码蛋白质的适当核酸序列操纵蛋白质的结构以便产生所需特性或具有特定结构的蛋白质的合成。
在一些情况下，“治疗有效量”意指当向受试者施用以用于治疗病症时，足以实现对所述病症的治疗的量。
如本文所用，术语“约”某数字是指跨越小于所述数目的10％至大于所述数目的10％，并且包括范围内的值(例如数字本身)的范围。
如本文所用，术语“包含”权利要求的一个或多个要素是指那些要素但不排除包括额外的一个或多个要素。
实施例
以下实施例出于说明本发明的各种实施方案的目的给出并且不打算以任何方式限制本发明。所述实施例连同本文中所描述的方法目前为优选实施方案的代表，为示例性的并且不打算作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到涵盖在本发明的精神范围内的如由权利要求的范围所限定的其中的变化和其它用途。
实施例1：变体IGF2肽与CI-MPR受体的结合
使用Biacore进行表面等离子体共振(SPR)实验以测量野生型和变体IGF2(vIGF2)与CI-MPR受体的结合。野生型人类成熟IGF2肽(wt IGF2)具有以SEQ ID NO:1所示的序列。vIGF2序列与wt IGF 2的不同之处在于其缺乏残基1-4并且含有以下突变：E6R、Y27L和K65R。其具有氨基序列：SRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE(SEQ ID NO:31)。vIGF2还具有N端接头，所述N端接头具有序列GGGGSGGGG(SEQ IDNO:18)。组合序列为GGGGSGGGGSRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE(SEQ ID NO:43)。图4显示，如所预期，野生型IGF2肽以高亲和力(0.2nM)与CI-MPR受体结合。图5显示，变体IGF2肽(vIGF2)也以高亲和力(0.5nM)与CI-MPR受体结合。这些数据指示，vIGF2肽针对预期CI-MPR受体具有高亲和力以用于将治疗剂靶向溶酶体。
利用SPR来测量与胰岛素受体结合的肽，以评估潜在副作用。胰岛素以高亲和力(～8nM；数据未显示)结合胰岛素受体。测试野生型IGF2和vIGF2，其中vIGF2具有带有N端接头的序列SRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE(SEQID NO:31)，所述N端接头具有序列GGGGSGGGG(SEQ ID NO:18)。图8显示，野生型IGF2也以相对较高亲和力(～100nM)结合胰岛素受体。来自Biomarin/Zystor IGF2-GAA融合蛋白(BMN-701)的IGF2肽也以高亲和力结合胰岛素受体，并且显示在临床试验中引起低血糖症。图9显示vIGF2肽与胰岛素受体无可测量的结合。这些数据表明，vIGF2肽相较于wt IGF2肽融合体赋予更高的安全性概况。
利用相同SPR结合分析来表征vIGF2肽与IGF1受体的相互作用。图10显示，野生型IGF2肽以相对较高亲和力(～100nM)结合IGF1受体。图11显示vIGF2肽与IGF1受体无可测量的结合，表明相较于wt IGF2的改善的安全性概况。
实施例2：vIGF2将CI-MPR的低亲和力配体转化为高亲和力ERT
将具有N端接头(SEQ ID NO:18)的vIGF2肽(SEQ ID NO:31)与阿葡糖苷酶-α化学偶联，在本文中称为vIGF2-阿葡糖苷酶-α，以确定vIGF2肽是否可改善针对CI-MPR的亲和力。如图6中所示，在涂有CI-MPR的96孔ELISA板中使用CI-MPR板结合测定，直接比较阿葡糖苷酶-α和vIGF2-阿葡糖苷酶-α的结合亲和力。在测量结合酶活性之前，洗涤掉未结合的酶。将变化浓度的两种酶制剂与或不与游离WT IGF2肽一起使用。vIGF2基本上改善针对CI-MPR的亲和力。此外，vIGF2-阿葡糖苷酶-α的结合由游离WT IGF2阻断，指示结合具有IGF2依赖性。(数据未示出。)vIGF2肽的偶联不损害GAA酶活性。
