阅读说明：本技术 一种蛇足石杉内生绿藻及其应用 (Huperzia serrata endophytic green algae and application thereof ) 是由 郭斌 冯雅娜 黄瑞珂 李梦青 尉亚辉 于 2019-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种蛇足石杉内生绿藻及其应用,该绿藻的分类命名为胶球藻(Coccomyxa sp.),保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期：2019年4月26日,保藏编号：CGMCC17587,将该胶球藻辅助于蛇足石杉无菌材料的建立和野生植株的移栽,可显著提高蛇足石杉无菌材料和野生植株的移栽成活率。本专利为蛇足石杉无菌材料的建立和野生植株的移栽提供重要的方法。(The invention discloses a huperzia serrata endophytic green alga and application thereof, wherein the green alga is classified and named as glomus alatus (Coccomyxa sp.), and the preservation unit: china general microbiological culture Collection center (CGMCC), the preservation unit address: west road No. 1 hospital No. 3, north jing, chaoyang district, preservation date: 26/4/2019, accession number: CGMCC17587, which is used for assisting in the establishment of huperzia serrata sterile material and the transplantation of wild plants, can significantly improve the survival rate of the huperzia serrata sterile material and the transplantation of the wild plants. The patent provides an important method for establishing the huperzia serrata sterile material and transplanting the wild plants.)

一种蛇足石杉内生绿藻及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛇足石杉内生绿藻及其应用。

背景技术

蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)为石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉属(Lycopodium L.)多年生草本蕨类植物。蛇足石杉在民间主要用于治疗跌打肿痛、内伤出血、毒虫毒蛇咬伤、烧伤烫伤等病症。蛇足石杉生长缓慢，野生状态其的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6-15 年才能成熟。

1927年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用，之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。现在，被石杉碱甲及经作为治疗阿尔茨海默病(AD，Alzheimer disease)的药物，同时在美国被用做益智的营养保健品。目前，由于化学合成的石杉碱甲临床副作用较大，其来源主要依赖于野生资源，提取率仅为0.006％-0.1％。因此，逐年下去，野生蛇足石杉的资源面临枯竭，而且其生长地的生态环境面临人为严重破坏。

因此，人们开始通过两条途径占看对野生蛇足石杉和当地生态环境的保护。第一个是通过植物组织培养平台大量繁殖蛇足石杉；第二个是通过对野生蛇足石杉的异地移栽从而减轻对当地生态环境的破坏。但是无论是在蛇足石杉人工繁殖方面还是异地移栽方面都没有实现产业化，其原因就是成功率太低。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种蛇足石杉内生绿藻，该腐绿藻的分类命名为胶球藻(Coccomyxa sp.)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年04月26日，保藏编号：CGMCC17587，并利用CGMCC17587提高蛇足石杉无菌材料的培养效率和野生植株的移栽成活率。

一种蛇足石杉内生绿藻，所述蛇足石杉内生绿藻的名称为胶球藻，Coccomyxasp.，该胶球藻的保藏编号为CGMCC17587。

本发明所述的蛇足石杉内生绿藻用于制备蛇足石杉无菌材料培养基的应用。

可选的，按质量百分数计，将5％～15％的蛇足石杉内生绿藻菌体培养液加入MS培养基即得。

可选的，按质量百分数计，将10％的蛇足石杉内生绿藻的菌体培养液加入MS培养基即得。

可选的，所述的蛇足石杉内生绿藻菌体培养液的制备包括：蛇足石杉内生绿藻采用 MS培养基进行摇瓶液体培养，培养温度30℃，摇床转速60转/分钟，培养20天后，收集上清液即得。

可选的，用蛇足石杉无菌材料培养基进行蛇足石杉无菌材料的培养方法包括：将蛇足石杉无菌材料接种到蛇足石杉无菌材料培养基中，培养温度为25℃，光照强度为2500Lux，培养时间为60天。

本发明所述的蛇足石杉内生绿藻用于制备蛇足石杉植株移栽促生液的应用。

可选的，所述的蛇足石杉植株移栽促生液为蛇足石杉内生绿藻菌体培养液。

可选的，蛇足石杉内生绿藻菌体培养液的制备包括：蛇足石杉内生绿藻采用MS培养基进行摇瓶液体培养，培养温度30℃，摇床转速60转/分钟，培养20天后，收集上清液即得。

可选的，蛇足石杉植株移栽促生液用于移栽蛇足石杉植株的方法包括：蛇足石杉植株移栽促生液浸泡蛇足石杉植株2～6h，然后移栽到青苔培养基质温室培养。

本发明的优点为：

(1)本发明在蛇足石杉植株的孢子囊中分离出绿藻及其应用，该绿藻的分类命名为胶球藻(Coccomyxa sp.)，保藏编号为CGMCC17587，将该胶球藻辅助于蛇足石杉无菌材料的建立和野生植株的移栽，可显著提高蛇足石杉无菌无菌茎尖和野生植株的移栽成活率；

(2)通过在蛇足石杉无菌茎尖培养基中添加10％的胶球藻培养液，可使得蛇足石杉无菌茎尖的成活率提高129％；将野生蛇足石杉全株浸泡在滤液中4小时后再移栽，可使得蛇足石杉移栽成活率提高46％。

