阅读说明：本技术 一种人血红蛋白的制备方法 (Preparation method of human hemoglobin ) 是由 徐德红 徐琳 黄红萍 田根根 殷维 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人血红蛋白的制备方法,具体包括以下步骤：S1、血液的选取：首先从医院或医疗机构收取过期人血,S2、血浆的去除,S3、血红蛋白的释放,S4、基质的除去,S5、血红蛋白的纯化,本发明涉及生物工程技术领域。该人血红蛋白的制备方法,可实现既快速又高效的制备出高纯度人血红蛋白,同时很好的实现了将过期的人血进行回收利用,来提取人血红蛋白,避免了过期人血的直接丢弃造成资源的浪费,大大简化了制备工艺,且提升了制备人血红蛋白的纯度,无需花费工作人员大量的工作时间进行分离和纯化,减轻了工作人员的工作负担,大大提高了工作人员的工作效率,从而大大方便了人们人血红蛋白的制备。(The invention discloses a preparation method of human hemoglobin, which specifically comprises the following steps: s1, selecting blood: the method comprises the steps of collecting expired human blood from a hospital or a medical institution, S2 removing the blood plasma, S3 releasing hemoglobin, S4 removing matrix, and S5 purifying the hemoglobin, and relates to the technical field of biological engineering. The preparation method of the human hemoglobin can realize the rapid and efficient preparation of the high-purity human hemoglobin, simultaneously well realizes the recycling of expired human blood to extract the human hemoglobin, avoids the waste of resources caused by the direct discarding of the expired human blood, greatly simplifies the preparation process, improves the purity of the prepared human hemoglobin, does not need to spend a large amount of working time of workers for separation and purification, reduces the workload of the workers, greatly improves the working efficiency of the workers, and greatly facilitates the preparation of the human hemoglobin.)

一种人血红蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种人血红蛋白的制备方法。

背景技术

血红蛋白是血红细胞中的最主要蛋白成分，同时也是血液的主要蛋白成分，在红细胞中还含有微量的超氧化物歧化酶(S0D)、碳酸酐酶、糖酵解酶系等，在血浆部分则含有200多种功能不同的蛋白组分，有的属多酶系统如补体系统、凝血系统、纤溶系统和激肽原系统等，有的属免疫球蛋白类、蛋白酶抑制物、转输蛋白类、类脂蛋白类等。

随着普通输血性用量的增加和安全血源(高质量、无病毒污染)供应的紧张，人血代用品的研究与开发便显得更为迫切，因此，进行以动物血为原料生产血红蛋白和利用现代生物技术生产血红蛋白的研究则具有显著的前瞻性，牛血红蛋白具有与人血红蛋白相近的空间结构，免疫源性小，可供利用的血源供应较为丰富，有很大的开发价值，尽管可以利用大肠杆菌或酵母来表达修饰的人血红蛋白分子，但是对于血红蛋白的分离和纯化上的困难则可能是限制该途径的关键所在，毕竟从微生物中制备血红蛋白要比从红细胞中制备血红蛋白的方法复杂得多。

血红蛋白制备过程中的问题在血红蛋自的提取和纯化过程中几乎失去了全部的2,3-DPG，即2,3-二磷酸甘油酸，一种血红蛋白的别构效应物，在血红蛋白的分子中，两个β亚基中间有一分子的2,3-DPG,它以分子中的三个负电荷集团与血红蛋白的β亚基中的三个正电荷集团形成6个盐桥，从面调节了血红蛋白对氯的亲和力，使得血红蛋白对氧亲和力提高，P即半饱和分压，在正常的生理条件下，使得血红蛋白氧饱和度达到50％时所需的氧分压降至10Tor,较全血(P＝26Tor)降低很多，所结合的氧很难释放出来,同时由于无膜的包被，血红蛋白四聚体易裂解为二聚体，很快从肾脏排出，造成肾中毒，血红蛋白在动物体的半保留时间仅为2-4h。

目前的血红蛋白制备大多直接采用动物细胞进行微生物来表达修饰的人血红蛋白分子进行人血红蛋白的制备，然而，这样的制备方法步骤繁琐，且制备的人血红蛋白纯度较低，需要花费工作人员大量的工作时间进行分离和纯化，增加了工作人员的工作负担，大大降低了工作人员的工作效率，不能实现既快速又高效的制备出高纯度人血红蛋白，同时不能实现将过期的人血进行回收利用，来提取人血红蛋白，无法避免过期人血的直接丢弃造成资源的浪费，从而给人们人血红蛋白的制备带来极大的不便。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种人血红蛋白的制备方法，解决了现有的制备方法步骤繁琐，且制备的人血红蛋白纯度较低，需要花费工作人员大量的工作时间进行分离和纯化，增加了工作人员的工作负担，大大降低了工作人员的工作效率，不能实现既快速又高效的制备出高纯度人血红蛋白，同时不能实现将过期的人血进行回收利用，来提取人血红蛋白，无法避免过期人血的直接丢弃造成资源浪费的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种人血红蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、血液的选取：首先从医院或医疗机构收取过期人血，然后通过称量设备量取所需体积的过期人血，备用；

