抗乙型肝炎病毒表面抗原前s1抗原的纳米抗体及其用途
阅读说明：本技术 抗乙型肝炎病毒表面抗原前s1抗原的纳米抗体及其用途 (Nano antibody of anti-hepatitis B virus surface antigen pre-S1 antigen and application thereof ) 是由 张军方 于 2019-07-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原(HBV-preS1)的纳米抗体。本发明通过用HBV-preS1免疫羊驼,筛选得到了抗HBV-preS1的纳米抗体。本发明还涉及这些抗体的片段及与Fc融合组成的完整抗体,该抗体用于乙型肝炎病毒及肝癌的治疗,和制备该抗体的方法。(The invention discloses a nano antibody of anti-hepatitis B virus surface antigen pre-S1 antigen (HBV-preS 1). The invention obtains the nano antibody of anti-HBV-preS1 by screening the alpaca immunized by the HBV-preS 1. The invention also relates to fragments of the antibodies and complete antibodies fused with Fc, the antibodies are used for treating hepatitis B virus and liver cancer, and a method for preparing the antibodies.)
技术领域
本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原(HBV-preS1)的纳米抗体序列。该发明用于诊断或治疗乙型肝炎病以及肝癌的用途。
背景技术
本发明涉及抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原(HBV-preS1)的纳米抗体，该发明用于诊断或治疗乙型肝炎病以及肝癌。
经过三十多年的发展，治疗性单克隆抗体药物在肿瘤及自身免疫病领域已经取得了重大进展，现成为临床治疗此类疾病的重要手段之一。发展针对HBV的治疗性抗体，有望为慢性HBV感染提供新的治疗策略。
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的感染是全球共同面临的严重的公共卫生问题。统计结果显示，全球有超过20亿人感染过HBV，其中约有3.5亿人为慢性HBV感染(Chronic hepatitis B，CHB)。由于HBV感染的感染率极高，并且由慢乙肝患者发展成的肝癌死亡率在我国癌症总死亡率中排名第二，因此乙型肝炎对我国造成了严重的经济负担。HBV的感染在各个国家及地区存在极大的的差异，大部分乙肝携带者集中在亚洲、非洲和西太平洋地区。因此乙型肝炎病毒感染，并由其所引发的一系列肝炎、肝硬化及肝癌等肝脏疾病已成为全世界公共健康问题之一。
因此HBV感染，尤其是慢性HBV感染，造成的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌等肝脏疾病给患者带来沉重的经济负担。目前已经批准的应用于慢乙肝临床治疗的药物有干扰素和核苷类似物两类，尽管在抑制病毒复制和延缓疾病进展上起到积极的效果，但仍然存在治疗周期长、应答率低、副反应较严重(干扰素类)以及潜在耐药性(核苷类似物)等问题，因此，急需发展基于新靶点或新机制的抗HBV药物。
