阅读说明：本技术 检测伤寒与副伤寒的试剂盒及其应用 (Kit for detecting typhoid and paratyphoid and application thereof ) 是由 张小龙 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种检测伤寒与副伤寒的试剂盒,包括：V型底的微量反应板、沙黄溶液、肥达氏抗原和外斐氏抗原；所述肥达氏抗原包括：伤寒沙门氏菌O、伤寒沙门氏菌H、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌；所述外斐氏抗原包括：变形杆菌OX19、变形杆菌OX2和变形杆菌OXK。在检测过程中,阳性血清样本与所述肥达氏抗原或所述外斐氏抗原在微量反应板孔底的形成的凝集,配合以沙黄溶液与所述肥达氏抗原和外斐氏抗原的显色作用,使得对于伤寒与副伤寒的检测结果判断更清晰、准确。(The invention provides a kit for detecting typhoid and paratyphoid, which comprises: a V-shaped bottom micro-reaction plate, a Shahuang solution, a Felidae antigen and a Murphy antigen; the widal antigen includes: salmonella typhi O, Salmonella typhi H, Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, and Salmonella paratyphi C; the exofei antigen comprises: bacillus proteus OX19, Bacillus proteus OX2, and Bacillus proteus OXK. In the detection process, the positive serum sample and the feddal antigen or the ectofephne antigen are agglutinated at the bottom of the hole of the micro-reaction plate, and the chromogenic action of the saffron solution and the feddal antigen and the ectofephne antigen is matched, so that the detection result judgment of the typhoid fever and the paratyphoid fever is clearer and more accurate.)

检测伤寒与副伤寒的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体涉及一种检测伤寒与副伤寒的试剂盒及其应用。

背景技术

伤寒是由肠沙门菌肠亚种中伤寒血清型引起的肠道传染病，副伤寒是由肠沙门菌肠亚种中副伤寒甲或乙或丙血清型引起的一种和伤寒相似的疾病。副伤寒甲、乙的症状与伤寒相似，但一般病情较轻，病程较短，病死率较低；副伤寒丙的症状较为不同，可表现为轻型伤寒，急性胃肠炎或脓毒血症。伤寒和副伤寒可因水源和食物污染发生爆发流行。

肥达反应和外斐反应是传统的用于检测伤寒与副伤寒的方法，但是传统的肥达反应、外斐反应的检测方法主要是试管凝集法，其主要存在如下问题：1、操作较繁琐，需要用到大量的试管，且所需检测试剂的加样量大。2、水浴箱孵育后肉眼较难清晰判断结果，不容易判断是否完全发生凝集反应。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种检测伤寒与副伤寒的试剂盒及其应用，以使检测伤寒与副伤寒的方法更简便、结果更清晰，且能够减少检测试剂的消耗、节约成本。

具体技术方案如下：

一种检测伤寒与副伤寒的试剂盒，包括：

V型底的微量反应板、沙黄试剂、肥达氏抗原和外斐氏抗原；

所述肥达氏抗原包括：伤寒沙门氏菌O、伤寒沙门氏菌H、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌；

所述外斐氏抗原包括：变形杆菌OX19、变形杆菌OX2和变形杆菌OXK。

本发明还提供了如上所述的肥达外斐试验用试剂盒的应用，具体技术方案如下：

如上所述的检测伤寒与副伤寒的试剂盒在制备检测伤寒与副伤寒引起的传染病的体外辅助诊断试剂套件中的应用。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的检测伤寒与副伤寒的试剂盒中包括V型底的微量反应板，肥达氏抗原、外斐氏抗原、和沙黄试剂，在将试剂盒用于检测伤寒与副伤寒时，将每种肥达氏抗原和外斐氏抗原分别与沙黄溶液混合后，再分别与待测血清样本混合，其中，可能含有针对伤寒及/或副伤寒菌的抗体的血清与伤寒沙门氏菌O、伤寒沙门氏菌H、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌中发生凝集反应，且变形杆菌OX19、变形杆菌OX2和变形杆菌OXK与立克次体具有共同的表面抗原，与可能含有针对立克次体的抗体的血清发生凝集反应，在检测过程中，阳性血清样本与所述肥达氏抗原或所述外斐氏抗原在微量反应板孔底的形成的凝集，配合以沙黄溶液与所述肥达氏抗原和外斐氏抗原的显色作用，使得对于伤寒与副伤寒的检测结果判断更清晰、准确。