S2、血浆的去除：将步骤S1量取的过期人血倒入离心设备中，然后以转速为400-500r/min，温度为25-31℃的条件下旋转离心10-20min，之后沉淀30-40min，即可完成将过期人血中的红细胞分离出来，然后采用缓冲液系统将分离出来的红细胞洗涤2-3次，洗涤液常用等红细胞体积的等渗溶液如生理盐水，该洗涤过程也同时除去来白细胞和血小板，能够去除血浆蛋白和部分膜磷脂；

S3、血红蛋白的释放：经过步骤S2得到堆积的血红细胞后，先把红细胞置于肾透析仪中，再倒入低渗溶液中透析1-2h，使红细胞逐断膨胀以至膜破裂，然后再将透析后的混合溶液转移至0,lμm的超滤制备中，从而过滤出血红蛋白溶液，其中基本上不含有任何脂类，通过低渗溶液来溶胀红细胞，使部分膜孔打开以释放血红蛋白，最大限度地释放血红蛋白而又较完整地保存了细胞膜的结构；

S4、基质的除去：将步骤S3得到的血红蛋白溶液转移至离心设备内，在10000-36000g的离心力下，离心时间为30-120min，除去红细胞膜及膜碎片基质，然后分类上清液，将所得的上清液依次过0.45和0.2pm滤膜以进一步除去更小的基质和病菌，之后使用pH调节剂调节pH和盐离子浓度；

S5、血红蛋白的纯化：用100kd的滤膜或病毒滤器过滤，以起到脱磷脂或病毒的作用，再通过凝胶排阻层析柱对血红蛋白溶液进行分离，即可得到血红蛋白纯品。

优选的，所述步骤S2中缓冲液系统为120-130mM的NaCl、10-15mM的葡萄糖、2-3mM的MgCl₂、52-55mM的KH₂PO₄和18-20mM的K₂HPO₄组成的缓冲溶液，使用该缓冲液系统进行洗涤，能够防止红细胞的破裂和维持稳定的胞内环境。

优选的，所述步骤S3中低渗溶液为2-3mM的MgCh、5.7-6.3mM的K₂HPO₄和2.3-2.5mM的KH₂PO₄组成的混合溶液。

优选的，所述步骤S4中所得的上清液是含有微量杂蛋白和脂类的血红蛋白溶液。

优选的，所述步骤S5中血红蛋白的纯化可除去99.7％以上的磷脂和99,9％以上的血型抗原。

优选的，所述步骤S5中凝胶排阻层析柱为WatersQMA-Acell柱，该层析柱一次能够得到20-22g血红蛋白，且需时仅为1h。

优选的，所述步骤S4中的pH调节剂为0.6-1.3mol/L的碳酸钠溶液。

优选的，所述步骤S3中肾透析仪选自型号为BC2600的全自动血细胞透析仪。

(三)有益效果

本发明提供了一种人血红蛋白的制备方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该人血红蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：S1、血液的选取：首先从医院或医疗机构收取过期人血，然后通过称量设备量取所需体积的过期人血，备用，S2、血浆的去除：将步骤S1量取的过期人血倒入离心设备中，然后以转速为400-500r/min，温度为25-31℃的条件下旋转离心10-20min，之后沉淀30-40min，即可完成将过期人血中的红细胞分离出来，然后采用缓冲液系统将分离出来的红细胞洗涤2-3次，能够去除血浆蛋白和部分膜磷脂，S3、血红蛋白的释放：经过步骤S2得到堆积的血红细胞后，先把红细胞置于肾透析仪中，再倒入低渗溶液中透析1-2h，使红细胞逐断膨胀以至膜破裂，然后再将透析后的混合溶液转移至0,lμm的超滤制备中，从而过滤出血红蛋白溶液，S4、基质的除去：将步骤S3得到的血红蛋白溶液转移至离心设备内，在10000-36000g的离心力下，离心时间为30-120min，除去红细胞膜及膜碎片基质，然后分类上清液，将所得的上清液依次过0.45和0.2pm滤膜以进一步除去更小的基质和病菌，之后使用pH调节剂调节pH和盐离子浓度，S5、血红蛋白的纯化：用100kd的滤膜或病毒滤器过滤，以起到脱磷脂或病毒的作用，再通过凝胶排阻层析柱对血红蛋白溶液进行分离，即可得到血红蛋白纯品，可实现既快速又高效的制备出高纯度人血红蛋白，同时很好的实现了将过期的人血进行回收利用，来提取人血红蛋白，避免了过期人血的直接丢弃造成资源的浪费，大大简化了制备工艺，且提升了制备人血红蛋白的纯度，无需花费工作人员大量的工作时间进行分离和纯化，减轻了工作人员的工作负担，大大提高了工作人员的工作效率，从而大大方便了人们人血红蛋白的制备。

