阅读说明：本技术 一种重组表达质粒与基因工程菌及(4s,5r)-半酯的制备方法 (Recombinant expression plasmid, genetic engineering bacterium and preparation method of (4S,5R) -half-ester ) 是由 徐毅 沈海云 徐长利 马宝娣 吴小梅 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种水相体系中高效绿色制备生物素中间体的方法,即采用重组微杆菌酯酶整细胞在纯水体系中催化内消旋生物素二甲酯不对称水解生成(4S,5R)-半甲酯。当底物浓度为200mM,反应时间为4h,(4S,5R)-半甲酯e.e.值大于99％,产率达100％,时空产率超过400g/L/d。该制备方法催化效率高、底物转化率高、产品光学纯度高,并且以不含有机溶剂的纯水作为反应介质,具有潜在的工业应用价值。(The invention discloses a method for efficiently and environmentally preparing a biotin intermediate in a water phase system, namely, a recombinant microbacterium esterase whole cell is adopted to catalyze meso-biotin dimethyl ester to be asymmetrically hydrolyzed in a pure water system to generate (4S,5R) -half methyl ester. When the substrate concentration is 200mM and the reaction time is 4h, the e.e. value of (4S,5R) -half methyl ester is more than 99%, the yield reaches 100%, and the space-time yield exceeds 400 g/L/d. The preparation method has high catalytic efficiency, high substrate conversion rate and high optical purity of the product, and has potential industrial application value by taking pure water without organic solvent as a reaction medium.)

一种重组表达质粒与基因工程菌及(4S,5R)-半酯的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用产酯酶重组大肠杆菌 BL21(DE3)/pET21a-estsit01整细胞作为生物催化剂在纯水相体系中制备(4S,5R)- 半甲酯的方法。

背景技术

D-生物素属于B族维生素，又称Vitamin B7或Vitamin H，是动物机体内维持正常生理机能所必需的水溶性维生素之一。人体若缺乏生物素则会引起生长缓慢等营养性疾病、皮炎、食欲不振、恶心、呕吐、脱发、体重降低、贫血、血中胆固醇升高和精神抑郁病症等，因此D-生物素是重要的医药产品和饲料添加剂，市场需求量巨大。

(4S,5R)-生物素手性半甲酯是合成D-生物素(D-Biotin，B族维生素)的关键手性中间体之一，其结构式(1)如下所示：

目前(4S,5R)-生物素手性半甲酯的合成方法可以分为两种。

一种是化学拆分法。Deng课题组以酸酐为底物，手性路易斯碱(金鸡纳碱二聚体DHQD-PHN)作为催化剂对内消旋酸酐不对称醇解反应得到(4S,5R)-单酯，e.e 值93％。(Choi C,Tian S K,Deng L.Synthesis,2001,(11):1737-1741.)。之后，陈芬儿课题组开发了另一种催化剂，利用氯霉素副产物[(1S,2S)-1-(4-硝基苯基)-2-N,N- 二甲基氨基-3-三苯基甲氧基-1-丙醇]的衍生物作为催化剂，以酸酐为底物，在有机溶剂中进行不对称醇解得到手性半酯，再还原、关环得到手性内酯，收率为 88％，e.e值高达98.5％。(钟铮，武雪芬，陈芬儿。有机化学，2012，32:1792-1802)。但是这些方法存在催化剂较昂贵、反应条件苛刻等缺陷。

1982年，Tsuchihashi首次采用了生物催化的方法。以猪肝酯酶为催化剂，在有机溶剂-水两相体系中催化得到手性半甲酯，再经过还原、关环得到e.e值为75％的内酯(Iriuchijima S,Hasegawa K,TsuchihashiG.Agricultural and BiologicalChemistry.1982,46(7):1907-1910)。后来，Chen等人利用聚合物固定化的猪肝酯酶PLE，在甲醇-水混合溶剂系统中催化内消旋生物素二甲酯选择性水解得到生物素半甲酯，产率为90％，e.e值为91％。但因为催化剂PLE选择性低且成本高，限制了其进一步工业化应用(Chen F E,Chen X X,Dai H F,et al.Advanced Synthesis&Catalysis,2005,347(4):549-554.)。

