阅读说明：本技术 一种从核桃中快速分离纯化核桃蛋白的方法 (Method for rapidly separating and purifying walnut protein from walnuts ) 是由 何建新 王平 龚俊杰 王顺余 郑宋友 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种从核桃中快速分离纯化核桃蛋白的方法,所述方法包括如下步骤：将含有核桃蛋白的植物原料球磨粉碎至颗粒,得到核桃粉末,称干重；采用石油醚脱脂,并挥干有机溶剂；采用醇类溶液作为提取溶剂,并加入蛋白水解酶酶解；旋蒸除去醇类溶剂,接着采用超临界流体萃取核桃中蛋白质,使用大孔树脂对萃取液进行吸附；采用不同浓度的醇溶液对吸附在大孔树脂上的滤液进行洗脱,得到洗脱液,合并洗脱液,减压浓缩,冷冻干燥获得核桃蛋白固体。(The invention provides a method for quickly separating and purifying walnut protein from walnuts, which comprises the following steps: grinding plant raw material balls containing walnut protein into particles to obtain walnut powder, and weighing the walnut powder by dry weight; degreasing by using petroleum ether, and volatilizing an organic solvent; adopting an alcohol solution as an extraction solvent, and adding proteolytic enzyme for enzymolysis; removing the alcohol solvent by rotary evaporation, extracting protein in the walnut by adopting a supercritical fluid, and adsorbing the extract by using macroporous resin; and (3) eluting the filtrate adsorbed on the macroporous resin by adopting alcoholic solutions with different concentrations to obtain an eluent, combining the eluents, concentrating under reduced pressure, and freeze-drying to obtain the walnut protein solid.)

一种从核桃中快速分离纯化核桃蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种从核桃中快速分离纯化核桃蛋白的方法。

背景技术

核桃（Juglans regia L），又称胡桃、羌桃，是胡桃科植物。与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。核桃仁含有丰富的营养素，每百克含蛋白质15~20克，脂肪较多，碳水化合物10克，并含有对人体有益的钙、磷、铁等多种微量元素和矿物质，以及胡萝卜素、核黄素等，是深受老百姓喜爱的坚果类食品之一。据文献报道表明，核桃蛋白是坚果类蛋白，资源丰富、 价格低廉,是我国居民主要的蛋白质来源。其中谷蛋白占70% ，球蛋白18% ，白蛋白7% 以及其他醇溶性蛋白质。核桃蛋白中人体必需的8种氨基酸含量比例适合，其中含有较多的精氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸。营养价值与动物蛋白相当，能够很好地满足人类的营养需求。

核桃蛋白主要可以从核桃中进行提取，但其一直面临着得率不高，蛋白空间结构破坏严重等问题。目前，从核桃中分离纯化核桃蛋白的方法主要如下：首先，将核桃仁粉碎，使用石油醚浸泡核桃粉末脱去油脂，弃去含脂滤液，自然挥干核桃粉末表面的有机溶剂，得到脱脂核桃粉末。醇溶液作为提取溶剂，浸提上述粉末数日，离心取上清液，盐析蛋白质结晶，过滤，干燥得到蛋白质晶体。在上述生产过程中，涉及有机溶剂长时间浸提等过程，易造成蛋白质变性，存在提取效率低，得率不理想等问题。因此，此方法尚存在改进的空间。中国专利CN103535508A公开核桃蛋白粉及其制备方法，该方法经历压榨等过程，虽油脂含量大大下降，然后此过程中较高温度易使蛋白质发生变性，导致核桃蛋白品质下降。核桃果实未进行机械化学的方法球磨粉碎，颗粒比表面积不均一，存在提取不充分的问题。超临界CO₂萃取液未进行大孔树脂选择性吸附和不同浓度乙醇的梯度洗脱，可能不能得到纯度较高且蛋白极性范围较广的核桃蛋白。核桃蛋白成品未经干燥等过程，大大减少了核桃蛋白的保存时间等。该方法存在诸多缺陷。

CN103535508A公开核桃蛋白粉及其制备方法，包括如下步骤：1）将核桃仁压榨至其中油脂的质量百分含量小于10%，得到核桃饼；2）将步骤1）所得到核桃饼粉碎后进行超临界CO₂萃取，得到所论述核桃蛋白粉。该产品油脂含量小于 1%，在给人体提供优质蛋白的同时不会导致过多的脂肪摄入量。相比同类产品（脂肪含量约在8%～10%），该产品脂肪含量更低，不易氧化变质。

发明内容

本发明的目的是提供一种显著性加快核桃蛋白分离纯化速率的制备工艺。采用本工艺制备核桃蛋白，能大大提高得率，保证蛋白质稳定性，且该工艺简便可行，为其相关食品和保健品开发和应用奠定了基础。

