阅读说明：本技术 一种方格星虫非变性胶原蛋白的制备方法 (Preparation method of sipunculus nudus non-denatured collagen ) 是由 汤须崇 赵丽茹 代均涵 邓爱华 黄志宏 吴雅清 宋嘉怡 黄韵霏 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种方格星虫非变性胶原蛋白的制备方法,以方格星虫为原料,建立了以低温匀浆技术处理后采用超声辅助酶法提取非变性胶原蛋白提取工艺,采用亲水超滤技术快速分离纯化方格星虫胶原蛋白,得到高纯度的胶原蛋白产品。本发明具有制备工艺简单,胶原蛋白提取率高,纯度高、资源利用率高,提取经济效益高等特点,有效提高方格星虫产品附加值,实现方格星虫高值化利用为胶原蛋白的制备提供新来源。(The invention discloses a preparation method of Sipunculus nudus non-denatured collagen, which takes Sipunculus nudus as a raw material, establishes an extraction process for extracting the non-denatured collagen by adopting an ultrasonic-assisted enzyme method after low-temperature homogenization treatment, and quickly separates and purifies the Sipunculus nudus collagen by adopting a hydrophilic ultrafiltration technology to obtain a high-purity collagen product. The method has the characteristics of simple preparation process, high collagen extraction rate, high purity, high resource utilization rate, high extraction economic benefit and the like, effectively improves the additional value of Sipunculus nudus products, realizes high-value utilization of Sipunculus nudus, and provides a new source for the preparation of collagen.)

一种方格星虫非变性胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于胶原蛋白提取技术领域，具体涉及一种方格星虫非变性胶原蛋白的制备方法。

背景技术

方格星虫(Sipunculs nudus)属星虫门星虫科，又称光裸星虫、沙肠子等，俗称“沙虫”，主要分布在大西洋、印度洋、太平洋沿岸以及我国的广东、广西、海南和台湾沿海地区，一般生活在沿海滩涂的沙质区。方格星虫不仅味道鲜美，广受海峡两岸大众喜爱，而且是我国珍贵“海药”之一。方格星虫性寒、味甘、咸，具有滋阴降火、清肺补虚及补肾养颜等功能，可治疗骨蒸潮热、阴虚盗汗、肺虚喘咳、胸闷痰多以及妇女产后乳汁稀少等症，对治疗肝炎、肺痨咳嗽、神经衰弱与小儿脾虚等症均有效果。因此方格星虫在闽南素有“动物人参”的美称。方格星虫含有丰富的蛋白质(83.6％-86.5％)，多糖，多种氨基酸和微量元素，具有抗氧化、调节免疫、抗菌、抗辐射、抗病毒、抗疲劳、延缓衰老等功效。

胶原蛋白是-种白色、不透明、无支链纤维性蛋白质类高分子物质，是细胞外基质的主要成分，是动物体内含量最多、分布最广的一类蛋白质。广泛分布于***、皮肤、骨骼等，起着支撑器官、保护机体的功能，是决定***韧性的主要因素。其结构特征是由3条左手螺旋构型的α链构成三螺旋结构，然后又相互缠绕成右手超螺旋结构。胶原蛋白具有润滑关节、强韧骨骼、保护血管、促进新陈代谢、增强免疫力、止血性能、支架作用等，已经广泛应用于食品工业、生物制药工业、美容化妆品工业等多个领域。

目前以水产类为原料制备胶原蛋白的研究多集中在水产副产品上，大部分水产胶原蛋白的亚氨酸(脯氨酸和羟脯氨酸)含量较低，所以其热稳定性较差，如：真鳕鱼皮胶原蛋白的热变性温度仅为15℃，草鱼鱼皮胶原蛋白的热变性温度(34℃)。而传统的胶原蛋白的提取方式是一个高耗能、高耗溶剂、高耗时的过程，对环境的破坏大，而且提取过程难以控制，得到的多为变性胶原蛋白产品。CN101381411A公开了用除去非胶原蛋白的星虫体壁为原料，通过酸性蛋白酶或摩尔浓度为0.2-2.0mol/L的酸提取，经离心、盐析、再离心、透析、冻干步骤得到星虫胶原蛋白，该方法中利用氯化钠盐析和透析袋透析获得目的胶原蛋白这种方法只能在实验室进行小规模的纯化，成本较高，无法进行放大生产。CN106636275A公开了将虫浆经过超声波和电磁场后，将虫浆的细胞破碎利于方格星虫中蛋白质的酶解，再通过高压酶解提取，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶复配使用，显著提高方格星虫中蛋白质的提取率，该方法中100-120℃灭酶，破坏了胶原蛋白的三螺旋结构，胶原蛋白的变性，导致胶原蛋白的失活。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种方格星虫非变性胶原蛋白的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种方格星虫非变性胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成0.8-1.2mm×0.8-1.2mm的碎块，然后于0-4℃下采用异丙醇溶液除脂肪和氯化钠溶液处理除去方格星虫中的可溶性非胶原蛋白，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫与pH＝5-10的磷酸盐缓冲液混合后，以12000-18000rpm的转速于0-5℃分散10-30min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入2000-8000U/g的蛋白酶，该蛋白酶包括风味蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶中的至少一种，超声处理后于30-50℃下酶解3-5h，再于0-4℃下10000-12000rpm离心15-25min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理若干次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；然后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.7-0.9μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于0-4℃，采用截留分子量10-50kDa的超滤膜对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于0-4℃，采用截留分子量300-1000Da的纳滤膜对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得所述方格星虫非变性胶原蛋白。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将方格星虫去除内脏，清洗后剪成0.8-1.2mm×0.8-1.2mm的碎块；将该碎块以1g∶10-30mL的比例浸泡于浓度为5-10％的异丙醇溶液中，于0-4℃下脱脂12-24h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于0-4℃下，将脱脂碎块以1g∶10-20mL的比例浸泡于浓度为5-10％的氯化钠溶液中12-24h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中，所述预处理后的方格星虫与pH＝5-10的磷酸盐缓冲液的比例为1g∶5-30mL。

