阅读说明：本技术 一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法 (separation culture method for mycoplasma capricolum goat pneumonia subspecies ) 是由 陈胜利 储岳峰 郝华芳 颜新敏 袁婷 张晓亮 刘永生 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法,包括以下步骤：(1)病料样品处理,得到处理好的样品液；(2)样品接种：将处理好的样品液或用无菌的0.01MpH7.2PBS稀释得到的稀释后的样品液接种7-8日龄健康SPF鸡胚,接种后,将SPF鸡胚置于孵化箱继续孵育,孵化箱温度37.0～37.5℃,湿度50％；(3)收获：观察鸡胚的存活情况,将接种后死亡鸡胚置4℃保存12-24h,收集鸡胚尿囊液。本发明方法可方便、快速的用于山羊支原体山羊肺炎亚种的分离培养,可方便快速获得不含动物血清的山羊支原体山羊肺炎亚种抗原,可克服血清使用带来的诸多问题。(The invention provides a separation culture method of mycoplasma capricolum goat pneumonia subspecies, which comprises the following steps: (1) treating a disease sample to obtain a treated sample solution; (2) sample inoculation: inoculating 7-8-day-old healthy SPF (specific pathogen free) chick embryos with the treated sample liquid or diluted sample liquid obtained by diluting with sterile 0.01MpH7.2PBS, and after inoculation, placing the SPF chick embryos in an incubator to continue incubation, wherein the temperature of the incubator is 37.0-37.5 ℃, and the humidity is 50%; (3) harvesting: observing the survival condition of the chick embryos, storing the dead chick embryos after inoculation at 4 ℃ for 12-24h, and collecting the chick embryo allantoic fluid. The method can be conveniently and quickly used for the separation culture of mycoplasma capricolum subspecies pneumonia of goat, can conveniently and quickly obtain mycoplasma capricolum subspecies pneumonia antigen without animal serum, and can overcome a plurality of problems caused by the use of serum.)

一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法。

背景技术

山羊传染性胸膜肺炎，主要由山羊支原体山羊肺炎亚种引起，是OIE法定报告疫病。临床上主要表现为发烧、咳嗽、流鼻涕、呼吸困难等。在新发疫区往往具有发病率高和死亡率高特点，给养羊业带来严重威胁和经济损失。

山羊传染性胸膜肺炎目前主要在亚洲和非洲一些国家或地区流行，但病原分离报道很少，主要是由于山羊支原体山羊肺炎亚种对营养要求极高，难于培养，此外分离病料要求高。我国大部分省市养羊区域该病血清学阳性，但分离菌株却很少报道。

山羊支原体山羊肺炎亚种非常难于培养，该病原引起的疾病-山羊传染性胸膜肺炎最早于1873年发现，100多年后其病原山羊支原体山羊肺炎亚种才被分离出来。我国在上世纪20年代就有山羊传染性胸膜肺炎的报道，2007年哈尔滨兽医研究所首次分离出该病原，同年兰州兽医研究所实验室分离出该病原。山羊支原体山羊肺炎亚种难于培养很重要原因是没有适宜培养方法和培养基。目前，山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养最常用培养基为改良Thiaucourt's培养基(MTB培养基)。改良Hayflick’s培养基、改良KM2培养基等也被用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种，培养滴度不及改良Thiaucourt's培养基。现有技术培养基成分复杂，含有碳源、氮源、蛋白质、无机盐等诸多营养组分，往往多达8～15种甚至更多，配制步骤繁琐，仍存在活菌滴度低、繁殖能力差等问题。此外，山羊支原体山羊肺炎亚种体外生长培养依赖一定浓度动物血清，现有技术培养基中血清含量通常为10％～25％之间，低血清高效培养基为该病疫苗研发奠定了良好基础。血清来源、质量和批次容易导致培养基批间差异较大、成本高等问题，此外，含血清抗原存在易增加副反应影响免疫效果、生物安全等问题。

鸡胚通常被用来分离新城疫病毒、流感病毒等。目前，国内外尚未见到用鸡胚培养法分离培养山羊支原体山羊肺炎亚种研究报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法。

本发明提供一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法，包括以下步骤：

(1)病料样品处理，得到处理好的样品液；

(2)样品接种：将处理好的样品液或用无菌的0.01M pH7.2 PBS稀释得到的稀释后的样品液接种7-8日龄健康SPF鸡胚，接种后，将SPF鸡胚置于孵化箱继续孵育，孵化箱温度37.0～37.5℃，湿度50％；

