阅读说明：本技术 双酶响应性哑铃形超两亲分子及其制备方法和用途 (Double-enzyme responsive dumbbell-shaped super-amphiphilic molecule and preparation method and application thereof ) 是由 毕韵梅 危俊吾 林峰 游丹 钱杨杨 王雨佳 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：双酶响应性哑铃形超两亲分子及其制备方法和用途,属于功能高分子材料领域。产品的分子结构如下：<Image he="654" wi="700" file="DDA0002206071900000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>式<Sup>+</Sup>H<Sub>3</Sub>N-G<Sub>3</Sub>-b-PNVP-b-G<Sub>3</Sub>-NH<Sub>3</Sub><Sup>+</Sup>中n＝40～80。经多个步骤制得的产品用于在水溶液中自组装形成球形胶束,用胶束包载小分子或药物,特别适用于抗癌药物的靶向快速释放,能避免对药物产生污染对和残留物对机体产生危害。(A double-enzyme responsive dumbbell-shaped super-amphiphilic molecule, a preparation method and application thereof, belonging to the field of functional polymer materials. The molecular structure of the product is as follows: formula (II) + H 3 N‑G 3 ‑b‑PNVP‑b‑G 3 ‑NH 3 + Wherein n is 40 to 80. The product prepared through multiple steps is used for self-assembling in an aqueous solution to form spherical micelles, and the micelles are used for encapsulating small molecules or drugs, so that the product is particularly suitable for targeted rapid release of anticancer drugs, and can avoid pollution to the drugs and harm to organisms caused by residues.)

双酶响应性哑铃形超两亲分子及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于功能高分子材料领域，具体涉及对两种酶有响应特性的、以聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PNVP)为线形链、以苯丙氨酰-赖氨酸二肽为树枝化基元的哑铃形(树枝状-线形-树枝状)杂化嵌段共聚物和三磷酸腺苷复合的超两亲分子、其制备方法和用途。

背景技术

超两亲分子是通过非共价键作用如静电吸引、氢键、主客体相互作用等将亲水部分与疏水部分结合形成的两亲性分子。在超两亲分子中，构筑基元通过非共价键相互作用连接，可有效的避免其它繁琐的化学合成反应，使构筑基元利用率得到极大提高。而且在非共价键存在下，其他功能基元能更方便的引入其中。此外，非共价键还具有良好的可逆性和可控性。因此可通过外界刺激响应来实现其两亲性的调控，获得可控的自组装与解组装。由超两亲分子自组装形成的具有刺激响应性的纳米药物转运体系由于其能够有效提高药物的生物利用率、延长药物在血液中的循环和滞留时间、增加体系的稳定性等优点,近年来在以恶性肿瘤为代表的疾病的治疗和研究领域倍受关注。按构成结构来分，超两亲分子可分为小分子型超两亲分子和高分子型超两亲分子。目前，构成高分子型超两亲分子的聚合物多为线形高分子，文献检索未见基于哑铃形(树枝状-线形-树枝状)杂化嵌段共聚物的超两亲分子的文献报道。

树枝状-线形-树枝状(哑铃形)三嵌段共聚物将线性高分子的易于合成和可加工性与规则和结构明确的树枝状大分子(基元)相结合，由于树枝状大分子具有确切数量的***基团，可以对其进行修饰以引入功能性。两亲性树枝状-线形-树枝状(哑铃形)三嵌段共聚物在水溶液中自组装形成纳米容器，可以包封和释放药物分子。在药物输送系统中，与仅由两亲性线形嵌段共聚物或树枝状大分子形成的组装体相比，使用两亲性树枝状-线形-树枝状(哑铃形)三嵌段共聚物自组装形成的聚集体作为载体的优点是它们将树枝状大分子赋予的多官能团性与嵌段共聚物的高负载能力相结合，这不仅提高了自组装聚集体在水溶液中的稳定性，并且可以通过分子设计以优化共聚物药物载体的载药量和调控药物的释放率。