在本发明的一个优选实施方案中，所述蛋白酶为风味蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶中的至少一种。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)中的超滤膜的进口压力为0.5-3.0MPa。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(5)中的纳滤膜的最初的进口压力为0.5-2.0MPa。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(6)中的冷冻干燥为：-20--40℃下预冻24-48h，再放入-80℃冷冻干燥36-72h。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用低温匀浆技术，大幅度提高方格星虫胶原蛋白得率，缩短了胶原蛋白酶解时间。

2、本发明采用超声辅助酶解技术，超声波在溶液中通过介质所产生的空化作用后所发生的一些物理作用--震荡波、微射流、剪切力和高温高压作用，以及超声空化后所产生的化学作用，使溶液中出现自由基，能将稳定胶原蛋白分子的作用力破坏(例如疏水相互作用力)，引起胶原蛋白的展开，从而导致胶原蛋白聚集体的更加分散，使胶原蛋白聚集体在空间结构上更加疏散，导致胶原蛋白在溶液中呈现出相对较高的溶解度，因此能增大产率，缩短了提取时间。

3、本发明采用中空纤维超滤膜处理技术，胶原蛋白进行分离提纯浓缩，其分离时间由传统工艺的1-3天压缩到3小时以内；胶原蛋白的处理量由传统透析工艺的不足1L提升到一次性可处理45L的胶原蛋白溶液。传统透析方法不仅费时、费水，而且胶原蛋白的浓缩效率也不高，而超滤膜处理技术可在一定的压力驱动下高效、低能耗实现胶原蛋白的浓缩提纯，从而提高生产效率，降低能耗，降低生产成本，一次性处理量大同时能有效提高胶原蛋白的回收率，适用于工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例所制得的方格星虫非变性胶原蛋白的电镜照片(500×和1000×)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成1mm×1mm的碎块；将该碎块以1g∶30mL的比例浸泡于浓度为10％的异丙醇溶液中，于4℃下脱脂24h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于4℃下，将脱脂碎块以1g∶20mL的比例浸泡于浓度为10％的氯化钠溶液中24h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫以1g∶30mL的比例与pH＝6.5的磷酸盐缓冲液混合后，采用T18高速分散机(德国IKA有限公司)以18000rpm的转速于4℃分散30min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入4000U/g的风味蛋白酶，超声处理(功率200W，时间10min)后于30℃下酶解5h，再于4℃下10000rpm离心20min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理三次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；让后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.8μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于4℃，采用截留分子量50kDa的超滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，进口压力为3.0MPa，膜通量为120LMH)对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定(若透过液的电导率和pH值不断变化，则补充超纯水至原体积)，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于4℃，采用截留分子量1000Da的纳滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，最初的进口压力为2.0MPa)对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得如图1所示的所述方格星虫非变性胶原蛋白；该冷冻干燥具体为：-20℃下预冻48h，再放入-80℃冷冻干燥72h。