附图说明

图1为本发明的流程图；

图2为本发明对照实验的数据统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-2，本发明实施例提供三种技术方案：一种人血红蛋白的制备方法，具体包括以下实施例：

实施例1

S1、血液的选取：首先从医院或医疗机构收取过期人血，然后通过称量设备量取所需体积的过期人血，备用；

S2、血浆的去除：将步骤S1量取的过期人血倒入离心设备中，然后以转速为450r/min，温度为28℃的条件下旋转离心15min，之后沉淀35min，即可完成将过期人血中的红细胞分离出来，然后采用缓冲液系统将分离出来的红细胞洗涤2次，洗涤液常用等红细胞体积的等渗溶液如生理盐水，该洗涤过程也同时除去来白细胞和血小板，能够去除血浆蛋白和部分膜磷脂，缓冲液系统为125mM的NaCl、13mM的葡萄糖、2.5mM的MgCl₂、54mM的KH₂PO₄和19mM的K₂HPO₄组成的缓冲溶液，使用该缓冲液系统进行洗涤，能够防止红细胞的破裂和维持稳定的胞内环境；

S3、血红蛋白的释放：经过步骤S2得到堆积的血红细胞后，先把红细胞置于肾透析仪中，再倒入低渗溶液中透析1.5h，使红细胞逐断膨胀以至膜破裂，然后再将透析后的混合溶液转移至0,lμm的超滤制备中，从而过滤出血红蛋白溶液，其中基本上不含有任何脂类，通过低渗溶液来溶胀红细胞，使部分膜孔打开以释放血红蛋白，最大限度地释放血红蛋白而又较完整地保存了细胞膜的结构，低渗溶液为2.5mM的MgCh、6mM的K₂HPO₄和2.4mM的KH₂PO₄组成的混合溶液，肾透析仪选自型号为BC2600的全自动血细胞透析仪；

S4、基质的除去：将步骤S3得到的血红蛋白溶液转移至离心设备内，在25000g的离心力下，离心时间为80min，除去红细胞膜及膜碎片基质，然后分类上清液，将所得的上清液依次过0.45和0.2pm滤膜以进一步除去更小的基质和病菌，之后使用pH调节剂调节pH和盐离子浓度，所得的上清液是含有微量杂蛋白和脂类的血红蛋白溶液，pH调节剂为1mol/L的碳酸钠溶液；

S5、血红蛋白的纯化：用100kd的滤膜或病毒滤器过滤，以起到脱磷脂或病毒的作用，再通过凝胶排阻层析柱对血红蛋白溶液进行分离，即可得到血红蛋白纯品，血红蛋白的纯化可除去99.7％以上的磷脂和99,9％以上的血型抗原，凝胶排阻层析柱为WatersQMA-Acell柱，该层析柱一次能够得到21g血红蛋白，且需时仅为1h。

实施例2

S1、血液的选取：首先从医院或医疗机构收取过期人血，然后通过称量设备量取所需体积的过期人血，备用；

S2、血浆的去除：将步骤S1量取的过期人血倒入离心设备中，然后以转速为400r/min，温度为25℃的条件下旋转离心10min，之后沉淀30min，即可完成将过期人血中的红细胞分离出来，然后采用缓冲液系统将分离出来的红细胞洗涤2次，洗涤液常用等红细胞体积的等渗溶液如生理盐水，该洗涤过程也同时除去来白细胞和血小板，能够去除血浆蛋白和部分膜磷脂，缓冲液系统为120mM的NaCl、10mM的葡萄糖、2mM的MgCl₂、52mM的KH₂PO₄和18mM的K₂HPO₄组成的缓冲溶液，使用该缓冲液系统进行洗涤，能够防止红细胞的破裂和维持稳定的胞内环境；

S3、血红蛋白的释放：经过步骤S2得到堆积的血红细胞后，先把红细胞置于肾透析仪中，再倒入低渗溶液中透析1h，使红细胞逐断膨胀以至膜破裂，然后再将透析后的混合溶液转移至0,lμm的超滤制备中，从而过滤出血红蛋白溶液，其中基本上不含有任何脂类，通过低渗溶液来溶胀红细胞，使部分膜孔打开以释放血红蛋白，最大限度地释放血红蛋白而又较完整地保存了细胞膜的结构，低渗溶液为2mM的MgCh、5.7mM的K₂HPO₄和2.3mM的KH₂PO₄组成的混合溶液，肾透析仪选自型号为BC2600的全自动血细胞透析仪；