在将该试剂盒用于检测伤寒与副伤寒时，相对于传统的肥达、外斐反应采用试管进行试验，采用V型底的微量反应板时，在孵育后，未与抗体发生凝集反应的菌体顺着V型底更加集中地沉淀于反应板底部，抗原-抗体发生凝集反应后，产生的梅花型凝集更易通过肉眼分辨，且无需传统肥达、外斐反应采用试管检测时需要先观察澄清度，再轻轻摇晃试管观察的较复杂的步骤，避免了这一步骤中操作繁琐性，也避免了摇晃力度不合适导致观察产生的误差。

而且，V型底的微量反应板通常为规格化产品，与排式加样枪适配，有利于配合采用排式加样枪操作用于检测，一方面微量反应板每次检测仅消耗少量检测试剂，另一方面排式加样提高检测效率、同时还可尽量避免传统方法中多支试管分次加样容易导致的误差。

本发明所述的试剂盒有利于提高伤寒与副伤寒引起的传染病的体外辅助诊断的效率，适用于临床推广。

附图说明

图1-2为实施例1所述的试剂盒用于检测伤寒与副伤寒的血清测试结果；

图3为阳性对照血清(++)的检测结果示意图；

图4-8为(++++)、(+++)、(+)、(±)和(－)各凝集反应结果对应的示例图；

图9为阴性对照血清的检测结果示意图；

图10-14为采用传统方法检测的不同凝集效果的示意图；

图15为对比例2的阳性血清的结果示意图；

图16为对比例2的阴性血清的结果示意图；

图17为对比例3的检测结果示意图；

图18为对比例4的阳性血清的结果示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

一种检测伤寒与副伤寒的试剂盒，其特征在于，包括：

V型底的微量反应板、沙黄试剂、肥达氏抗原和外斐氏抗原；

所述肥达氏抗原包括：伤寒沙门氏菌O、伤寒沙门氏菌H、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌；