HBV基因组大小为3.2kb碱基对(base pair，bp)的小环形DNA(3182～3221,不同亚型的HBV病毒基因组长度略有差别)，是目前已知最小的真核细胞DNA病毒之一。HBV基因组有4个开放阅读框(Open reading frame，ORF)：S-ORF、P-ORF、C-ORF、X-ORF。S-ORF编码三个包膜蛋白SHBs(S)、MHBs(preS2+S)和LHBs(preS1+preS2+S)。C-ORF有前C区(preC)和C基因区，前者是一种分泌型蛋白(HBeAg)，对于慢性感染免疫耐受的形成具有重要的作用，后者组成病毒Capsid，并包裹病毒基因组，HBV基因组中的这一区段最保守，是免疫攻击的靶表位。X-ORF的基因产物HBx蛋白具有转式激活增强子和启动子的转录功能，是一种多功能的反式调节因子，与病毒感染、转录、复制、细胞凋亡和HCC发生均有重要联系。P-ORF是HBV基因组中最长的ORF，负责转录DNA聚合酶。此外，HBV的各个开放阅读框高度重叠，具有非常紧致的结构。
HBV基因组含4个基因，转录出4种不同的mRNA并可以编码合成9种不同的病毒蛋白，包括组装病毒的外膜蛋白(L-HBsAg，M-HBsAg，S-HBsAg)和核壳(HBcAg)的结构蛋白；3种P蛋白(末端蛋白，DNAp和RNA酶H)和调节病毒复制功能的HBx蛋白,另一种pc/C基因编码的HBeAg蛋白也一种是功能蛋白。
乙型肝炎病毒外膜蛋白(HBsAg)又称为澳大利亚抗原，最早是由Blumberg在1965年发现，而且被广泛应用于定量血清中HBsAg的值来预测病人HBV感染水平。HBV的外膜蛋白由S-ORF编码合成，包括L-HBsAg，M-HBsAg和S-HBsAg3种外膜成分，3种蛋白有各自的起始密码，但共同合用S-HBsAg的终止密码。
HBV的核心蛋白由C-ORF编码(nucleprotein)，有2中形式：一种为病毒核壳的结构成分HBcAg；另一种是可溶性、能分泌的HBeAg。HBV的C基因有2个相关的ORF，其中以两个起始密码子区分为前C(Pre-C)和C区，但是有共同的终止密码子。Pre-C/P mRNA合成P21的核壳蛋白HBcAg，Pre-C-mRNA产生P25Pre-C蛋白，经一系列处理最终才成为HBeAg。HBcAg在不同细胞系中，如细菌、酵母、哺乳动物细胞等，在无其他HBV相关蛋白或元件的情况下均能自发组装成Capsid结构，可以作为基因工程疫苗的载体。
据***公布的《传染病2011年疫情分布报告》显示：在我国肝病患者已经突破1.5亿人，其中慢性乙型肝炎患者已达到4000-5000万人，慢性HBV感染的主要不良结局包括罹患肝硬化(LC)、原发性肝细胞癌(HCC)等终末期肝脏疾病(ALD)，研究表明慢性乙肝患者最终由20％-30％发展成为肝硬化。目前我国肝硬化患者约为3000万，其中4.7％的肝硬化患者最终会转化为肝癌，每年约有30万人死于肝癌，我国已经成为肝病发生大国。
肝癌发生的最主要危险因素是慢性HBV感染。近年来研究发现，病毒可能作为诱变剂起直接作用，科研工作者们已从越来越多的HCC病例中发现了病毒DNA序列整合到潜在的致癌基因上。一些其他因素也与慢乙肝患者的HCC发生风险相关，其中包括酒精、代谢因素和环境因素(如黄曲霉素)等。
目前人类主要是以预防性的疫苗为主作为对付HBV的策略，但是对于那些慢乙肝患者，需要寻找有效的抗病毒药物。在过去的20年间七种药物已经被FDA批准用来治疗慢性乙型肝炎，***最早的两个药物是干扰素(Interferon-alfa-2b)和拉米夫定(Lamivudine)，他们在上世纪90年代得到了很好的应用。本世纪初，FDA批准上市了五种药物用于乙肝的治疗，他们分别是：阿德福韦酯(adefovir dipivoxil),干扰素(alfa-2apeginterferonalfa-2a),替诺福韦酯(tenofovir disproxil fumarate)，恩替卡韦(entecavir),替比夫定(telbivudine)。
单域抗体(single domain antibody,SDAb)单域抗体又称纳米抗体(nanobody)或重链抗体(heavy chain antibody，hcAb)，最早是从骆驼科动物(羊驼)分离出的一种突变形式的抗体，分子量非常小只有12-15kDa，只有传统抗体分子量的的1/12左右。单域抗体，仅由重链构成，无轻链，与传统抗体的组成结构不同，其Fab区仅是一个单结构域，通过铰链区与Fc区连接。单域抗体构象稳定水溶性好，在胃液和内脏中仍能与抗原高亲和力结合。单域抗体分子量小，所以能识别某些独特的抗原表位，例如可进入酶的活性部位或者进去细菌或病毒表面受体的裂缝中，可以利用其模拟药物来设计小分子受体的激动剂、酶的抑制剂或拮抗剂等。