酶响应性聚合物因其优异的生物相容性和高选择性而成为靶向药物递送系统极具前景的载体，因为一些酶经常在发炎或肿瘤组织中过度表达，在药物载体中引入能被特异性酶切断的化学键，可实现药物的靶向释放，这在减少对健康细胞和组织的危害方面具有重要意义。并且根据特定区域中酶的表达水平，通过调整酶响应性聚合物的结构可以控制负载药物的释放速率。此外，酶响应性聚合物在体内长期循环和靶向治疗以及疾病诊断方面也具有潜在的应用价值。可是尽管已经研究了一些酶响应性非线形聚合物，但它们都只能对一种酶作出响应，而人体内生物环境复杂，一些疾病可能与不止一种酶的表达紊乱有关，例如，已报道的在肿瘤细胞中高表达的酶就有基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶(Cathepsin B)和碱性磷酸酶等。如果能设计合成对两种或多种酶具有响应性的非线形聚合物，则可望获得更适合体内生理环境的药物载体。

基于氨基酸的聚合物由于其优异的生物相容性和良好的生物降解性而在药物和其他医学应用中受到相当大的关注。L-赖氨酸已被广泛用作构建用于生物医学应用(如药物传递、组织工程和基因治疗)的具有支化结构的聚合物。但是，含有氨基酸的酶响应性树枝状-线形-树枝状(哑铃形)三嵌段共聚物尚未见文献报道。另一方面，一些由几种不同氨基酸组成的小肽可被与肿瘤相关的细胞外蛋白酶(如基质金属蛋白酶)或溶酶体半胱氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶B和胰蛋白酶)裂解。胰蛋白酶，以前认为是由胰腺腺泡细胞产生的消化酶已被证实在多种癌症中表达，并被认为与肿瘤增殖、侵袭和转移有关，而胰蛋白酶仅在赖氨酸或精氨酸的C-末端起到酶解作用。三磷酸腺苷(ATP)作为一种人体内重要的能量分子，带有四个负电荷，能够通过静电作用力和正离子复合。在碱性磷酸酯酶的作用下，ATP中的磷酸键能够被酶解，从而导致复合物的裂解。ATP可以与带有正电荷的聚合物形成超两亲分子，目前基于ATP的超两亲分子的研究多集中在线形聚合物方面，文献检索未见ATP与树枝状-线形-树枝状(哑铃形)嵌段共聚物复合形成超两亲分子的文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种双酶响应性哑铃形超两亲分子及其制备方法和用途，具体说就是提供一种对胰蛋白酶或组织蛋白酶B和碱性磷酸酶(CIAP)有响应的，以苯丙氨酰-赖氨酸二肽为树枝化基元的哑铃形(树枝状-线形-树枝状)嵌段共聚物和三磷酸腺苷(ATP)的超两亲分子、其制备方法和用途。

本发明产品双酶响应性哑铃形超两亲分子，其特征在于由第三代以苯丙氨酰-赖氨酸二肽为树枝化基元、以聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PNVP)为线形链的哑铃形(树枝状-线形-树枝状)嵌段共聚物⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺和三磷酸腺苷复合形成，

⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺的分子结构如下：

式⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺中n＝40～80。

本发明产品双酶响应性哑铃形超两亲分子的制备方法是按如下步骤：

1、制备具有α,ω-双末端黄原酸酯基的链转移剂CTA

按现有技术(例如可参照文献Taton D,Wilczewska A,DestaracM.Macromol.Rapid Commun.2001,22(18):1497-1503)，首先用乙二醇与2-溴丙酰溴反应制备具有α,ω-双末端溴代丙酸酯，再用α,ω-双末端溴代丙酸酯与O-乙基黄原酸钾反应，制备具有α,ω-双末端黄原酸酯基的链转移剂CTA。CTA的分子结构如下：

2、制备具有α,ω-双末端黄原酸酯基的双聚(N-乙烯基吡咯烷酮)

按现有技术(例如可参照文献Wan D,Satoh K,Kamigaito M,OkamotoY.Macromolecules,2005,38(25),10397-10405)，以偶氮二异丁腈为引发剂，用具有α,ω-双末端黄原酸酯基的链转移剂CTA调控N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的可逆加成-断裂链转移自由基(RAFT)聚合，制备α,ω-双末端黄原酸酯基的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)X-PNVP-X。X-PNVP-X的分子结构如下：