2010年，徐毅等人筛选出一株巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatumSIT101)，该菌株所产的酯酶，在水-有机混合溶剂体系中能够高选择性催化内消旋生物素二甲酯不对称水解生成(4S,5R)-半甲酯，产率为95％，e.e值大于99％(徐毅等.一种巧克力微杆菌及制备(4S,5R)-半酯的方法[P].中国专利. CN102120977A,2010)。并在进一步的工作中，在大肠杆菌中对该菌株来源的酯酶进行异源表达，构建了能够高产重组酯酶的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pET21a-estsit01。

目前已经公开的制备生物素中间体(4S,5R)-半酯的化学或生物合成的方法均采用有机溶剂或有机溶剂-水混合溶剂体系，随着对环境保护的重视，有必要发展一种更加绿色的无有机溶剂添加的生物催化反应体系实现(4S,5R)-半酯的高效绿色制备。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是来自于巧克力微杆菌的重组酯酶工程菌，所述重组工程菌的制备方法、上述酯酶及工程菌在生物素二甲酯选择性水解中的应用。因为通过构建的高效表达重组酯酶的基因工程菌株在含有机溶剂的反应体系中稳定性差，导致反应过程存在底物浓度低、催化效率低和催化剂容易失活，有机溶剂会污染环境导致下游环保处理成本上升等问题。通过建立一种在纯水相体系中进行生物素二甲酯水解的工艺，不但能够缓解催化剂失活的问题，以高产率获得高光学纯度产物(4S,5R)-半甲酯，而且该制备过程反应时间短、条件温和，选择纯水作为反应介质，环保又经济，生产成本低。符合未来对绿色医药化工的发展要求。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案之一是：

一种重组表达质粒，所述质粒为pET-21a质粒，其特征在于，所述pET-21a 质粒的酶切位点上连接有酯酶基因，所述酯酶基因序列为SEQ ID NO:1，所述重组表达质粒命名为pET-21a-estsit01。

上述重组表达质粒的构建方法包括：根据目的基因序列设计一对特异性引物(SEQ ID NO:2，F5’-GGAATTCATGACCCTGTTCGACGGCATCACGTCT-3’； SEQ ID NO:3，R5’-CCCAAGCTTGTCGGCGGAGCGGATGATGATCGCCTC-3’) 以提取的基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，将PCR产物和载体pET-21a 分别用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切后，形成互补的粘性末端，再用T4 DNA ligase进行连接，形成含有酯酶基因的重组表达质粒pET-21a-estsit01。

本发明采取的技术方案之二是：

一种重组表达转化体，其特征在于，包含宿主微生物，所述的宿主微生物携带上述的重组表达载体。

优选地，所述的宿主微杆菌为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的酯酶基因可被有效表达即可。所述重组表达转化的制备方法包括：将如上述的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。

更优选地，所述宿主微生物为大肠埃希氏菌(E.coli)，

进一步地，所述宿主微生物为大肠埃希氏菌BL21(DE3)。

一种基因工程菌，其特征在于，为携带上述的重组表达质粒pET-21a-estsit01 的大肠埃希氏菌BL21(DE3)，命名为E.coli BL21(DE3)/pET-21a-estsit01。

所述基因工程菌的制备方法包括：将前述重组表达质粒pET-21a-estsit01转至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21 (DE3)/pET-21a-estsit01。所述的转化方法为本领域常规方法，包括化学转化法，热激法或电转法。

本发明采取的技术方案之三是：将上述的重组表达转化体或者是基因工程菌作为生物催化剂选择性水解生物素二甲酯的应用。

本发明提供了一种(4S,5R)-半酯的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将上述E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01菌体作为生物催化剂，加入到纯水中，得到菌体悬浮液；然后加入底物生物素二甲酯，控制反应温度为 30℃，进行不对称水解反应，通过滴加20％(w/v)氨水控制反应液pH在7.5～8.0 之间，反应时间2～24h，得到反应液；

步骤2：将步骤1得到的反应液离心，分离细胞取上清液，加入2mol/L HCl 调pH为2.0，用等体积乙酸乙酯萃取酸化液3次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，之后减压蒸干有机溶剂，70℃真空干燥样品，最终得到目标产物，即得 (4S,5R)-半甲酯固体。