发明内容
本发明通过用HBV-preS1抗原免疫羊驼，收集分离免疫后的PBMC，提取总RNA并得到cDNA,通过噬菌体展示技术获得了抗体库，进一步使用HBV-preS1筛选得到与其特异反应的纳米抗体。本发明制备的针对HBV表面抗原前S1抗原的纳米抗体，并公开了其组成抗体的CDR1、CDR2、CDR3序列，该纳米抗体能够与HBV-preS1特异反应，并且能够在细胞模型及小鼠体内模型中有效降低HBV病毒含量，具有显著的治疗乙型肝炎的效果，并且可以阻断慢乙肝向肝癌的转变。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种抗HBV-preS1的纳米抗体，该纳米抗体通过用HBV-preS1免疫羊驼，利用噬菌体展示技术筛选获得。
进一步地，上述分子是抗乙型肝炎病毒的纳米抗体。
进一步地，上述分子是抗HBV-preS1的纳米抗体。
进一步地，上述分子通过噬菌体展示技术筛选得到。
根据本发明的第二方面，本发明提供的分子包含CDR1、CDR2、CDR3序列。
进一步地，上述分子CDR1序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12所有序列。
进一步地，上述分子CDR2序列为SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：21所有序列。
进一步地，上述分子CDR3序列为SEQ ID NO：22至SEQ ID NO：30所有序列。
根据本发明的第三方面，本发明提供的分子对乙型肝炎和肝癌具有显著的治疗效果。
进一步地，上述分子对乙型肝炎病毒具有治疗效果。
进一步地，上述分子可以降低HBsAg水平。
进一步地，上述分子可以降低HBeAg水平。
进一步地，上述分子可以对肝癌具有治疗效果。
附图说明
图1为本发明一个实施例中PCR扩增产物电泳图(M：DNA marker 2000；泳道1和泳道2：扩增产物)；
图2为本发明一个实施例中图2.4pHEN1和VHH双酶切电泳图(M:DNA marker 2000；泳道1：pHEN1；泳道2：sfil/notI酶切后的pHEN1；泳道3：sfil/notI酶切后的VHH)；
图3为本发明一个实施例中菌落PCR验证文库***率(M:DNA marker2000；泳道1-48：随机挑取的克隆)；
图4为本发明一个实施例中筛选得到的纳米抗体测序；
图5为本发明一个实施例中筛选得到的抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原纳米抗体(Anti-HBV-preS1VHH)与对照纳米抗体(Control VHH)相比，可以显著降低HBV转基因小鼠体内血清HBsAg水平；
图6为本发明一个实施例中筛选得到的抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原纳米抗体(Anti-HBV-preS1VHH)与对照纳米抗体(Control VHH)相比，可以显著降低HBV转基因小鼠体内血清HBeAg水平；
图7为本发明一个实施例中筛选得到的抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原纳米抗体(Anti-HBV-preS1VHH)与对照纳米抗体(Control VHH)相比，可以显著降低HBV转基因小鼠体内HBV DNA水平；
图8为本发明一个实施例中筛选得到的抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原纳米抗体(Anti-HBV-preS1VHH)与对照纳米抗体(Control VHH)相比，可以显著抑制整合有HBV基因组的肝癌细胞在小鼠体内的肿瘤生长；
