阅读说明：本技术 一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法 (Kit and method for detecting candida krusei nucleic acid ) 是由 郑锐 金明兰 张洪涛 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法,其包括微流控芯片,所述微流控芯片包括芯片反应池,所述芯片反应池内包被固定有引物组,所述引物组包含克柔念珠菌的至少两个不同基因位点的特异性引物组。本发明提供的检测试剂盒和检测方法可检出的克柔念珠菌具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点,同时,还有试剂消耗量小,污染小等优点,该实验全程为闭盖式反应,减少了污染的可能性,成本低、且便携。(The invention provides a kit and a detection method for candida krusei nucleic acid detection, which comprises a microfluidic chip, wherein the microfluidic chip comprises a chip reaction tank, a primer group is coated and fixed in the chip reaction tank, and the primer group comprises specific primer groups of at least two different gene loci of candida krusei. The candida krusei detectable by the detection kit and the detection method provided by the invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity, convenience, rapidness, wide application range and the like, and simultaneously has the advantages of small reagent consumption, small pollution and the like.)

一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法。

背景技术

念珠菌分布广泛，人体内念珠菌多寄生于皮肤、口腔、呼吸道和下尿道等部位，在人体抵抗力下降时，可引起皮肤、粘膜和深部器官的感染。可引起人类疾病的至少有17种念珠菌，其中白色念珠菌引起的感染最常见，但是近年来，随着器官移植，免疫抑制剂、广谱抗生素以及糖皮质激素的应用日益增多，临床常见念珠菌菌谱已经发生了变化，克柔念珠菌等非白念珠菌感染越来越多见。克柔念珠菌是常见的非白色念珠菌，广泛存在于自然界中，尤其多见于奶制品和容易发酵的食物。常见病症包括肺部念珠菌感染，泌尿系念珠菌感染，腹腔念珠菌感染和念珠菌血症等。临床常规的血液等生化指标分析仅能初步判断病因，无法确定病原菌的种属。

目前临床上对病原菌鉴定的方法主要是培养法。其主要步骤取样、培养、鉴定。培养法本身存在较多缺陷，不能满足临床需要。首先培养法检测耗时长，培养时间与所感染的微生物种类有关，至少用时2-3天，真菌更长，当临床出现急性病症时，培养法无法适用；其次该方法准确性低，尤其是批量鉴定时，样品之间很容易交叉污染；再次受国内实验室安全防护条件的限制，实验室工作人员在分离培养病原菌时存在着高风险被感染的可能；最后培养法对实验条件要求较高，需要的培养基种类较多，乡镇医院、社区医疗单位和户外等均无法使用细菌培养的检测方法，很容易对病人造成贻误。对于普通PCR(Polymerase ChainReaction，聚合酶链式反应)技术鉴定病原微生物的方法，因其检测基因位点单一，而病原菌的基因有多态性和可变异性，在检测准确性方面有一定的弊端。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法，同时检测克柔念珠菌的多个基因位点，检测迅速。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒，其包括微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有引物组，所述引物组包含克柔念珠菌的至少两个不同基因位点的特异性引物组。其中，引物组的引物与所述靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补。

采用本发明的技术方案，基因位点的检测通过包被固定在芯片反应池中的引物组来实现，本发明的技术方案结合了核酸扩增技术和微流控芯片技术，同时检测克柔念珠菌的多个基因位点，特异性好，灵敏度高，操作简单，检测迅速。

作为本发明的进一步改进，所述微流控芯片内设有对照组，所述微流控芯片包括进样孔、反应孔和出气孔。

作为本发明的进一步改进，所述对照组包括扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。所述的扩增对照使用与克柔念珠菌无关的DNA片段为模板扩增、空白对照无引物组、提取对照使用提取质控菌核酸为模板扩增。设置了内对照，可有效质控产品使用的整个过程。

作为本发明的进一步改进，所述克柔念珠菌的至少两个不同基因位点包括cytb基因、ITS基因、ERG11基因中的至少两个。

作为本发明的进一步改进，所述引物组包括cytb基因位点引物组、ITS基因位点引物组、ERG11基因位点引物组；

所述cytb基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.1～5的引物，所述ITS基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.6～10的引物，所述ERG11基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.11～16的引物。