(3)收获：观察鸡胚的存活情况，将接种后死亡鸡胚置4℃保存12-24h，收集鸡胚尿囊液。

作为优选，步骤(1)中，所述病料样品为发病死亡山羊的新鲜病料胸水或肺泡灌洗液。

作为优选，步骤(1)中，所述病料样品处理是将发病死亡山羊的新鲜病料胸水或肺泡灌洗液用0.45μm滤膜的无菌滤器过滤，对滤过样品液进行灭菌。

作为优选，步骤(2)中，所述接种为卵黄囊接种，接种量为每枚鸡胚接种0.2ml。

作为优选，步骤(2)中，所述健康SPF鸡胚的标准为：血管清晰、鸡胚活力旺盛。

作为优选，步骤(3)中，将接种1-12天后死亡的鸡胚置4℃保存12-24h。

本发明还提供上述山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法在山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养中的应用。

本发明的有益效果为：

与现有技术相比，本发明方法不需要配制成分复杂、步骤繁琐的山羊支原体山羊肺炎亚种培养基，避免了现有技术培养基因血清批间差异不稳定的问题，同时本发明方法SPF鸡胚成本较低，获取方便，具有分离成功率高、活菌滴度高等优点。本发明方法可用于方便、快速的用于山羊支原体山羊肺炎亚种的分离培养，可方便快速获得不含动物血清的山羊支原体山羊肺炎亚种抗原，可克服血清使用带来的诸多问题。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为鸡胚尿囊液PCR产物电泳结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

本发明的山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法步骤如下：

(1)病料样品处理：无菌收集发病死亡山羊新鲜病料如胸水、肺泡灌洗液等，用0.45μm滤膜的无菌滤器过滤，收集滤过液。吸取1.0ml滤过液置于无菌EP管中，加入200μl20万IU青霉素，充分混匀，置4℃作用12～24小时，保存备用。

(2)样品接种：将处理好的样品液用无菌的0.01MpH7.2 PBS 10倍稀释，制备10^-1稀释度的样品液，将样品处理液、10^-1稀释度的样品液卵黄囊接种7～8日龄健康SPF鸡胚(血管清晰、鸡胚活力旺盛)，每枚鸡胚接种0.2ml，样品处理原液、10^-1稀释度样品处理液各接种2～3枚7～8日龄健康SPF鸡胚。样品接种完成后，将鸡胚置孵化箱继续孵育12天，孵化箱温度37.0～37.5℃，湿度50％。

(3)收获：每天观察鸡胚的存活情况，将接种后1～12天死亡鸡胚置4℃保存12～24h，收获鸡胚尿囊液置于无菌试管或EP管，标记。

实施例1

胸水样品中分离山羊支原体山羊肺炎亚种的方法如下：

(1)病料样品处理：无菌收集山羊支原体山羊肺炎亚种发病死亡山羊新鲜病料胸水，用0.45μm滤膜的无菌滤器过滤，滤过液保存备用。吸取1.0ml滤过样品液置于无菌EP管中，加入200μl 20万IU青霉素，充分混匀，置4℃作用24小时，保存备用。

(2)样品接种：将处理好的样品液用无菌的0.01M pH7.2 PBS 10倍稀释，制备10-¹稀释度的样品液，将样品处理液、10^-1稀释度的样品液卵黄囊接种7日龄健康SPF鸡胚(血管清晰、鸡胚活力旺盛)，每枚鸡胚接种0.2ml，样品处理原液、10^-1稀释度样品处理液各接种2枚7日龄健康SPF鸡胚。样品接种完成后，将鸡胚置孵化箱继续孵育12天，孵化箱温度37.0～37.5℃，湿度50％。

(3)收获：每天观察鸡胚的存活情况，将接种后1～12天死亡的鸡胚置4℃保存20h，收获鸡胚尿囊液置于无菌试管或EP管，标记。

(4)取部分鸡胚尿囊液进行山羊支原体山羊肺炎亚种PCR鉴定和活菌滴度测定。PCR鉴定：上游引物：5’-ATCATTTTTAATCCCTTCAAG-3’，下游引物：5’-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA-3’；PCR体系：PCRmix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA 2μL，ddH₂O 8.5μL，25μl体系；PCR反应条件：95℃5min，35个循环(95℃30s，47℃30s，72℃25s)，72℃10min，4℃保存。目的片段316bp。

结果显示，胸水样品接种1天后鸡胚开始死亡，收集死亡鸡胚尿囊液，接种支原体培养基，培养基颜色变黄，活菌滴度达10⁸CCU/ml；对尿囊液进行山羊支原体山羊肺炎亚种PCR鉴定，PCR反应阳性，结果见图1。结果表明，应用本发明方法，可以从胸水样品分离出山羊支原体山羊肺炎亚种，且活菌滴度高。