3、制备(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯

按现有技术(例如可参照文献Hobson L J,Feast W J.Polymer,1999,40(5):1279–1297)，以三乙胺为缚酸剂，用(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯与丙烯酰氯反应制备(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯。(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯的分子结构如下：

4、制备BocNH-PNVP-NHBoc

在反应容器中加入X-PNVP-X、二氯甲烷、正丁胺，其中X-PNVP-X和正丁胺的物质的量比为1:80～120，每mL二氯甲烷中溶有2～4g的X-PNVP-X，按物质的量计再加入占前述三者总量0.1％～0.5％的三丁基膦，抽真空充氮气5～20min，加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)和(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯，其中X-PNVP-X、(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯和三(2-羧乙基)膦的物质的量比为1:1.5～2.5:2～4，搅拌反应4～8h。最好用干燥的反应容器进行上述反应。粗产物用石油醚共沉淀2～5次，去离子水中透析2～4天，冷冻干燥得BocNH-PNVP-NHBoc。BocNH-PNVP-NHBoc的分子结构如下：

5、制备NH₂-PNVP-NH₂

在反应容器中加入BocNH-PNVP-NHBoc、二氯甲烷和三氟乙酸，其中每mL二氯甲烷中溶有0.01～0.05mmol的BocNH-PNVP-NHBoc，三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为1:1～3，搅拌反应2～6h，用1～2mol/L的NaOH调节pH至中性，过滤，旋蒸，在去离子水中透析2～4天，冷冻干燥得NH₂-PNVP-NH₂。NH₂-PNVP-NH₂的分子结构如下：

6、制备(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)

在反应瓶中加入NH₂-PNVP-NH₂、1-羟基苯并***、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，其中NH₂-PNVP-NH₂、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸和1-羟基苯并***的物质的量比为1:1.5～3.5:4～8，每mL的DMF中溶有0.01～0.03mmol的NH₂-PNVP-NH₂，搅拌20～60分钟后，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，NH₂-PNVP-NH₂和N,N-二异丙基碳二亚胺的物质的量比为1:5～10，搅拌反应20～48h后，加入冷***沉淀，去离子水中透析2～4天，冷冻干燥得(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)。(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)的分子结构如下：

7、制备(H₂N-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NH₂)

在反应瓶中加入(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)、4-甲基哌啶和DMF，其中(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)和4-甲基哌啶的物质的量比为1:6～10，4-甲基哌啶和DMF的体积比为1:3～6，每mL 4-甲基哌啶和DMF混合液中含有0.01～0.04mmol的(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)，搅拌反应20～60min，加入冷***沉淀，去离子水中透析2～4天，冷冻干燥得(H₂N-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NH₂)。(H₂N-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NH₂)的分子结构如下：

8、制备FmocNH-G₁-b-PNVP-b-G₁-NHFmoc

在反应瓶中加入(H₂N-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NH₂)、1-羟基苯并***(HOBt)、N,N'-双芴甲氧羰基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，其中(H₂N-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NH₂)、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH和HOBt的物质的量比为1:5～8:2～4，每mL的DMF中溶有0.01～0.03mmol的(H₂N-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NH₂)，搅拌20～60min后，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，(H₂N-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NH₂)和DIC的物质的量比为1:5～10，搅拌反应20～48h后，加入冷***沉淀，去离子水中透析2～4天，冷冻干燥得G₁-b-PNVP-b-G₁。G₁-b-PNVP-b-G₁的分子结构如下：

9、制备NH₂-G₁-b-PNVP-b-G₁-NH₂

在反应瓶中加入(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)、4-甲基哌啶和DMF，其中(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)和4-甲基哌啶的物质的量比为1:6～10，4-甲基哌啶和DMF的体积比为1:3～6，每mL 4-甲基哌啶和DMF混合液中含有0.01～0.04mmol的(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)，搅拌反应20～60min，加入冷***沉淀，去离子水中透析2～4天，冷冻干燥得(H₂N-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NH₂)。