本发明采用的技术方案是：

一种从核桃中快速分离纯化核桃蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

将含有核桃蛋白的植物原料球磨粉碎至颗粒，得到核桃粉末，称干重；采用石油醚脱脂，并挥干有机溶剂；

采用醇类溶液作为提取溶剂，并加入蛋白水解酶酶解；旋蒸除去醇类溶剂，接着采用超临界流体萃取核桃中蛋白质，使用大孔树脂对萃取液进行吸附；

采用不同浓度的醇溶液对吸附在大孔树脂上的滤液进行洗脱，得到洗脱液，合并洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥获得核桃蛋白固体。

作为优选，所述的植物原料为胡桃科植物核桃成熟果实的干燥果仁。

作为优选， 球磨时间为10-90min，优选为20-60min。

作为优选，所述醇类溶液为乙醇水溶液，优选地，所述乙醇水溶液的体积分数为10~50%。

作为优选，所述的蛋白水解酶酶用量为物料量的0.3%-1%，优选为0.4-0.8%。

作为优选，所述的酶解温度为30℃-50℃，优选为35℃-45℃。

作为优选，所述的酶解pH 为5.0-9.0的范围内，优选为6.0-8.0。

作为优选，所述的酶解时间为5-60min，优选为5-30min。

作为优选，所述的超临界萃取条件为温度30-60℃，压力16-30MPa，提取时间0.5-3h，CO₂流速5-8L/min。优选为温度40-55℃，压力20-25MPa，提取时间0.5-2h，CO₂流速6-7L/min。

进一步，本发明所述方法可按以下步骤操作：将核桃成熟果实的干燥果仁洗净、烘干，采用机械化学的方法进行预处理10-90min，研磨至粉末状，称干重；将处理后的核桃粉末，进行石油醚脱脂，弃去滤液，自然挥干核桃粉末表面的石油醚；以水、水和乙醇为提取溶剂，加入0.3%-1%的蛋白水解酶，搅拌混匀，在30-50℃和5.0-9.0的pH下酶解5-60min，得到粗品，旋蒸除去乙醇，再采用超临界流体萃取技术萃取核桃蛋白，萃取过程中温度为30-60℃，压力为16-30MPa，提取时间为0.5-3h，CO₂流速为5-8L/min。使用大孔树脂对所述萃取液进行吸附，依次用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，获得核桃蛋白洗脱液；对所述的核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术，获得核桃蛋白晶体。

较为具体的，推荐本发明所述方法优选按照以下步骤进行：将核桃成熟果实的干燥果仁洗净、烘干，采用机械化学的方法进行预处理20-60min，研磨至粉末状，称干重；将处理后的核桃粉末，进行石油醚脱脂，弃去滤液，自然挥干核桃粉末表面的石油醚；以10-50%乙醇-水溶液为提取溶剂，加入0.4%-0.8%的蛋白水解酶，搅拌混匀，在35-45℃的温度和6.0-8.0的pH下酶解5-30min，得到粗品，旋蒸除去乙醇，再采用超临界流体萃取技术萃取核桃蛋白，萃取过程中温度为40-55℃，压力为20-25MPa，提取时间为0.5-2h，CO₂流速为6-7L/min。使用大孔树脂对所述萃取液进行吸附，依次用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，获得核桃蛋白洗脱液；对所述的核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术，获得核桃蛋白晶体。并且使用BCA法检测总蛋白含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

（1）本发明将核桃蛋白进行酶法提取，缩短极性有机溶剂提取时所需提取时间和降低所需提取温度，减少核桃蛋白提取过程中的变性失活，有效的提高核桃蛋白的得率。

（2）本发明采用超临界流体萃取技术，采用易得无污染的二氧化碳作为萃取剂，实现核桃当中蛋白质的快速分离纯化，提高其分离的纯度及得率。

本发明建立了一种能显著加快核桃蛋白分离纯化速度的制备工艺，能大大节约提取时间，保证核桃蛋白的稳定性，增加其得率，且该工艺简便可行，绿色环保，为核桃蛋白相关食品和保健产品开发和应用奠定了基础。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明方案进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施案例1

将10g核桃仁进行20min机械预处理球磨成粉末，石油醚脱脂，并与60ml的30%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在45℃和pH=7.0的条件下，加入0.005g木瓜蛋白水解酶酶解15min，得到粗提液；采用超临界流体二氧化碳对粗提液进行萃取，得到核桃蛋白萃取液，其中，超临界流体萃取的条件为：超临界温度为45℃，超临界压力为25MPa，提取时间为0.5h，CO₂流速为6L/min；使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在D3520大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为12.4%。