优选地，所述步骤1中，所用的菌体湿重、生物素二甲酯、纯水的量，按菌体湿重：生物素二甲酯：纯水＝10～30g:100～300mmol:1～2L计算。

优选地，所述步骤2中的离心速度为1000rpm，离心时间为20min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供一种水相体系中生物素中间体的制备工艺，通过自主构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01细胞催化生物素二甲酯进行不对称水解反应生成(4S,5R)-半甲酯，反应以纯水作为反应体系。解决了添加有机溶剂造成的酶稳定性差、催化效率低和环境污染等问题。当底物浓度为200mM，时空产率大于400g/L/d。反应过程转化率高、光学纯度高。

(2)本发明提供的水相体系中生物素中间体的制备工艺，由于所用的生物催化剂大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01，为本实验室自主构建，其培养方便，原料廉价，并且在反应过程中以纯水作为反应介质，避免使用有机溶剂，绿色环保又经济，酶稳定性好，催化效率高，具有潜在的工业应用价值。

附图说明

图1是纯水反应体系酶催化不对称合成生物素中间体(4S,5R)-半甲酯。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实例中的材料来源为：

重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01，该基因工程菌为实验室前期构建。利用常规的PCR技术进行目的基因的扩增，并通过酶切、连接技术将目的基因与载体pET-21a连接，将连接液转化大肠杆菌E.coli DH5α，扩增后，挑阳性克隆子培养，质粒提取，即可得重组质粒pET-21a-estsit01。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑阳性克隆，得到重组表达转化体 E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01。

本发明各实施例中所用的试剂皆为分析纯或者HPLC纯规格。

本发明的各实施例中对生物素二甲酯不对称水解反应转化率等通过岛津高效液相色谱仪SPD-20A，出自岛津仪器公司，色谱柱采用反向色谱柱C18柱 (Diamonsil plus,4.6mm×250mm×5μm，北京迪科马科技有限公司)；具体分析条件如下：

流动相比例是甲醇：水＝65：35(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm，柱温为20℃。

产物(4S,5R)-半甲酯的转化率计算如下:

转化率W＝0.60×(X-X₀)×B/C×100％

其中，X代表反应液中产物的峰面积，X₀代表空白反应液中底物二甲酯自发水解的峰面积，C代表底物二甲酯的浓度，B代表反应液的稀释倍数。0.60为产物峰面积与浓度的系数常数。

本发明各实施例中(4S,5R)-半甲酯的得率根据实际生成产物(4S,5R)-半甲酯的质量除以理论生成(4S,5R)-半甲酯的质量来计算；

本发明实施例中所指的细胞酶活力单位的定义为：在30℃，pH 7.5的条件下，每分钟催化生成1.0μmol的(4S,5R)-半甲酯所需的酶量即为1个活力单位，即1 U。

产物(4S,5R)-半甲酯的光学纯度值的检测采用岛津高效液相色谱仪 SPD-20A，出自于岛津仪器公司；色谱柱采用手性柱(4.6mm×250mm×550， CHIRALCEL OJ-H，购于大赛璐药业手性技术(上海)有限公司)。具体分析条件如下：

流动相为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝97:3:0.2(v/v)，流速0.5mL/min，检测波长为220nm，柱温为20℃。

实施例1

重组质粒及重组工程菌的构建：根据目的基因来设计一对特异性引物 (F5’-GGAATTCATGACCCTGTTCGACGGCATCACGTCT-3’；R5’-CCCAAGCTT GTCGGCGGAGCGGATGATGATCGCCTC-3’)进行PCR扩增。PCR体系为：2×pfu PCR Mster Mix 25μl，上游引物和下游引物各0.5μl(0.25μmol/L)，DNA模板1 μl(约0.05μg质粒pET21a-estsit01)和ddH₂O 20μl，二甲基亚砜(DMSO)3 μl。PCR反应过程：95℃模板变性8min；95℃模板变性，30s，55℃退火，45s， 72℃引物延伸150s，该过程共循环30次；72℃引物沿模板继续延伸7min。酯酶基因的序列如SEQ IDNO:1所示。

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化、回收后，利用EcoRI和HindIII进行双酶切30min。利用T4 DNA ligase对酶切产物进行连接，连接液转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子，经质粒提取获得大量重组表达载体质粒 pET21a-estsit01。