10、制备FmocNH-G₂-b-PNVP-b-G₂-NHFmoc

用步骤9得到的NH₂-G₁-b-PNVP-b-G₁-NH₂代替步骤6中的NH₂-PNVP-NH₂，重复步骤6、7、8、9，得到FmocNH-G₂-b-PNVP-b-G₂-NHFmoc。FmocNH-G₂-b-PNVP-b-G₂-NHFmoc的分子结构如下：

11、制备FmocNH-G₃-b-PNVP-b-G₃-NHFmoc

用步骤10得到的FmocNH-G₂-b-PNVP-b-G₂-NHFmoc代替步骤9中的FmocNH-G₁-b-PNVP-b-G₁-NHFmoc，重复步骤9、10，得到FmocNH-G₃-b-PNVP-b-G₃-NHFmoc。FmocNH-G₃-b-PNVP-b-G₃-NHFmoc的分子结构如下：

12、制备双酶响应性超两亲分子

在反应瓶中加入FmocNH-G₃-b-PNVP-b-G₃-NHFmoc、4-甲基哌啶和DMF，其中FmocNH-G₃-b-PNVP-b-G₃-NHFmoc和4-甲基哌啶的物质的量比为1:18～20，4-甲基哌啶和DMF的体积比为1:3～6，每mL 4-甲基哌啶和DMF混合液中含有0.005～0.008mmol的FmocNH-G₃-b-PNVP-b-G₃-NHFmoc，搅拌反应20～60min，后，加入冷***沉淀，去离子水中透析2～4天，冷冻干燥得H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂。

以pH 6.5的缓冲溶液为溶剂，分别配制ATP溶液和H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂溶液，其中H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂溶液和ATP溶液的物质的量浓度比为1:15～25。由于1moL⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺(在pH 6.5的缓冲溶液中，H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂实际上已成为⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺)带16个正电荷，而1moL ATP带4个负电荷，按一定比例将上述配制的ATP溶液滴入H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂溶液，使⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺与ATP的电荷比N＝1:4。静置4～10h，制得双酶响应性哑铃形超两亲分子。

上述步骤中的过滤，透析，冷冻干燥等工序同常规技术。

本发明中，H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂在pH 6.5的缓冲溶液中质子化成⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺与带负电荷的ATP复合形成双酶响应性哑铃形超两亲分子，超两亲分子的形成可以通过¹H NMR谱、紫外光谱、荧光光谱、粒径测定、Zate电位测定、透射电镜(TEM)进行检测。

本发明双酶响应性哑铃形超两亲分子的用途：用于在水溶液中自组装形成球形胶束，用胶束包载小分子或药物。

本发明的有益效果：本发明制备的第三代以苯丙氨酰-赖氨酸二肽为树枝化基元的哑铃形(树枝状-线形-树枝状)嵌段共聚物⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺和三磷酸腺苷(ATP)复合形成的超两亲分子在水溶液中能自组装形成球形胶束，该胶束能包载小分子或药物，并能在胰蛋白酶(Trypsin)或组织蛋白酶B(Cathepsin B)或牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)作用下实现对负载的小分子或药物的可控释放；并且当两种酶(Trypsin和CIAP，或Cathepsin B和CIAP)同时存在时，小分子或药物的释放速率大大加快，即该超两亲分子具有双酶响应性。本发明研制的哑铃形超两亲分子结构中，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PNVP)为亲水性线形链、两头的苯丙氨酰-赖氨酸二肽树枝化基元末端氨基正离子与ATP复合后形成了两亲性的超两亲分子，本发明采用了活性/可控聚合中的可逆加成-断裂链转移自由基(RAFT)聚合制备聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PNVP)，PNVP线形链的长度是可以改变的，从而可以通过改变聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PNVP)线形链的长度来调节超两亲分子的两亲性。组织蛋白酶B、胰蛋白酶和碱性磷酸酶(CIAP)在一些肿瘤组织中过度表达，因此，本发明研制的超两亲分子可用于抗癌药物的靶向释放。而且，传统的由化学键形成的酶响应性两亲分子对所负载药物的释放一般在24～48小时后完成，而超两亲分子组装体在几小时内就达到对负载药物的完全释放，特别适用于抗癌药物的靶向快速释放。传统化学键形成的酶响应性两亲分子载药体系的制备通常需要有机溶剂的诱导等，不仅对药物产生污染而且残留物会对机体产生危害。而本发明研制的超两亲分子组装体载药体系的形成，只需要加入⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺、药物和ATP即可形成载药组装体，能够成功避免这些污染和危害。