所述外斐氏抗原包括：变形杆菌OX19、变形杆菌OX2和变形杆菌OXK。

优选地，所述V型底的微量反应板为光学透明的V型底96孔板。

优选地，所述沙黄试剂为沙黄溶液。更优选地，所述沙黄溶液的浓度为0.3％-0.7％。

优选地，所述肥达氏抗原的贮存浓度如下：

所述伤寒沙门氏菌O的浓度为6.0×10⁹～8.0×10⁹个菌/mL；

所述伤寒沙门氏菌H的浓度为6.0×10⁹～8.0×10⁹个菌/mL；

所述甲型副伤寒沙门氏菌的浓度为6.0×10⁹～8.0×10⁹个菌/mL；

所述乙型副伤寒沙门氏菌的浓度为6.0×10⁹～8.0×10⁹个菌/mL；

所述丙型副伤寒沙门氏菌的浓度为6.0×10⁹～8.0×10⁹个菌/mL；

所述外斐氏抗原的贮存浓度如下：

所述变形杆菌OX19的浓度为6.0×10⁹～8.0×10⁹个菌/mL；

所述变形杆菌OX2的浓度为6.0×10⁹～8.0×10⁹个菌/mL；

所述变形杆菌OXK的浓度为6.0×10⁹～8.0×10⁹个菌/mL。

优选地，所述肥达氏抗原和所述外斐氏抗原的贮存温度为：2-8℃。

优选地，在使用所述试剂盒时，所述肥达氏抗原的浓度如下：

所述伤寒沙门氏菌O的浓度为6.0×10⁸～8.0×10⁸个菌/mL；

所述伤寒沙门氏菌H的浓度为6.0×10⁸～8.0×10⁸个菌/mL；

所述甲型副伤寒沙门氏菌的浓度为6.0×10⁸～8.0×10⁸个菌/mL；

所述乙型副伤寒沙门氏菌的浓度为6.0×10⁸～8.0×10⁸个菌/mL；

所述丙型副伤寒沙门氏菌的浓度为6.0×10⁸～8.0×10⁸个菌/mL；

所述外斐氏抗原的浓度如下：

所述变形杆菌OX19的浓度为6.0×10⁸～8.0×10⁸个菌/mL；

所述变形杆菌OX2的浓度为6.0×10⁸～8.0×10⁸个菌/mL；

所述变形杆菌OXK的浓度为6.0×10⁸～8.0×10⁸个菌/mL。

优选地，在使用所述试剂盒时，所述V型底的微量反应板被分为至少八组孔；

在所述V型底的微量反应板的第一组孔中，所述伤寒沙门氏菌O、所述沙黄溶液与第一组待测血清混合；

在所述V型底的微量反应板的第二组孔中，所述伤寒沙门氏菌H、所述沙黄溶液与第二组待测血清混合；

所述V型底的微量反应板的第三组孔中，所述甲型副伤寒沙门氏菌、所述沙黄溶液与第三组待测血清混合；

所述V型底的微量反应板的第四组孔中，所述乙型副伤寒沙门氏菌、所述沙黄溶液与第四组待测血清混合；

所述V型底的微量反应板的第五组孔中，所述丙型副伤寒沙门氏菌、所述沙黄溶液与第五组待测血清混合；

所述V型底的微量反应板的第六组孔中，所述变形杆菌OX19、所述沙黄溶液与第六组待测血清混合；

所述V型底的微量反应板的第七组孔中，所述变形杆菌OX2、所述沙黄溶液与第七组待测血清混合；

所述V型底的微量反应板的第八组孔中，所述变形杆菌OXK、所述沙黄溶液与第八组待测血清混合。

优选地，所述伤寒沙门氏菌O、伤寒沙门氏菌H、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、变形杆菌OX19、变形杆菌OX2和变形杆菌OXK分别与所述沙黄溶液的体积比为1：(9～11)。

优选地，所述的检测伤寒与副伤寒的试剂盒，还包括无菌生理盐水。

优选地，在使用所述试剂盒时，将所述V型底的微量反应板置35～37℃电热恒温培养箱中孵育16～20h后判读结果。

实施例1

本实施例提供一种检测伤寒与副伤寒的试剂盒，其组成包括：

其中，肥达氏抗原与外斐氏抗原置于2-8℃冰箱中保存，使用前取出，平衡到室温(15-28℃)后使用。使用时分别用0.9％无菌生理盐水10倍稀释成含菌7.0×10⁸个菌/mL的菌悬液，并分别与无菌沙黄溶液以1:10混合后使用。配制方法为现配现用。

实施例2

本实施例提供实施例1所述的试剂盒的检测方法，具体如下：

1、准备

将至于冰箱中保存的试剂(伤寒沙门氏菌O、伤寒沙门氏菌H、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、变形杆菌OX19、变形杆菌OX2、变形杆菌OXK)取出，平衡至室温(15-28℃)。

用0.9％无菌生理盐水将上述试剂10倍稀释成含菌7.0×10⁸个菌/mL，然后加入10倍体积的无菌沙黄溶液。其中，无菌沙黄溶液的浓度为：0.5％。

2、检测

1)待测血清样本、8种阳性血清样本(伤寒沙门氏菌O阳性的血清、伤寒沙门氏菌H阳性的血清、甲型副伤寒沙门氏菌阳性的血清、乙型副伤寒沙门氏菌阳性的血清、丙型副伤寒沙门氏菌阳性的血清、变形杆菌OX19阳性的血清、变形杆菌OX2阳性的血清、变形杆菌OXK阳性的血清)，分别先用生理盐水按照每50μL生理盐水+950μL的0.9％无菌生理盐水进行稀释，备用；

其中8中阳性血清样本来源临床检测样本(临床确认为伤寒感染)

2)在V型板中进一步对血清更一步做倍比稀释：

每份血清选择8行V型孔，每行7孔，除每行第一孔外，其余的行每孔分别加入生理盐水50ul；在每行第1、2孔分别加入50μl稀释后的待检血清；然后从每行第2孔开始，进行吸样量为50μl倍比稀释操作(使用排式加样枪批量吸样，7行检测项可同时稀释)至每行的第5孔；即每行的1-5孔的血清浓度依次为1：20、1：40、1：80、1：160、1：320，每行第6孔作阴性对照，第7孔加入阳性对照(稀释后的阳性血清)；

3)在V型板的每行依次标记为O、H、甲、乙、丙、OX19、OX2、Oxk，分别依次对应加入步骤1准备的混有沙黄溶液的伤寒沙门氏菌O、伤寒沙门氏菌H、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、变形杆菌OX19、变形杆菌OX2、变形杆菌OXK，各50μl。最终每行血清稀释度依次为1：40、1：80、1：160、1：320、1：640。