实施例2

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成1mm×1mm的碎块；将该碎块以1g∶10mL的比例浸泡于浓度为10％的异丙醇溶液中，于4℃下脱脂12h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于4℃下，将脱脂碎块以1g∶10mL的比例浸泡于浓度为7％的氯化钠溶液中12h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫以1g∶30mL的比例与pH＝8.5的磷酸盐缓冲液混合后，采用T18高速分散机(德国IKA有限公司)以12000rpm的转速于4℃分散30min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入2000U/g的胃蛋白酶，超声处理(功率200W，时间10min)后于30℃下酶解5h，再于4℃下10000rpm离心20min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理三次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；让后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.8μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于4℃，采用截留分子量50kDa的超滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，进口压力为3.0MPa，膜通量为120LMH)对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定(若透过液的电导率和pH值不断变化，则补充超纯水至原体积)，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于4℃，采用截留分子量1000Da的纳滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，最初的进口压力为2.0MPa)对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得如图1所示的所述方格星虫非变性胶原蛋白；该冷冻干燥具体为：-20℃下预冻48h，再放入-80℃冷冻干燥72h。

实施例3

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成1mm×1mm的碎块；将该碎块以1g∶30mL的比例浸泡于浓度为10％的异丙醇溶液中，于4℃下脱脂24h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于4℃下，将脱脂碎块以1g∶20mL的比例浸泡于浓度为10％的氯化钠溶液中24h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫以1g∶30mL的比例与pH＝4.0的磷酸盐缓冲液混合后，采用T18高速分散机(德国IKA有限公司)以18000rpm的转速于4℃分散30min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入4000U/g的碱性蛋白酶，超声处理(功率500W，时间10min)后于30℃下酶解5h，再于4℃下10000rpm离心20min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理三次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；让后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.8μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于4℃，采用截留分子量50kDa的超滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，进口压力为3.0MPa，膜通量为120LMH)对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定(若透过液的电导率和pH值不断变化，则补充超纯水至原体积)，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于4℃，采用截留分子量1000Da的纳滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，最初的进口压力为2.0MPa)对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得如图1所示的所述方格星虫非变性胶原蛋白；该冷冻干燥具体为：-20℃下预冻48h，再放入-80℃冷冻干燥72h。

实施例4

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成1mm×1mm的碎块；将该碎块以1g∶30mL的比例浸泡于浓度为10％的异丙醇溶液中，于4℃下脱脂24h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于4℃下，将脱脂碎块以1g∶20mL的比例浸泡于浓度为10％的氯化钠溶液中24h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫以1g∶30mL的比例与pH＝6.5的磷酸盐缓冲液混合后，采用T18高速分散机(德国IKA有限公司)以15000rpm的转速于4℃分散20min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入4000U/g的风味蛋白酶，超声处理(功率200W，时间10min)后于30℃下酶解5h，再于4℃下10000rpm离心20min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理三次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；让后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.8μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于4℃，采用截留分子量50kDa的超滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，进口压力为3.0MPa，膜通量为120LMH)对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定(若透过液的电导率和pH值不断变化，则补充超纯水至原体积)，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于4℃，采用截留分子量1000Da的纳滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，最初的进口压力为2.0MPa)对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得如图1所示的所述方格星虫非变性胶原蛋白；该冷冻干燥具体为：-20℃下预冻48h，再放入-80℃冷冻干燥72h。

实施例5

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成1mm×1mm的碎块；将该碎块以1g∶30mL的比例浸泡于浓度为10％的异丙醇溶液中，于4℃下脱脂24h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于4℃下，将脱脂碎块以1g∶20mL的比例浸泡于浓度为5％的氯化钠溶液中24h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫以1g∶30mL的比例与pH＝6.5的磷酸盐缓冲液混合后，采用T18高速分散机(德国IKA有限公司)以18000rpm的转速于4℃分散30min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入2000U/g风味蛋白酶和2000U/g碱性蛋白酶，超声处理(功率600W，时间10min)后于30℃下酶解5h，再于4℃下10000rpm离心20min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理三次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；让后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.8μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于4℃，采用截留分子量50kDa的超滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，进口压力为3.0MPa，膜通量为120LMH)对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定(若透过液的电导率和pH值不断变化，则补充超纯水至原体积)，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于4℃，采用截留分子量1000Da的纳滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，最初的进口压力为2.0MPa)对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得如图1所示的所述方格星虫非变性胶原蛋白；该冷冻干燥具体为：-20℃下预冻48h，再放入-80℃冷冻干燥72h。

实施例6

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成1mm×1mm的碎块；将该碎块以1g∶10mL的比例浸泡于浓度为10％的异丙醇溶液中，于4℃下脱脂24h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于4℃下，将脱脂碎块以1g∶10mL的比例浸泡于浓度为10％的氯化钠溶液中12h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫以1g∶30mL的比例与pH＝6.5的磷酸盐缓冲液混合后，采用T18高速分散机(德国IKA有限公司)以18000rpm的转速于4℃分散20min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入8000U/g的风味蛋白酶，超声处理(功率500W，时间10min)后于30℃下酶解5h，再于4℃下10000rpm离心20min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理三次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；让后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.8μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于4℃，采用截留分子量50kDa的超滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，进口压力为3.0MPa，膜通量为120LMH)对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定(若透过液的电导率和pH值不断变化，则补充超纯水至原体积)，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于4℃，采用截留分子量1000Da的纳滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，最初的进口压力为2.0MPa)对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得如图1所示的所述方格星虫非变性胶原蛋白；该冷冻干燥具体为：-20℃下预冻48h，再放入-80℃冷冻干燥72h。