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1：HBV-preS1抗原的制备
本实验针对羊驼使用的免疫原为乙肝表面抗原前S1抗原HBV-preS1，采用E.coli原核表达系统，菌体破碎离心，使用镍柱进行分离纯化。纯化后的蛋白质使用12％的聚丙烯酰胺凝胶进行定量分析。然后将纯化得到的蛋白质分装冷冻干燥-80℃保存(避免反复冻融导致蛋白质降解)。
实施例2：羊驼免疫及取血
我们共对羊驼进行四次免疫，用HBV-preS1免疫羊驼(Alpaca)，注射位置为羊驼的颈部***处，在羊驼颈部左右两个***各注射一半样品，操作过程中应注意全程低温保存蛋白质和佐剂，避免反复冻融导致的蛋白质降解。
初次免疫剂量为200ug与完全弗氏佐剂混合，第2周加强免疫，用100ugHBV-preS1与不完全弗氏佐剂混合，第6周加强免疫，用100ugHBV-preS1与不完全弗氏佐剂混合，第10周加强免疫，用100ugHBV-preS1与不完全弗氏佐剂混合。每次免疫前取血10ml，EDTA抗凝，分别分离血浆及PBMC。
第四次免疫后，对羊驼进行取血40ml，每次每只羊驼取，从颈部静脉取血。本实验选用10ml的抗凝采血管，如果血液样品需要放置超过2小时再进行下一步操作，则每管放置的血液样品应不超过5ml；如果血液样品在2小时内及时进行下一步操作，则每管放置的血液样品不超过8ml。每次抽血进入抗凝管时，需立即颠倒数次混匀，以免混合不均匀导致凝血反应。
实施例3：羊驼淋巴细胞PBMC的分离
新鲜的血液样品应保存于18-20℃之间，取血后2-6小时内(最好是在2小时内)应尽快完成淋巴细胞的分离。淋巴细胞分离的步骤如下：1)将Histopaque-1077淋巴细胞分离液提前一天从4℃冰箱中取出，放置至室温。2)取5ml室温下的Histopaque-1077淋巴细胞分离液至15ml离心管中，取8ml全血小心缓慢地加到Histopaque-1077淋巴细胞分离液的液面上方。3)400g，20℃，升速为0，降速为0，离心30分钟。离心后的样品应该分为四层，从上至下分别为血清、淋巴细胞、淋巴细胞分离液中的葡聚糖和红细胞。小心吸取第二层浑浊层的单核细胞，避免吸到下层液体。将吸取到的单核细胞转移至新的15ml离心管中，并取上层血清分装至1.5ml离心管中，-80℃长期保存。4)加入10ml室温的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)，轻柔颠倒混匀，250g，20℃离心10分钟。5)移除上清，保留沉淀。加入5ml室温的PBS，将细胞重悬，轻柔混匀，250g，20℃，离心10分钟。6)移除上清，保留沉淀，尽可能地移除所有PBS，否则会使后续步骤中裂解液中产生云雾状沉淀。7)加冻存液悬浮细胞，液氮冻存备用。
实施例4：文库构建
Total RNA提取
1.提取total RNA
A、收集羊驼外周血50mL，采用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞。B、采用Trizol提取total RNA。C、紫外分光光度计检测RNA 6711结果为：OD260/280＝1.99，OD260/230＝1.43，明RNA没有明显降解，纯度尚可；total RNA浓度为809.3ng/μL。琼脂糖凝胶电泳可以看到28S和18S两条带。
2.RT-PCR
反转录体系如下：Oligo dT(2.5μM)1μL，dNTP(10mM each)1μL，Total RNA2.428μg，H2O Up to 10μL。混匀后，65℃保温5min，迅速冰浴；Step 2，Step1反应液10μL，5×PrimeScript Buffer4μL，RNaseinhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScript RTase(200U/μL)0.5μL，RNase free H2O Up to 20μL。混匀后，按如下条件反转录：42℃，30min；50℃，15min；70℃，15min.