S4、基质的除去：将步骤S3得到的血红蛋白溶液转移至离心设备内，在10000g的离心力下，离心时间为30min，除去红细胞膜及膜碎片基质，然后分类上清液，将所得的上清液依次过0.45和0.2pm滤膜以进一步除去更小的基质和病菌，之后使用pH调节剂调节pH和盐离子浓度，所得的上清液是含有微量杂蛋白和脂类的血红蛋白溶液，pH调节剂为0.6mol/L的碳酸钠溶液；

S5、血红蛋白的纯化：用100kd的滤膜或病毒滤器过滤，以起到脱磷脂或病毒的作用，再通过凝胶排阻层析柱对血红蛋白溶液进行分离，即可得到血红蛋白纯品，血红蛋白的纯化可除去99.7％以上的磷脂和99,9％以上的血型抗原，凝胶排阻层析柱为WatersQMA-Acell柱，该层析柱一次能够得到20g血红蛋白，且需时仅为1h。

实施例3

S1、血液的选取：首先从医院或医疗机构收取过期人血，然后通过称量设备量取所需体积的过期人血，备用；

S2、血浆的去除：将步骤S1量取的过期人血倒入离心设备中，然后以转速为500r/min，温度为31℃的条件下旋转离心20min，之后沉淀40min，即可完成将过期人血中的红细胞分离出来，然后采用缓冲液系统将分离出来的红细胞洗涤3次，洗涤液常用等红细胞体积的等渗溶液如生理盐水，该洗涤过程也同时除去来白细胞和血小板，能够去除血浆蛋白和部分膜磷脂，缓冲液系统为130mM的NaCl、15mM的葡萄糖、3mM的MgCl₂、55mM的KH₂PO₄和20mM的K₂HPO₄组成的缓冲溶液，使用该缓冲液系统进行洗涤，能够防止红细胞的破裂和维持稳定的胞内环境；

S3、血红蛋白的释放：经过步骤S2得到堆积的血红细胞后，先把红细胞置于肾透析仪中，再倒入低渗溶液中透析2h，使红细胞逐断膨胀以至膜破裂，然后再将透析后的混合溶液转移至0,lμm的超滤制备中，从而过滤出血红蛋白溶液，其中基本上不含有任何脂类，通过低渗溶液来溶胀红细胞，使部分膜孔打开以释放血红蛋白，最大限度地释放血红蛋白而又较完整地保存了细胞膜的结构，低渗溶液为3mM的MgCh、6.3mM的K₂HPO₄和2.5mM的KH₂PO₄组成的混合溶液，肾透析仪选自型号为BC2600的全自动血细胞透析仪；

S4、基质的除去：将步骤S3得到的血红蛋白溶液转移至离心设备内，在36000g的离心力下，离心时间为120min，除去红细胞膜及膜碎片基质，然后分类上清液，将所得的上清液依次过0.45和0.2pm滤膜以进一步除去更小的基质和病菌，之后使用pH调节剂调节pH和盐离子浓度，所得的上清液是含有微量杂蛋白和脂类的血红蛋白溶液，pH调节剂为1.3mol/L的碳酸钠溶液；

S5、血红蛋白的纯化：用100kd的滤膜或病毒滤器过滤，以起到脱磷脂或病毒的作用，再通过凝胶排阻层析柱对血红蛋白溶液进行分离，即可得到血红蛋白纯品，血红蛋白的纯化可除去99.7％以上的磷脂和99,9％以上的血型抗原，凝胶排阻层析柱为WatersQMA-Acell柱，该层析柱一次能够得到22g血红蛋白，且需时仅为1h。

对照实验

某生物工程企业采用本发明实施例1-3的制备方法分别进行人血红蛋白的制备，在制备过程中记录制备出人血红蛋白成品所用工时，并且选取常规工艺制备人血红蛋白所用工时作为对照组。

由图2可知，实施例1制备出人血红蛋白成品所用工时最短，且实施例2和实施例3制备出人血红蛋白成品所用工时均比对照组短，因此，本发明可实现既快速又高效的制备出高纯度人血红蛋白，同时很好的实现了将过期的人血进行回收利用，来提取人血红蛋白，避免了过期人血的直接丢弃造成资源的浪费，大大简化了制备工艺，且提升了制备人血红蛋白的纯度，无需花费工作人员大量的工作时间进行分离和纯化，减轻了工作人员的工作负担，大大提高了工作人员的工作效率，从而大大方便了人们人血红蛋白的制备。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。