将重组质粒pET21a-estsit01转化大肠杆菌E.coli BL21(DE 3)感受态细胞，挑阳性克隆，得到重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01，用于后续诱导表达。所述的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01为携带上述的重组表达载体pET21a-estsit01的大肠埃希氏菌BL21(DE3)。

实施例2

大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET21a-estsit01细胞的培养：

种子液培养：取4℃冰箱保存的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01 斜面菌种，挑取一环菌种接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，控制摇床温度为30℃、转速为180rpm培养12h，得到种子液；

其中所述的种子培养基按每升计算，含氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，初始pH为7.0，余量为水。

摇瓶发酵：将种子液接种到发酵培养基中，接种所用的种子液的量，按接种后发酵液的OD₆₀₀＝0.1的比例计算；接种后，控制摇床温度为30℃、转速180rpm 进行发酵，在培养2h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，继续发酵培养8h，得到发酵液离心，细胞沉淀用生理盐水洗涤两次，得到湿菌体。

其中所述的发酵培养基按每升计算，甘油25g，酵母浸粉15g，氯化钠10g， K₂HPO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1.2g，初始pH为7.2，余量为水；

实施例3

取湿重0.1g实施例2所得的E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01湿菌体，悬浮于9.0mL Tris-HCl缓冲溶液中(0.2M，pH 7.5)，加入生物素二甲酯物质的量为1 mmol，再加入1.0mL乙醇，反应混合物在30℃，150rpm的恒温摇床中震荡，间歇取样，用乙酸乙酯萃取，手性液相色谱柱分析对映体过量值和产率，反应24小时后，(4S,5R)-半甲酯产率为65％，对映体过量值(e.e.)大于99％。

实施例4

取湿重0.1g的实施例2所得的E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01湿菌体，悬浮于8.0mL Tris-HCl缓冲溶液中(0.2M，pH 7.5)，加入生物素二甲酯物质的量为 1mmol，再加入2.0mL二甲基亚砜，反应混合物在30℃，150rpm的恒温摇床中震荡，间歇取样，用乙酸乙酯萃取，手性液相色谱柱分析对映体过量值和产率，反应24小时后，(4S,5R)-半甲酯产率为55％，对映体过量值(e.e.)大于99％。

实施例5

取湿重0.1g的实施例2所得的E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01湿菌体，悬浮于10.0mL Tris-HCl缓冲溶液中(0.2M，pH7.5)，加入生物素二甲酯物质的量为 1mmol，在30℃，150rpm的恒温摇床中震荡，间歇取样，用乙酸乙酯萃取，手性液相色谱柱分析对映体过量值和产率，反应24小时后，(4S,5R)-半甲酯产率为 70％，对映体过量值(e.e.)大于99％。

实施例6

取湿重0.1g的实施例2所得的E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01湿菌体，悬浮10.0mL纯水中，加入底物二甲酯物质的量为1mmol，反应混合物在30℃，150 rpm的恒温摇床上震荡反应，反应期间定时取样，HPLC分析转化率。用20％(v/v) 氨水调节pH，使反应液pH维持在7.5-8.0之间。当pH不再变化时，即可判断反应结束。用手性液相色谱分析产物的对映体过量值和产率，当反应12小时之后， (4S,5R)-半甲酯的转化率达到90％，对映体过量值(e.e)大于99％，时空产率为66.24g/L/d。

实施例7

取湿重0.2g的实施例2所得的E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01湿菌体，悬浮于10.0mL纯水中，加入底物二甲酯物质的量为1mmol，反应混合物在30℃，150 rpm的恒温摇床上震荡反应，反应期间定时取样，HPLC分析转化率。用20％(v/v) 氨水调节pH，使反应液pH维持在7.5-8.0之间。当pH不再变化时，即可判断反应结束。用手性液相色谱分析产物的对映体过量值和产率，当反应2小时之后， (4S,5R)-半甲酯的转化率达到100％，对映体过量值(e.e)大于99％，时空产率为443g/L/d。

实施例8

取湿重0.2g的实施例2所得的E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01湿菌体，悬浮于10.0mL纯水中，加入底物二甲酯物质的量为2mmol，反应混合物在30℃，150 rpm的恒温摇床上震荡反应，反应期间定时取样，HPLC分析转化率。用20％(w/v) 氨水调节pH，使反应液pH维持在7.5-8.0之间。当pH不再变化时，即可判断反应结束。用手性液相色谱分析产物的对映体过量值和产率，当反应4小时之后， (4S,5R)-半甲酯的转化率达到100％，对映体过量值(e.e)大于99％，时空产率为442g/L/d。