实施案例2

将10g核桃仁进行20min机械预处理球磨成粉末，石油醚脱脂，并与60ml的20%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在40℃和pH=6.5的条件下，加入0.005g木瓜蛋白水解酶酶解30min，得到粗提液；采用超临界流体二氧化碳对粗提液进行萃取，得到核桃蛋白萃取液，其中，超临界流体萃取的条件为：超临界温度为50℃，超临界压力为25MPa，提取时间为0.5h，CO₂流速为6L/min；使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在D3520大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为15.6%。

实施案例3

将10g核桃仁进行30min机械预处理球磨成粉末，石油醚脱脂，并与60ml的40%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在35℃和pH=6.0的条件下，加入0.006g木瓜蛋白水解酶酶解20min，得到粗提液；采用超临界流体二氧化碳对粗提液进行萃取，得到核桃蛋白萃取液，其中，超临界流体萃取的条件为：超临界温度为55℃，超临界压力为25MPa,提取时间为0.5h，CO₂流速为6L/min；使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为17.4%。

实施案例4

将10g核桃仁进行30min机械预处理球磨成粉末，石油醚脱脂，并与60ml的50%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在35℃和pH=6.0的条件下，加入0.007g木瓜蛋白水解酶酶解25min，得到粗提液；采用超临界流体二氧化碳对粗提液进行萃取，得到核桃蛋白萃取液，其中，超临界流体萃取的条件为：超临界温度为45℃，超临界压力为25MPa，提取时间为1h，CO₂流速为6L/min；使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为18.4%。

实施案例5

将10g核桃仁进行40min机械预处理球磨成粉末，石油醚脱脂，并与60ml的50%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在40℃和pH=7.0的条件下，加入0.008g木瓜蛋白水解酶酶解30min，得到粗提液；采用超临界流体二氧化碳对粗提液进行萃取，得到核桃蛋白萃取液，其中，超临界流体萃取的条件为：超临界温度为50℃，超临界压力为25MPa，提取时间为1h，CO₂流速为6L/min；使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为21.6%。

实施案例6

将10g核桃仁进行40min机械预处理球磨成粉末，石油醚脱脂，并与60ml的50%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在45℃和pH=7.5的条件下，加入0.006g木瓜蛋白水解酶酶解20min，得到粗提液；采用超临界流体二氧化碳对粗提液进行萃取，得到核桃蛋白萃取液，其中，超临界流体萃取的条件为：超临界温度为55℃，超临界压力为25MPa，提取时间为1.5h，CO₂流速为7L/min；使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为22.6%。

实施案例7

将10g核桃仁进行30min机械预处理球磨成粉末，石油醚脱脂，并与60ml的40%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在35℃和pH=8.0的条件下，加入0.004g木瓜蛋白水解酶酶解15min，得到粗提液；采用超临界流体二氧化碳对粗提液进行萃取，得到核桃蛋白萃取液，其中，超临界流体萃取的条件为：超临界温度为40℃，超临界压力为25MPa，提取时间为1.0h，CO₂流速为6L/min；使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在D3520大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为12.7%。

实施案例8

将10g核桃仁进行30min机械预处理球磨成粉末，石油醚脱脂，并与60ml的10%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在45℃和pH=6.0的条件下，加入0.005g木瓜蛋白水解酶酶解10min，得到粗提液；采用超临界流体二氧化碳对粗提液进行萃取，得到核桃蛋白萃取液，其中，超临界流体萃取的条件为：超临界温度为45℃，超临界压力为25MPa，提取时间为1.0h，CO₂流速为6L/min；使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在D3520大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为13.4%。

实施案例9

将10g核桃仁进行30min机械预处理球磨成粉末，石油醚脱脂，并与60ml的20%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在35℃和pH=6.5的条件下，加入0.005g木瓜蛋白水解酶酶解10min，得到粗提液；采用超临界流体二氧化碳对粗提液进行萃取，得到核桃蛋白萃取液，其中，超临界流体萃取的条件为：超临界温度为40℃，超临界压力为25MPa，提取时间为2.0h，CO₂流速为7L/min；使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在D3520大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为14.9%。

对比例1

对比例采用一般的传统方法提取核桃蛋白。将10g核桃仁进行30min机械球磨成固体粉末，石油醚脱脂，将核桃仁压榨至其中油脂的质量百分含量小于10%并与60ml的20%乙醇溶液混合，充分搅拌均匀，在35℃和pH=6.5的条件下，加入0.008g木瓜蛋白水解酶酶解10min，得到粗提液。使用D3520大孔树脂对萃取液进行吸附，吸附1h，依次使用5%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇及35%乙醇对吸附在D3520大孔树脂上的滤液进行洗脱，收集不同梯度洗脱后的洗脱液，合并后获得核桃蛋白洗脱液；对所述核桃蛋白洗脱液进行减压浓缩，使用冷冻干燥技术进行干燥，获得较高纯度的核桃蛋白固体，使用BCA法检测总蛋白含量，得率为8.0%。