4)混匀，将V孔板放在密封袋里(不需要密封)置35-37℃电热恒温培养箱中孵育16-20h判读结果。如图1、图2所示。

3、结果判断

阳性V型孔底出现梅花形凝集(染色液可增强阳性结果判断更清晰)与阳性对照孔凝集现象一致，示例如图3所示，凝集反映结果定为(++)。以此结果为标准，判断血清样品检测结果的凝集反应结果判断为：(++++)、(+++)、(++)、(+)、(±)和(－)，以呈现(++)的血清最高稀释度为终点效价。各凝集反应结果对应的示例图关系如下表：

凝集反应结果	附图
		(++++)	图4
(+++)	图5
		(++)	图3
(+)	图6
		(±)	图7
(－)	图8

3.2阴性菌液沉于V型孔底部(染色液可增强结果判断更清晰)，且集中于一点，与阴性对照孔相同，示例如图9所示。其中，集中为一点的为菌液沉淀，未发生凝集反应。

对比例1传统试管凝集法

本对比例提供一种传统试管凝集法检测伤寒与副伤寒的方法，具体如下：

1)7.6ml无菌生理盐水+0.4ml血清，将血清稀释20倍。

2)取口径一致的小试管7×8排列，第一横排每管加入0.5ml步骤1)稀释好的血清，8管共用去4ml，剩余4ml血清再补加4ml无菌生理盐水作倍比稀释(1:40)后加入第二横排；并用同样的倍比稀释法稀释加入第三排、第四排、第五排。在第六排试管中加入0.5ml的无菌生理盐水作阴性对照，第七排加入阳性血清作为阳性对照。

从第一至第五横排的最终浓度依次为1：40、1：80、1：160、1：320、1：640。

3)菌液稀释，并用于检测：

3.15ml生理盐水+0.35ml伤寒沙门氏菌O，第1竖排，每孔0.5ml；

3.15ml生理盐水+0.35ml伤寒沙门氏菌H，第2竖排，每孔0.5ml；

3.15ml生理盐水+0.35ml甲型副伤寒沙门氏菌，第3竖排，每孔0.5ml；

3.15ml生理盐水+0.35ml乙型副伤寒沙门氏菌，第4竖排，每孔0.5ml；

3.15ml生理盐水+0.35ml丙型副伤寒沙门氏菌，第5竖排，每孔0.5ml；

3.15ml生理盐水+0.35ml变形杆菌OX19，第6竖排，每孔0.5ml；

3.15ml生理盐水+0.35ml变形杆菌OX2，第7竖排，每孔0.5ml；

3.15ml生理盐水+0.35ml变形杆菌OXK，第8竖排，每孔0.5ml。

4)混匀后置于37℃水箱24h，判读结果。

其中，先观察液体部分清晰程度，然后轻轻摇动试管，观察管底有无凝块浮起：

A.液体澄清、管底有凝块、细菌完全凝集者(100％凝集)，为++++。示例如图10所示。

B.液体微混浊、管底有明显凝块、细菌大部分凝集者(75％凝集)，为+++。示例如图11所示。

C.液体较混浊、管底有明显凝块、细菌中度凝集者(50％凝集)，为++。示例如图12所示。

D.液体混浊、管底无凝块、细菌轻度凝集者(25％凝集)，为+。示例如图13所示。

E.液体混浊、无凝集现象，为阴性。示例如图14所示。

对比各图效果可知，A与B对应的图10和图11效果接近、C和D对应的图12和图13效果接近，可见，传统方法水浴箱孵育后肉眼较难清晰判断结果，不容易判断是否完全发生凝集反应。

对比例2

本对比例步骤与对比例1基本相同，其中主要区别在于，3)菌液稀释时，3.15ml生理盐水替换为了3.15ml无菌沙黄溶液。

其阳性血清的结果如图15所示。阴性对照结果如图16所示。

可见，当采用传统方法时，即便是采用无菌沙黄溶液染色，其水浴箱孵育后肉眼较难清晰判断结果，不容易判断是否完全发生凝集反应。

对比例3

本对比例的主要步骤与实施例2基本相同，其中，区别仅在于，实施例2中的“加入10倍体积的无菌沙黄溶液”，在本对比例中，替换为加入10倍体积的无菌生理盐水。其余步骤相同。

判读结果如图17所示。可见，肉眼较难判断是否发生凝集反应。

对比例4

本对比例的主要步骤与实施例2基本相同，其中，区别仅在于，实施例2中的“加入10倍体积的无菌沙黄溶液”，在本对比例中，替换为“加入10倍体积的龙胆紫溶液”。其余步骤相同。

对于阳性血清的检测判读结果图18所示。可见，肉眼也很难判断是否发生凝集反应。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。