实施例9

取湿重0.2g的实施例2所得的E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01湿菌体，悬浮于10.0mL纯水体系中，加入底物二甲酯物质的量为3mmol，反应混合物在30℃， 150rpm的恒温摇床上震荡反应，反应期间定时取样，HPLC分析转化率。用 20％(w/v)氨水调节pH，使反应液pH维持在7.5-8.0之间。当pH不再变化时，即可判断反应结束。用手性液相色谱分析产物的对映体过量值和产率，当反应6 小时之后，反应不再进行，(4S,5R)-半甲酯的转化率达到83％，对映体过量值 (e.e)大于99％。

实施例10

取湿重0.7g实施例2中所制得的E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01湿菌体，悬浮于40mL纯水中，加入2g(5mmol)底物二甲酯，置于摇床，30℃，150rpm，进行全细胞催化反应。反应期间定时取样，用20％(v/v)氨水调节pH，使pH维持在 7.5-8.0之间，直至反应pH不再下降，结束反应。

所得的反应液离心(1000rpm，20min)，分离细胞取上清液，加入2mol/L HCl 调pH为2.0，用等体积乙酸乙酯萃取酸化液3次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥后过滤，之后减压回收有机溶剂，剩余物在70℃真空干燥样品，最终得到目标产物(4S,5R)-半甲酯，白色粉末1.76g，分离收率91.5％，测得(4S,5R)-半甲酯熔点为149-151℃，e.e.值为99.1％，

SEQUENCE LISTING

<110> 上海应用技术大学

<120> 一种重组表达质粒与基因工程菌及(4S, 5R)-半酯的制备方法

<130> BCN1192403

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 酯酶基因

<400> 1

atgaccctgt ttgatggcat tacctctcgt attgtggata ccgatcgcct gaccgttaat 60

attctggaac gcgcagcaga tgatccgcag accccgccgg atcgtaccgt tgtgtttgtt 120

catggtaatg tgtctagcgc cctgttttgg caggaaatta tgcaggatct gccgagcgat 180

ttacgcgcca ttgccgtgga tttacgcggc tttggcggct ctgaacatgc cccggttgat 240

gcaacccgcg gcgttcgtga tttttcagat gatttacatg ccaccttaga agccttagat 300

attccggttg cccatttagt gggctggagt atgggtggcg gcgtggttat gcagtatgca 360

ctggatcatc cggttctgtc actgacctta cagtctccgg ttagtccgta tggctttggc 420

ggtacccgtc gcgatggtag tcgcttaacc gatgatgatg caggctgtgg tggcggcggt 480

gccaatccgg attttattca gcgcttaatt gatcatgata ccagcgatga tgcacagacc 540

tctccgcgta gcgtgtttcg cgcaggctat gttgcctcag attataccac cgatcatgaa 600

gatgtttggg ttgaatcaat gttaaccacc tcaaccgccg atggtaatta tccgggtgat 660

gccgttccga gcgataattg gccgggcttt gccgcaggtc gtcatggtgt gctgaatacg 720

atggccccgc agtattttga tgtgtcaggc attgtggatt tagccgaaaa accgccgatt 780

ctgtggattc atggtaccgc agatgcaatt gtgagcgatg cctcctttta tgatctgaat 840

tatctgggcc agttaggcat tgttccgggt tggccgggcg aagatgttgc cccggcacag 900

gaaatggtga gtcagacccg tgatgtgctg ggtcgctatg cagcaggcgg tggtaccgtg 960

accgaagttg ccgttgaagg tgcaggtcat agtgcacatc tggaacgtcc ggcagtgttt 1020

cgtcatgcac tgctggaaat tattggctat gtgggcgcag cagccgatcc ggccccgccg 1080

accgaagcca ttattattcg tagcgcagat 1110

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer

<400> 2

ggaattcatg accctgttcg acggcatcac gtct 34

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reversed primer

<400> 3

cccaagcttg tcggcggagc ggatgatgat cgcctc 36