附图说明

图1为实施例的超两亲分子在水溶液中自组装形成的胶束的透射电镜(TEM)图像。

图2为实施例的超两亲分子载荧光小分子胶束在未加入酶(no Trypsin andCIAP)、加入胰蛋白酶(With Trypsin)、加入碱性磷酸酶(With CIAP)、加入胰蛋白酶和碱性磷酸酶(With Trypsin and CIAP)后的释放曲线。

具体实施方式

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

在干燥的三口烧瓶中，加入0.56mL乙二醇、30mL无水THF和5mL三乙胺，在冰水浴中滴加30mL溶有3.2mL溴代异丙酰溴的无水THF溶液，滴完，室温下搅拌24h。加入二氯甲烷搅拌过滤，滤液经10％HCl、饱和Na₂CO₃水溶液和100mL去离子水洗涤后，有机相用无水MgSO₄干燥，旋蒸除去溶剂得到具有α,ω-双末端溴代丙酸酯。将其溶入20mL乙醇，加入4.82g的2-乙基黄原酸钾，搅拌16h，抽滤，滤液用30mL乙酸乙酯稀释，用20mL去离子水洗涤3次。有机相用无水硫酸镁干燥，旋蒸溶剂。粗产物用乙酸乙酯与石油醚体积比为1:4的混合溶剂为洗脱剂进行柱色谱纯化，得到具有α,ω-双末端黄原酸酯基的链转移剂CTA，产率68.5％。

将NVP(2.2g)、链转移剂CTA(41.5mg)、AIBN(6.6mg)加入聚合瓶中，抽真空、充氮气3次后再抽真空通入氮气，60℃聚合18h。用二氯甲烷溶解，再用乙酸乙酯反复共沉淀，透析48h，冷冻干燥，得具有α,ω-双末端黄原酸酯基的双聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(X-PNVP-X)，产率为66％。

在三颈瓶中加入1mL(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯、0.6mL三乙胺、5mL THF，置于冰水浴中，搅拌下滴入2mL溶有0.25mL丙烯酰氯的THF溶液，室温搅拌4h。过滤，蒸出溶剂，加入乙酸乙酯溶解，用1M柠檬酸、1M氢氧化钠溶液及饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸，用石油醚重结晶得(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯，产率57.2％。

在反应瓶中加入0.1mmol的X-PNVP-X和5mL CH₂Cl₂，搅拌溶解，氮气保护下，加入正丁胺(1mL，10.1mmol)和微量的三丁基膦，抽真空充氮气5min，加入TCEP(0.086g，0.3mmol)和(2-丙烯酰氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.042g，0.2mmol)，搅拌反应6h。加入石油醚共沉淀，并在去离子水中透析72h，冷冻干燥得BocNH-PNVP-NHBoc，产率87.8％。

将0.1mmol的BocNH-PNVP-NHBoc溶解于3mL二氯甲烷中，加入3mL三氟乙酸，搅拌反应4h，用1mol/L的NaOH调节pH至7～8，过滤，旋蒸除去溶剂，在去离子水中透析72h，冷冻干燥得NH₂-PNVP-NH₂，产率92.1％。

将0.1mmol NH₂-PNVP-NH₂溶解于5mL DMF中，加入0.24g(0.6mmol)N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸、27mg(0.2mmol)1-羟基苯并***(HOBt)，搅拌30min后，加入0.12mL(0.8mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，搅拌反应24h。加入冷***沉淀，在去离子水中透析72h，冷冻干燥得(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)，产率89.2％。

将0.1mmol的(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)溶于5mL的4-甲基哌啶和DMF混合溶液(4-甲基哌啶与二甲基甲酰胺的体积比为1:4)，搅拌反应30min，用冷***沉淀，在去离子水中透析72h，冷冻干燥得(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)，产率86.6％。