将vIGF2与重组人类N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶(rhNAGLU)偶联。RrhNAGLU，一种缺乏M6P的溶酶体酶，用于确定肽是否可将非配体转化为CI-MPR的高亲和力配体。在这个实验中，使用CI-MPR板结合测定，利用涂有CI-MPR的板，直接比较rhNAGLU和vIGF2-rhNAGLU。在测量结合酶活性之前，洗涤掉未结合的酶。将变化浓度的两种酶制剂与或不与游离vIGF2肽一起使用。如图7中所示，vIGF2-rhNAGLU比缺乏vIGF2的rhNAGLU针对CI-MPR具有显著更高的亲和力。此外，vIGF2-rhNAGLU结合由游离vIGF2肽阻断，指示受体结合对IGF2肽具有特异性。这些结果表明，可利用vIGF2肽来改善向溶酶体的药物靶向。
实施例3：vIGF2-GAA融合蛋白的肌母细胞吸收
施用vIGF2-GAA融合蛋白(与实施例1-2中相同的序列)，并且测量酶的L6肌母细胞吸收。图6显示vIGF2-rhGAA相较于rhGAA和M6P-GAA的更好吸收。因此，vIGF2在将GAA靶向细胞方面有效。
实施例4：通过基因治疗递送的ERT的构建体
在图12中示出两种不同构建体。上图为编码“天然hGAA”(SEQ ID NO:45)的构建体，所述构建体含有Kozak序列和编码带有原生信号肽的重组人类GAA的核酸(SEQ ID NO:45)。中图为编码“工程化hGAA”(SEQ ID NO:23)的构建体Kozak-BiP-vIGF2-2GS-GAA。这种构建体的特征在于Kozak序列、编码BiP信号肽的核酸、编码vIGF2肽(其具有以SEQ ID NO:31所示的序列)的核酸和编码2GS接头(SEQ ID NO:18)的核酸，接着是编码重组人类GAA(其中移除N端60个氨基酸(SEQ ID NO:46)以防止过早加工和移除vIGF2)的核酸。
实施例5：基因治疗构建体的增强分泌
工程化hGAA具有较高分泌并且能够与适合于细胞吸收和溶酶体靶向的细胞表面受体相互作用
培养表达工程化hGAA(下文更详细地描述)或天然hGAA的CHO，并且收集条件培养基以用于测量GAA活性。图15显示工程化和天然hGAA的相对活性，表明工程化hGAA相较于天然hGAA具有增加的活性，指示工程化hGAA的更有效分泌。
实施例6：条件培养基中的PPT1的分析
PPT1构建体的克隆
将PPT1构建体克隆到含有CMV启动子的pcDNA3.1表达载体(ThermoFisher，目录#V79020)中。所测试的构建体包括PPT1-1(WT-PPT1)(SEQ ID NO:24)、PPT1-2(WT-vIGF2-PPT1)(SEQ ID NO:25)、PPT1-29(BiP2aa-vIGF2-PPT1)(SEQ ID NO:26)。
PPT1分泌和结合
在HEK293T细胞中暂时表达PPT1构建体持续3天，并且PPT1分泌至培养基中。通过蛋白质印迹法定量所分泌的PPT1，并且使用公认方法分析CI-MPR结合。所分泌的PPT1显示于图13中。CI-MPR结合显示于图14中。
实施例7：在庞培氏病动物模型中测试基因治疗载体
庞培氏基因治疗：临床前概念验证研究设计
在GAA基因敲除(GAA KO)小鼠中，使用高剂量进行临床前研究，以用于构建体的初始比较。构建体显示于图12中。小鼠用媒介物或两个构建体(天然hGAA或工程化hGAA)中的一者处理。向小鼠施用5e11 gc/小鼠(大约2.5e13 gc/kg)。使用2月龄的GAA基因敲除小鼠。正常(野生型)小鼠用作对照。研究设计概述于图16中。
庞培氏基因治疗：血浆