3.VHH基因扩增(巢式PCR)
采用巢式PCR扩增VHH基因，PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化浓缩后，再采用DNA产物凝胶回收试剂盒回收～750bp条带，紫外分光光度计定量；PCR产物采用DNA产物凝胶回收试剂盒回收，紫外分光光度计定量。采用巢式PCR扩增VHH基因，结果如图1所示，最终得到约500bp的目的基因VHH，采用PCR产物凝胶回收试剂盒回收VHH。
实施例5：文库转化
将目的基因VHH和载体pHEN1采用SfiI和Not1双酶切，结果如图2所示，将酶切后的VHH和pHEN1采用T4DNA连接酶连接后，转化至TG1电穿孔感受态细胞中，构建VHH基因文库。共转化15次，混合后均匀涂布于6块Ф150mm的培养皿中。同时分别取0.1μL，0.01μL，0.001μL和0.0001μL混合后的转化液均匀涂布于Ф90mm的培养皿，用于文库库容量的计算，计算库容量为1.395×108cfu。在上述用于计算库容量的培养皿中随机挑选48个菌落，进行菌落PCR，测算文库的目的基因***率，文库***率为100％，文库实际库容量为1.395×108cfu。另随机挑选36个菌落扩增后测序，分析序列多样性，将DNA序列翻译成氨基酸序列，进行序列比对及预测功能分区，结果如图3所示。
实施例6：文库救援
从上述基因文库中取10-100倍库容量的活细胞进行接种培养，培养至对数期后采用M13K07噬菌体进行救援，救援培养后，离心收集噬菌体，采用PEG-NaCl纯化噬菌体，即得噬菌体展示文库，滴度为3.4×1013cfu/mL。可直接用于后续特异性噬菌体的亲和筛选。
实施例7：特异性纳米抗体筛选
我们选用亲和素磁珠方法筛选，将表达纯化的HBV-preS1用生物素标记，将标记后的抗原与噬菌体库混合，然后再加入亲和素磁珠。由于第一轮筛选后，我们将筛选到的噬菌体进行了扩增，理论上来讲，带有正确Flag抗体的噬菌体得到了富集，在第二轮筛选后，应得到比第一轮更多的阳性。接下来我们将第二轮筛选中洗脱得到的噬菌体进行扩增，重新加入辅助噬菌体进行救援，随后继续进行第三轮筛选。噬菌体。经过3轮筛选，得到高滴度的噬菌体。
我们使用ELISA实验来进一步对磁珠筛选所获的噬菌体选取不同的单克隆，进行性质上的筛选。我们将抗原包被在酶联板条上，加入纳米抗体溶液孵育，使之与抗原结合。随后使用鼠源的Anti-M13p III单克隆抗体来与纳米抗体中的VHH-p III融合蛋白结合，并用标记了碱性磷酸酶(AP)的羊抗鼠抗体作为二抗，使用p NPP作为底物进行显色。ELISA实验的显色结果，以及使用酶标仪测定的反应体系在波长为450mm时的吸光值数据
实施例8：筛选得到的纳米抗体测序
我们将ELISA实验中发生较明显显色反应的孔对应的菌液送测，Sanger测序服务由广州艾基生物技术有限公司提供。筛选得到的序列，如图4。
实施例9：筛选得到的纳米抗体显著降低HBV转基因小鼠血清HBsAg水平
将筛选得到的抗HBV-preS1纳米抗体通过尾静脉注射的方式达到HBV转基因小鼠体内，采用抗GFP纳米抗体作为对照组。检测小鼠血清HBsAg、HBeAg水平和肝内HBV-preS1、HBV复制水平，结果显示，抗HBV-preS1纳米抗体与对照组相比抗HBV-preS1纳米抗体治疗组能够显著降低小鼠血清HBsAg水平，如图5。
实施例10：筛选得到的纳米抗体显著降低HBV转基因小鼠血清HBeAg水平
将筛选得到的抗HBV-preS1纳米抗体通过尾静脉注射的方式达到HBV转基因小鼠体内，采用抗GFP纳米抗体作为对照组。检测小鼠血清HBsAg、HBeAg水平和肝内HBV-preS1、HBV复制水平，结果显示，抗HBV-preS1纳米抗体与对照组相比抗HBV-preS1纳米抗体治疗组能够显著降低小鼠血清HBeAg水平，如图6。
实施例11：筛选得到的纳米抗体显著降低HBV转基因小鼠血清HBV的DNA水平水平
将筛选得到的抗HBV-preS1纳米抗体通过尾静脉注射的方式达到HBV转基因小鼠体内，采用抗GFP纳米抗体作为对照组。检测小鼠血清HBsAg、HBeAg水平和肝内HBV-preS1、HBV复制水平，结果显示，抗HBV-preS1纳米抗体与对照组相比抗HBV-preS1纳米抗体治疗组能够显著降低小鼠血清HBV的DNA水平，如图7。
实施例12：筛选得到的纳米抗体对肝癌有治疗效果