实施例2

肺泡灌洗液样品中分离山羊支原体山羊肺炎亚种的方法如下：

(1)病料样品处理：无菌收集山羊支原体山羊肺炎亚种发病死亡山羊的肺泡灌洗液，用0.45μm滤膜的无菌滤器过滤，滤过液保存备用。吸取1.0ml滤过样品液置于无菌EP管中，加入200μl 20万IU青霉素，充分混匀，置4℃作用24小时，保存备用。

(2)样品接种：将处理好的样品液用无菌的0.01M pH7.2 PBS 10倍稀释，制备10^-1稀释度的样品液，将样品处理液、10^-1稀释度的样品液卵黄囊接种7日龄健康SPF鸡胚(血管清晰、鸡胚活力旺盛)，每枚鸡胚接种0.2ml，样品处理原液、10^-1稀释度样品处理液各接种2枚7日龄健康SPF鸡胚。样品接种完成后，将鸡胚置孵化箱继续孵育12天，孵化箱温度37.0～37.5℃，湿度50％。

(3)收获：每天观察鸡胚的存活情况，将接种后1～12天死亡的鸡胚置4℃保存20h。收获鸡胚尿囊液置于无菌试管或EP管，标记。

(4)取部分鸡胚尿囊液进行山羊支原体山羊肺炎亚种PCR鉴定和活菌滴度测定。PCR鉴定：上游引物：5’-ATCATTTTTAATCCCTTCAAG-3’，下游引物：5’-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA-3’；PCR体系：PCRmix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA 2μl，ddH₂O 8.5μL，25μl体系；PCR反应条件：95℃5min，35个循环(95℃30s，47℃30s，72℃25s)，72℃10min，4℃保存。目的片段316bp。

结果显示，肺泡灌洗液样品接种鸡胚，收集死亡鸡胚置4℃保存备用。收集死亡鸡胚尿囊液，接种支原体培养基(改良Thiaucourt's培养基)，培养基颜色变黄，活菌滴度达10⁹CCU/ml；对尿囊液进行山羊支原体山羊肺炎亚种PCR鉴定，PCR反应阳性，结果见图1。结果表明，应用本发明方法，可以从肺泡灌洗液样品分离出山羊支原体山羊肺炎亚种，且活菌滴度高。

图1为鸡胚尿囊液PCR产物电泳结果。其中，M为DL5000 DNAMarker，1为胸水样品收集鸡胚尿囊液PCR产物，2为肺泡灌洗液样品收集鸡胚尿囊液PCR产物，3为阳性对照，4为阴性对照。

实施例3

本发明方法与现有技术培养基对山羊支原体山羊肺炎亚种分离比较。

在相同条件下，用本发明方法与现有技术(改良Thiaucourt's培养基)对病料(山羊支原体山羊肺炎亚种PCR阳性)进行分离。具体方法如下：无菌收集处理发病死亡山羊的胸水或肺泡灌洗液4份，用0.45μm滤膜的无菌滤器过滤，滤过液保存备用。吸取1.0ml滤过样品液按本发明方法进行分离培养；另取0.5ml接种至4.5ml改良Thiaucourt's培养基，37℃培养箱中培养，根据培养基颜色变化和PCR鉴定结果判定山羊支原体山羊肺炎亚种的分离情况。结果见表1。

其中，改良Thiaucourt's培养基的配方为：PPLO肉汤(21g/L)、丙酮酸钠(2g/L)、葡萄糖(2g/L)、25％酵母浸出液(100mL/L)、1％酚红(2.5mL/L)、灭活马血清(200mL/L)、青霉素(20万IU/L)，去离子水(700ml/L)，用1mol/LNaOH调节pH至7.2～7.6。

表1

结果显示，本发明方法可从病料中全部分离出山羊支原体山羊肺炎亚种，分离率100％(4/4)，改良Thiaucourt's培养基也可从4份病料中全部分离出山羊支原体山羊肺炎亚种。

对于胸水病料，本发明方法分离菌活菌滴度达10⁷～10⁸CCU/ml，高于常规改良Thiaucourt's培养基分离菌活菌滴度(10⁶～10⁷CCU/ml)。对于灌洗液病料，本发明方法分离菌活菌滴度达10⁹CCU/ml，明显高于常规改良Thiaucourt's培养基分离菌活菌滴度(10⁷～10⁸CCU/ml)。结果表明，本发明方法具有山羊支原体山羊肺炎亚种分离成功率高、活菌滴度高等优点，可方便快速获得不含动物血清的山羊支原体山羊肺炎亚种抗原，可克服血清使用带来的诸多问题。此外，还具有成本低、步骤简单、易操作、易基层推广、操作方便等其他优点。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。