作为本发明的进一步改进，试剂盒包括核酸扩增反应液，所述核酸扩增反应液包括10×Thermomal Buffer，MgSO4 2-10mmol/L，BSA 0.2-2mg/ml，dATP 0.2-3mmol/L，dGTP0.2-3mmol/L，dCTP0.2-1.5mmol/L，dTTP 0.2-1.5mmol/L，Betaine 0.2-1mol/L，EvaGreen 0.2-2×，Bst polymerase0.05-2U/μl。

本发明还公开了一种用于克柔念珠菌核酸检测的检测方法，包括以下步骤：

步骤S1，样本处理和模板提取，得到待检模板；

步骤S2，将引物组中的单引物进行溶解、稀释并混合得到混合后的引物组，将混合后的引物组固定在微流控芯片的芯片反应池内；

步骤S3，将扩增对照DNA和引物混合之后，固定在芯片反应池内；

步骤S4，核酸扩增，取扩增反应液，加入待检模板；

步骤S5，振荡混匀后离心，将离心后的液体注入微流控芯片内，将微流控芯片放入核酸扩增分析仪中进行扩增。

步骤S6，在核酸扩增分析仪下进行核酸扩增反应产物的检测。根据显色反应，与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线为阴性。

其中，扩增包括恒温扩增和变温扩增。

采用次技术方案，通过针对上述一种病原体的多个基因位点或多个病原体的多个基因位点设计引物，并利用核酸扩增技术，以微流控芯片为载体，进行扩增，并根据显色反应进行结果判读，方法简单，检验快速。

作为本发明的进一步改进，所述样本包括咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹、血液、脑脊液、尿液、脓液、人体组织。

作为本发明的进一步改进，所述模板提取为在芯片外进行手动提取或将样本直接注入微流控芯片进行自动提取。

作为本发明的进一步改进，所述手动提取包括：取待检菌液和灭活的提取质控菌加入离心管中，离心后，弃上清，加入清洗液清洗一次，再次离心后，弃上清，在离心管中加入提取液混匀后加至装有玻璃珠的离心管中进行震荡，然后再恒温金属浴100℃加热5min，离心，取上清做待检模板。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

采用本发明的技术方案，本发明通过提供3种针对克柔念珠菌不同基因位点设计的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中克柔念珠菌的cytb基因、ITS基因、ERG11基因位点进行检测。本发明提供的检测试剂盒和检测方法可检出的克柔念珠菌具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，同时，还有试剂消耗量小，污染小等优点，该实验全程为闭盖式反应，减少了污染的可能性，成本低、且便携。

附图说明

图1为本发明的微流控芯片的排布示意图。

图2为本发明实施例1中对克柔念株菌样本进行检测的结果图，3个不同基因位点都得到检出。

图3为本发明实施例1对部分位点突变的克柔念株菌样本1进行检测的结果图，ERG11基因和cytb基因得以检出。

图4为本发明实施例1对部分位点突变的克柔念株菌样本2进行检测的结果图，cytb基因得以检出。

上述附图2～图4中，图中横坐标单位是分钟(min)，纵坐标没有单位，“+”表示相应指标检出，“-”表示相应指标未检出。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

实施例1

以克柔念株菌cytb基因、ITS基因、ERG11基因位点检测来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。

1、引物制备

通过筛选出克柔念株菌cytb基因、ITS基因、ERG11基因片段设计出核酸扩增引物并合成，得到如下的引物：

克柔念株菌cytb基因

序列编号1

正向外引物F3 CATGCAAATGGAGCATCA

序列编号2

反向外引物B3 ACCAATAAAAGGTATAGCTGAT

序列编号3

正向内引物FIP ACTCTTGGTTTACGATATGATCCATTGGATGTATGTATATACATG TAGG

序列编号4

反向内引物BIP AGCAACAATGGCAACAGCATAGCTCCTCAATGAGACATT

序列编号5

反向环引物LB ATGGGATATTGTCTTGTATATGGAC

克柔念株菌ITS基因

序列编号6

正向外引物F3 CGGATCTCTTGGTTCTCGC

序列编号7

反向外引物B3 CAGCTTCGCTCCCTTTCAG

序列编号8

正向内引物FIP GGCGCAATGTGCGTTCAAGAACGATGAAGAGCGCAGCGAAAT

序列编号9

反向内引物BIP TGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCCCTCTTTACACGTCGTCCGC

序列编号10

正向环引物LF TGCAATTCACACTAGGTATCGC

克柔念株菌ERG11基因

序列编号11

正向外引物F3 CAACTTTAGGGGGGACTC

序列编号12

反向外引物B3 GGCAATGGCAAATAGGAGAA

序列编号13

正向内引物FIP GTCACCAAAGAGAGAACGAGATGAAACCGATGTTTTGAAATCGC

序列编号14

反向内引物BIP GCTCTACGTAACAGATTGGACGGACGAAATTCAGAGGGGTA

序列编号15

正向环引物LF GTAAAGAGCGTCATTTCCGACT

序列编号16

反向环引物LB CTTCTTATGCTGAGATGTACAGCG

2、微流控芯片制备

微流控芯片的结构排布示意图如图1所示，芯片反应池内包被固定有由克柔念珠菌cytb基因引物组、克柔念珠菌ITS基因引物组、克柔念珠菌ERG11基因引物组、扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。

克柔念珠菌cytb基因，分别取24μL内引物FIP/BIP(序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示)，3μL外引物F3/B(序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，10μL环引物LB(序列如SEQ ID NO.5所示)三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。

克柔念珠菌ITS基因，分别取24μL内引物FIP/BIP(序列如SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示)，3μL外引物F3/B(序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示),10μL环引物LF(序列如SEQ ID NO.10所示)三三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。

克柔念珠菌ERG11基因，分别取24μL内引物FIP/BIP(序列如SEQ ID NO.13和SEQID NO.14所示)，3μL外引物F3/B(序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示),10μL环引物LF/LB(序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示)三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。

提取对照，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。

扩增对照，取0.3μL混合引物和0.5μL扩增对照DNA及琼脂糖0.2μL混合，点在相应位置，自然晾干。

3、样品处理和模板提取，以痰液样本为例；取1mL待检菌液和50μL灭活的提取质控菌加入1.5mL离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μL清洗液清洗一次，12000rpm离心2min后，弃上清，在离心管中加入200ul提取液充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板。

4核酸扩增

取扩增反应液55μL，加入15μL待检模板，充分混匀后注入芯片。

所述扩增反应液中包括如下试剂：

序号	试剂组分	终浓度
			1	10×Thermomal Buffer	1×
2	MgSO<sub>4</sub>	2-10mmol/L
			3	BSA	0.2-2mg/ml
4	dATP	0.2-3mmol/L
			5	dGTP	0.2-3mmol/L
6	dCTP	0.2-1.5mmol/L
			7	dTTP	0.2-1.5mmol/L
8	Betaine	0.2-1mol/L
			9	EvaGreen	0.2-2×
10	Bst polymerase	0.05-2U/μl

所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA聚合酶。

在温度为65℃的核酸扩增分析仪上反应50min。

5扩增产物的检测

与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪设备上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线判定为阴性。

实验结果为：

图2为对克柔念株菌样本进行检测，cytb，ITS，ERG11基因位点均得到有效扩增，克柔念珠菌得以有效检出。图3为对部分位点突变的克柔念株菌样本1进行检测的结果图，ERG11基因和cytb基因得到有效扩增，ITS基因位点发生突变未得到扩增，克柔念珠菌得以有效检出，检测结果不受个别基因位点突变影响；

图4为用图1所示的基因芯片对对部分位点突变的克柔念株菌样本2进行检测的结果图，cytb基因得到有效扩增，ITS基因和ERG11基因位点发生突变未得到扩增，克柔念珠菌仍得以有效检出，检测结果不受部分基因位点突变影响。

通过上述结果可知，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可在同一张芯片内，同时检测克柔念珠菌的多个基因位点，当某一基因发生突变时，则该基因位点检测结果为阴性；但是当该菌株的任一基因被检出，则说明克柔念珠菌呈阳性，因此提高了检测的灵敏度和特异性。另外，可解决克柔念株菌的现场快速检测的难题，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携带等诸多优点。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医科大学附属盛京医院

<120> 一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catgcaaatg gagcatca 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accaataaaa ggtatagctg at 22

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actcttggtt tacgatatga tccattggat gtatgtatat acatgtagg 49

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcaacaatg gcaacagcat agctcctcaa tgagacatt 39

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggatatt gtcttgtata tggac 25

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggatctctt ggttctcgc 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagcttcgct ccctttcag 19

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcgcaatgt gcgttcaaga acgatgaaga gcgcagcgaa at 42

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgcctgtttg agcgtcgttt ccctctttac acgtcgtccg c 41

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgcaattcac actaggtatc gc 22

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caactttagg ggggactc 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcaatggca aataggagaa 20

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctctacgta acagattgga cggacgaaat tcagaggggt a 41

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtaaagagcg tcatttccga ct 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cttcttatgc tgagatgtac agcg 24