将整合有HBV基因组的小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞接种到小鼠皮下，制作体内肝癌成瘤模型。分别将筛选得到的抗HBV-preS1纳米抗体通过尾静脉注射的方式达到HBV转基因小鼠体内，采用抗GFP纳米抗体作为对照组。检测肝癌细胞肿瘤体积，结果显示，抗HBV-preS1纳米抗体与对照组相比，抗HBV-preS1纳米抗体治疗组能够显著抑制肝癌细胞生长，肿瘤体积明显小于对照组，对肝癌治疗有显著效果，如图8。
SEQ ID NO：1
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GFIFSIYV
SEQ ID NO：2
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GFISSIYD
SEQ ID NO：3
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GFTFSSYS
SEQ ID NO：4
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GSIFSRYT
SEQ ID NO：5
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GVMFSIYD
SEQ ID NO：6
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GFTLDYYG
SEQ ID NO：7
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GSVFSRYT
SEQ ID NO：8
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GFTFSTYS
SEQ ID NO：9
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GNIFSRYT
SEQ ID NO：10
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GRIFSRYT
SEQ ID NO：11
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GSIFSRYV
SEQ ID NO：12
Anti-HBV-prS1 VHH CDR1
GFILSIYT
SEQ ID NO：13
Anti-HBV-prS1 VHH CDR2
INNIGTT
SEQ ID NO：14
Anti-HBV-prS1 VHH CDR2
IGRGGRYT
SEQ ID NO：15
Anti-HBV-prS1 VHH CDR2
IVSNVGGG
SEQ ID NO：16
Anti-HBV-prS1 VHH CDR2
ITSGVST
SEQ ID NO：17
Anti-HBV-prS1 VHH CDR2
IGRGGGT
SEQ ID NO：18
Anti-HBV-prS1 VHH CDR2
TNNIGTT
SEQ ID NO：19
Anti-HBV-prS1 VHH CDR2
ITSGGST
SEQ ID NO：20
Anti-HBV-prS1 VHH CDR2
ISGVGGRT
SEQ ID NO：21
Anti-HBV-prS1 VHH CDR2
ISSSGGST
SEQ ID NO：22
Anti-HBV-prS1 VHH CDR3
SCKAYQTLEDGLGPGVLEY
SEQ ID NO：23
Anti-HBV-prS1 VHH CDR3
RYYRSDDDFPEYAQDY
SEQ ID NO：24
Anti-HBV-prS1 VHH CDR3
RYYRSDDDFPEHAYEY
SEQ ID NO：25
Anti-HBV-prS1 VHH CDR3
KAYQTLEDGLGPGVLEY
SEQ ID NO：26
Anti-HBV-prS1 VHH CDR3
RYYRSDDDFPEYAYDY
SEQ ID NO：27
Anti-HBV-prS1 VHH CDR3
AARKNNYYCSGYLSSGGARHDY
SEQ ID NO：28
Anti-HBV-prS1 VHH CDR3
VYYCNADFGLGL
SEQ ID NO：29
Anti-HBV-prS1 VHH CDR3
NALFGIDGL
SEQ ID NO：30
Anti-HBV-prS1 VHH CDR3
HADFGLDGL