如所指示从野生型(正常)小鼠或用媒介物或基因治疗载体处理的GAA KO小鼠收集血浆，并且测量GAA活性和细胞表面结合。数据概述于图17、图27和图19中。在用基因治疗载体处理的小鼠中可见类似的高GAA水平(图17、图18)。然而，关于工程化构建体观测到较高的细胞靶向受体结合(图19)。
庞培氏基因治疗：四头肌
在正常(野生型)小鼠和经处理GAA KO小鼠中评估GAA活性和糖原储存/细胞质空泡化(图28)。四头肌中的GAA活性为野生型的约20倍。还评估了糖原PAS(图29)和免疫组织化学(图30)。免疫组织化学显示工程化hGAA相较于野生型具有更高的溶酶体靶向。根据PAS染色，工程化hGAA的糖原降低更恒定。
庞培氏基因治疗：三头肌
在正常(野生型)小鼠和经处理GAA KO小鼠中评估GAA活性和糖原储存/细胞质空泡化(图31)。GAA活性为野生型的约10-15倍。还评估了免疫组织化学和糖原PAS(图32和图33)。免疫组织化学表明，工程化hGAA相较于野生型GAA具有更高的溶酶体靶向。如通过PAS染色所测量，工程化hGAA的糖原降低更恒定。
庞培氏基因治疗：胫前肌(TA)
在正常(野生型)小鼠和经处理GAA KO小鼠中评估GAA活性和糖原储存/细胞质空泡化(图20)。TA中的GAA活性为野生型的约15-20倍。还评估了免疫组织化学和糖原PAS(图21和图22)。免疫组织化学表明，工程化hGAA相较于野生型GAA具有更高的溶酶体靶向。糖原水平接近于野生型水平。根据PAS染色，工程化hGAA的糖原降低更恒定。
庞培氏基因治疗：大脑和脊髓
在正常(野生型)小鼠和经处理GAA KO小鼠中评估GAA活性、糖原含量和糖原储存/细胞质空泡化(图23)。大脑中的GAA活性比野生型低约5倍。还评估了免疫组织化学和糖原PAS(图24、图25、图26、图27)。免疫组织化学指示，可存在一些细胞的直接转导。然而，天然构建体获得极少糖原清除至无糖原清除。工程化构建体的糖原水平接近于野生型水平，即使活性仅为野生型的20％。脊髓中的PAS染色显示天然构建体的极少糖原清除至无糖原清除。在包括运动神经元的腹角中，观测到工程化构建体接近于野生型的糖原水平。免疫组织化学表明脊髓神经元中的直接转导。由脉络丛和神经元细胞产生的工程化hGAA能够通过脊髓中的交叉校正而降低糖原，而对于天然hGAA观测到极少糖原降低。
结论
总而言之，该实施例中的数据表明，工程化基因治疗构建体相比于常规治疗中使用的野生型GAA具有显著更好的组织吸收和糖原降低，包括大脑和脊髓中的效果。
实施例8：动物研究方案
如所描述，通过Penn Vector Core产生并滴定AAVhu68载体。(Lock,Alvira等,2010,"Rapid,simple,and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale."Hum Gene Ther 21(10):1259-1271)。
在C57BL/6/129背景创建者中敲除Gaa的小家鼠(庞培氏小鼠)在Jackson Labs购得(库存#004154，也称为6neo小鼠)。
将经由侧尾静脉接受0.1mL中的5×1011个GC(约2.5×1013GC/kg)的AAVhu68.CAG.hGAA(包含天然hGAA(SEQ ID NO:45)或工程化hGAA(SEQ ID NO:38))的小鼠在载体给药后第7天和第21天放血以进行血清分离，并在注射后28天进行最终放血(用于血浆分离)并通过放血实施安乐死。迅速收集组织，从大脑开始。
GAA活性
将血浆与5.6mM 4-MU-α-吡喃葡萄糖苷pH 4.0混合，并且在37℃下温育三小时。用0.4M碳酸钠pH 11.5终止反应。使用Victor3荧光计(355nm激发和460nm发射)来测量相对荧光单位RFU。通过内插法根据4-MU的标准曲线，计算以nmol/mL/hr为单位的活性。基于匀浆中的总蛋白含量，进一步归一化个体组织样本中的活性。