在反应瓶中加入(FmocNH-Phe)-b-PNVP-b-(Phe-NHFmoc)(0.10mmol)，0.36gFmoc-Lys(Fmoc)-OH和27.02mg HOBt和5mL DMF，搅拌30min后，加入0.12mL DIC，反应24h，加入冷***沉淀，在去离子水中透析72h，冷冻干燥得FmocNH-G₁-b-PNVP-b-G₁-NHFmoc，产率85.8％。

将0.1mmol的FmocNH-G₁-b-PNVP-b-G₁-NHFmoc溶于5mL的4-甲基哌啶和DMF混合溶液(4-甲基哌啶与二甲基甲酰胺的体积比为1:4)，搅拌反应30min，用冷***沉淀，在去离子水中透析72h，冷冻干燥得NH₂-G₁-b-PNVP-b-G₁-NH₂，产率87.9％。

用NH₂-G₁-b-PNVP-b-G₁-NH₂代替上述实验中的NH₂-PNVP-NH₂，重复上面的步骤进行实验，得到FmocNH-G₂-b-PNVP-b-G₂-NHFmoc。

用FmocNH-G₂-b-PNVP-b-G₂-NHFmoc代替上述实验中的FmocNH-G₁-b-PNVP-b-G₁-NHFmoc，重复上面的步骤进行实验，得到FmocNH-G₃-b-PNVP-b-G₃-NHFmoc。

将0.1mmol FmocNH-G₃-b-PNVP-b-G₃-NHFmoc溶于15mL 4-甲基哌啶和DMF的混合溶液(v:v＝1:4)。搅拌反应30min，用冷***沉淀，在去离子水中透析72h，冷冻干燥得到H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂，产率83.1％。

用凝胶渗透色谱(GPC)测定H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂的数均分子量(M_n)为22810g/mol，分子量分布(PDI)为1.113。

用核磁共振氢谱(¹HNMR)测定H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂的结构，其¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δ):1.06(s),1.42-1.73(br),1.75-1.98(br),1.98-2.40(br),2.79-3.30(br),3.47-4.06(br),4.06-4.43(br),4.51(br),5.55-5.63(br),7.15-7.26(m).

以2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH 6.5)为溶剂，分别配制0.05mmol/LH₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂溶液和1mmol/L ATP溶液，按一定比例，将ATP溶液滴加入H₂N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₂溶液，使⁺H₃N-G₃-b-PNVP-b-G₃-NH₃ ⁺与ATP的电荷比N＝1:4。静置6h，得到双酶响应性哑铃形超两亲分子。

超两亲分子的形成通过¹H NMR谱、紫外光谱、荧光光谱、粒径测定、Zate电位测定、透射电镜(TEM)进行检测。

将1滴上面得到的哑铃形超两亲分子溶液滴在碳膜铜网上，室温下晾干，进行透射电镜(TEM)观测，从图1中可以看出哑铃形超两亲分子在水溶液中自组装为球形胶束。

取20mL上面得到的哑铃形超两亲分子溶液，加入1mL三磺酸羟基芘(HPTS)溶液(1×10^-3mol/L)，搅拌2h，透析。将此溶液分成四份(每组5mL)，在其中三份中分别加入牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)、胰蛋白酶(Trypsin)、碱性磷酸酶(CIAP)和胰蛋白酶(Trypsin)，其中CIAP的终浓度为0.15U/mL，胰蛋白酶的终浓度为80U/mL；另一份空白液作为对照。分别透析，每间隔10min测定透析液的荧光强度，检测两种酶使超两亲分子对HPTS的可控释放。以透析时间为横坐标、释放率为纵坐标得到图2。从图2可以看出，当加入Trypsin或CIAP后，哑铃形超两亲分子对HPTS的释放速率明显增加，当同时加入Trypsin和CIAP后，哑铃形超两亲分子对HPTS的释放速率更快。

用组织蛋白酶B(Cathepsin B)代替上面实验中的胰蛋白酶(Trypsin)，重复上面的步骤进行实验，结果表明，当加入Cathepsin B或CIAP后，与未加酶的样品对照，哑铃形超两亲分子对HPTS的释放速率明显增加；当同时加入Cathepsin B和CIAP后，哑铃形超两亲分子对HPTS的释放速率更快。