实施例7

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成1mm×1mm的碎块；将该碎块以1g∶30mL的比例浸泡于浓度为10％的异丙醇溶液中，于4℃下脱脂24h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于4℃下，将脱脂碎块以1g∶10mL的比例浸泡于浓度为5％的氯化钠溶液中12h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫以1g∶30mL的比例与pH＝9的磷酸盐缓冲液混合后，采用T18高速分散机(德国IKA有限公司)以18000rpm的转速于4℃分散30min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入4000U/g碱性蛋白酶，超声处理(功率200W，时间10min)后于30℃下酶解5h，再于4℃下10000rpm离心20min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理三次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；让后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.8μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于4℃，采用截留分子量10kDa的超滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，进口压力为0.5MPa，膜通量为60LMH)对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定(若透过液的电导率和pH值不断变化，则补充超纯水至原体积)，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于4℃，采用截留分子量300Da的纳滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，最初的进口压力为0.5MPa)对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得如图1所示的所述方格星虫非变性胶原蛋白；该冷冻干燥具体为：-20℃下预冻48h，再放入-80℃冷冻干燥72h。

实施例8

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成1mm×1mm的碎块；将该碎块以1g∶20mL的比例浸泡于浓度为7％的异丙醇溶液中，于4℃下脱脂24h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于4℃下，将脱脂碎块以1g∶10mL的比例浸泡于浓度为10％的氯化钠溶液中24h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫以1g∶30mL的比例与pH＝4.0的磷酸盐缓冲液混合后，采用T18高速分散机(德国IKA有限公司)以12000rpm的转速于4℃分散25min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入6000U/g的胃蛋白酶，超声处理(功率200W，时间10min)后于30℃下酶解4h，再于4℃下10000rpm离心20min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理三次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；让后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.8μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于4℃，采用截留分子量50kDa的超滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，进口压力为3.0MPa，膜通量为120LMH)对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定(若透过液的电导率和pH值不断变化，则补充超纯水至原体积)，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于4℃，采用截留分子量1000Da的纳滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，最初的进口压力为2.0MPa)对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得如图1所示的所述方格星虫非变性胶原蛋白；该冷冻干燥具体为：-20℃下预冻48h，再放入-80℃冷冻干燥72h。

实施例9

(1)将方格星虫去除内脏，清洗后剪成1mm×1mm的碎块；将该碎块以1g∶20mL的比例浸泡于浓度为10％的异丙醇溶液中，于4℃下脱脂24h，然后用蒸馏水充分清洗，获得脱脂碎块；于4℃下，将脱脂碎块以1g∶20mL的比例浸泡于浓度为10％的氯化钠溶液中24h，最后用蒸馏水洗涤并沥干，获得预处理后的方格星虫；

(2)将上述预处理后的方格星虫以1g∶30mL的比例与pH＝6.5的磷酸盐缓冲液混合后，采用T18高速分散机(德国IKA有限公司)以18000rpm的转速于4℃分散30min；

(3)在步骤(2)所得的物料中加入4000U/g风味蛋白酶和2000U/g木瓜蛋白酶，超声处理(功率400W，时间10min)后于30℃下酶解4h，再于4℃下10000rpm离心20min，获得上清液和沉淀；将上述沉淀用该步骤的工艺参数重复处理三次，合并所得到的上清液，得到胶原蛋白粘液；让后将该胶原蛋白粘液经孔径为0.8μm的陶瓷膜过滤，获得透过液；

(4)于4℃，采用截留分子量40kDa的超滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，进口压力为2MPa，膜通量为100LMH)对上述透过液进行分离提纯直至其电导率和pH趋于稳定(若透过液的电导率和pH值不断变化，则补充超纯水至原体积)，以除尽其中多余的酸和盐离子；

(5)于4℃，采用截留分子量300Da的纳滤膜(SPPM-24S-1超滤系统，2540卷式膜元件(厦门三达膜科技有限公司)，最初的进口压力为2.0MPa)对步骤(4)所得的物料进行浓缩至纳滤膜的最终的进口压力变为最初的进口压力的1/4，除去多余的水分、无机盐及游离氨基酸；

(6)将步骤(5)所得的物料进行冷冻干燥，即得如图1所示的所述方格星虫非变性胶原蛋白；该冷冻干燥具体为：-20℃下预冻48h，再放入-80℃冷冻干燥72h。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。