根据LC/MS的GAA签名肽
在100％甲醇中沉淀血浆并离心。弃去上清液。向团块中掺入hGAA独有的稳定同位素标记的肽作为内标，并且将其与胰蛋白酶一起重悬并在37℃下温育一小时。用10％甲酸终止消化。通过C-18反相色谱法分离胰蛋白酶肽，并通过ESI-质谱法鉴定和定量。根据标签肽浓度计算血浆中的总GAA浓度。
细胞表面受体结合测定
96孔板用受体包被，洗涤并用BSA封闭。将来自AAV处理小鼠的28天血浆连续稀释，得到一系列降低浓度，并与偶联受体一起温育。在温育后，将板洗涤以除去任何未结合的hGAA，并且在37℃下添加4-MU-α-吡喃葡萄糖苷持续一小时。用1.0M甘氨酸pH 10.5终止反应，并通过Spectramax荧光计(激发370、发射460)读取RFU。通过内插法，根据4-MU的标准曲线，将每一样本的RFU转化为活性(nmol/mL/hr)。使用GraphPad Prism进行非线性回归。
组织学
对组织进行福尔马林固定和石蜡包埋。肌肉切片用PAS染色；CNS切片用luxolfast blue/高碘酸-Schiff(PAS)染色。经董事会认证的兽医学病理学家(JH)盲式审查了组织学切片。在扫描切片上进行具有糖原储存和细胞质空泡化的细胞的总百分比的半定量估算。如下表所述列出0至4的评分。
免疫-组织化学(IHC)
我们从使用抗人类GAA抗体(Sigma HPA029126)免疫染色的切片来研究转基因表达和细胞定位。
实施例9：组织学-组织加工方案和庞培氏病动物模型中的结果
将所有组织固定于10％NBF(中性缓冲的福尔马林)中。本领域中常规使用测定法(PAS和IHC)。
四头肌和三头肌的PAS染色(图29和图32)-将组织固定于10％NBF中并包埋于石蜡中。将切片后固定于1％高碘酸中并用Schiff试剂染色。其后，切片用苏木精复染。糖原呈现为洋红色聚集体(溶酶体结合)或扩散性粉红色(胞浆)；核为蓝色。根据图像并假设每个图像代表一个组，关于糖原清除率的排名顺序为：工程化hGAA>天然hGAA。在整个图像中，工程化hGAA构建体相较于其余的产生更多染色，表明通过vIGF2与CI-MPR的结合所介导的GAA蛋白的内吞作用得到改善。
脊髓(图26)的PAS染色-将组织固定于10％NBF中。1％高碘酸中的后固定可在石蜡包埋之前或之后进行。切片用Schiff试剂染色，并且可能用亚甲基蓝复染。糖原呈现为洋红色聚集体(溶酶体结合)；神经纤维呈现蓝色。图像聚焦于脊髓的腹角和运动神经元中的糖原积聚。在构建体中，工程化hGAA在糖原降低中看起来最有效。
GAAIHC(图22、图25、图27、图30和图35)-将组织固定于10％NBF中并包埋于石蜡中。将切片与抗GAA一级抗体一起温育，接着与识别一级抗体并携带酶标签HRP的二级抗体一起温育。随后，进行酶促反应并形成棕色沉淀产物。然后，切片用苏木精复染。构建体显示GAA吸收至肌纤维中(图31)。工程化hGAA>天然hGAA。在整个图像中，BiP-vIGF2构建体相较于其余的具有更多的扩散染色。
相较于其它载体，工程化hGAA产生更多GAA IHC信号，在肌纤维内部具有斑点样外观，表明远远更有效的溶酶体靶向(图22)。
总之，在构建体中，工程化hGAA始终表明在各种组织中的组织吸收、溶酶体靶向和糖原降低中的优越性。
虽然本文已显示和描述本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员将显而易见的是，仅以示例的方式提供了这样的实施方案。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述实施方案的各种替代方案。意图是，以下权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。