具体实施方式

以下如无特殊说明，涉及试剂或液体的加入量中，出现的％指的是体积百分浓度。

本发明试验中用于分离内生绿藻的蛇足石杉的采集地点是湖北省恩施地区，湖北省恩施市盛家坝乡，经纬度：109°18′/29°57′。

蛇足石杉无菌材料，包括蛇足石杉无菌茎尖，是指采用常规灭菌方法(如对照例1)获取的无菌材料(茎尖)。

MS培养基是指常规在植物组织培养中使用的经典培养基。

青苔培养基质是指用市面上(花卉市场等)购买的青苔，然后用水浸泡饱和后的培养介质，放入花盆中即可用于植物种苗的种植。

茎尖成活率是指在茎尖培养60天后，呈现绿色生长旺盛的茎尖在当时接种的茎尖总数的百分比，如果茎尖50％褪绿发褐或变灰变黑，则认为死亡。

移栽植株成活率是指在植株移栽60天后，呈现绿色生长旺盛的植株在当时移植的植株总数的百分比，如果植株萎蔫变灰则认为死亡。

本发明从蛇足石杉孢子囊中分离出绿藻及其应用，该绿藻的分类命名为胶球藻(Coccomyxa sp.)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年4月26日，保藏编号：CGMCC17587，将该胶球藻辅助于蛇足石杉无菌材料的建立和野生植株的移栽，可显著提高蛇足石杉无菌材料和野生植株的移栽成活率。

CGMCC17587的分离方法：

取野生蛇足石杉的孢子囊，用0.1％氯化汞溶液进行表面灭菌，然后接到MS固体培养基上培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16小时；3个月后从孢子囊表面长出胶球藻，再通过平板平板划线法获得胶球藻的单克隆纯培养物。

CGMCC17587的鉴定方法及鉴定结果：

经测序，待鉴定的样品核编码的核糖体18S rDNA和ITS序列片段大小为1117bp 和749bp。将此序列与NCBI Genbank数据库中的数据进行序列同源性对比，发现该藻株与胶球藻属(Coccomyxa)亲元关系最近，18rDNA和ITS序列同源性分别可达到 100％和96％。

18S rDNA序列的测序结果(从5’—3’端)如SEQ ID：1。

8S ITS序列的测序结果(从5’-3”端)如SEQ ID：2。

以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

对照例1：

(1)蛇足石杉无菌茎尖的获得

取蛇足石杉植株，清洗表面尘土，切取茎尖(4-6cm)。然后将茎尖用70％的酒精浸泡1分钟，取出后直接用8％的次氯酸钠灭菌8分钟，取出并用无菌水冲洗，然后用0.1％的升汞灭菌8分钟，再用无菌水冲洗三次，最后切割生成3-5cm，即获得用于培养的茎尖。

(2)蛇足石杉无菌茎尖的培养

将茎尖接种到蛇足石杉无菌茎尖培养基中培养基中，放置于25℃下培养，日光灯光强为2500Lux。培养60天，统计茎尖的成活率为34％。

对照例2：

蛇足石杉野生植株的移栽：将采集的野生蛇足石杉自来水清洗干净全株，然后移栽到用水润湿的青苔培养基质中，放置于温室中培养。60天后蛇足石杉移栽植株的成活率为56％。

实施例1：

(1)蛇足石杉绿藻的分离

取野生蛇足石杉的孢子囊，用0.1％氯化汞溶液进行表面灭菌，然后接到MS固体培养基上培养，培养温度25℃，光照强度为2000Lux、光周期16小时。培养90天后，在孢子囊的表面长出绿藻。再通过平板划线法获得绿藻的纯培养物。

(2)绿藻用于蛇足石杉无菌茎尖培养

蛇足石杉无菌茎尖培养基的制备：将绿藻的纯培养物采用MS培养基进行摇瓶液体培养，培养温度30℃、摇床转速60转/分钟，培养20天后，离心去除菌体，收集上清液。将滤液按照5％的比例添加到MS培养基中，即配制成蛇足石杉无菌茎尖培养基。

蛇足石杉无菌茎尖的获取：同对照例1。

将茎尖接种到蛇足石杉无菌茎尖培养基中培养基中，放置于25℃下培养，日光灯光强为2500Lux。培养60天，统计茎尖的成活率为54％。

实施例2：

与实施例1不同的是在MS培养基中添加绿藻培养液滤液的比例为10％。

培养60天，统计茎尖的成活率为78％。

实施例3：

与实施例1不同的是在MS培养基中添加绿藻培养液滤液的比例为15％。

培养60天，统计茎尖的成活率为66％。

实施例4：

(1)蛇足石杉绿藻的分离

同实施例1。

(2)绿藻用于蛇足石杉野生植株的移栽

绿藻培养液的制备：将绿藻的纯培养物(接种量不需要具体限定，用灭过菌的玻璃棒蘸取接适量即可)采用MS培养基进行摇瓶液体培养，在MS培养基中蔗糖的添加剂量为1％。培养温度30℃、摇床转速60转/分钟。培养30天后的菌悬液即绿藻培养液，用于蛇足石杉野生植株的移栽。

蛇足石杉野生植株的移栽：将采集的野生蛇足石杉自来水清洗干净全株，然后用绿藻培养液浸泡全株2小时，然后再用自来水冲洗一次，然后移栽到提前用水润湿的青苔培养基质中，放置于温室中培养。60天后蛇足石杉移栽植株的成活率为71％。

实施例5：

(1)蛇足石杉绿藻的分离

同实施例1。

(2)绿藻用于蛇足石杉野生植株的移栽

同实施例4。蛇足石杉植株在绿藻培养液中浸泡的时间为4小时。60天后蛇足石杉移栽植株的成活率为82％。

实施例6：

(1)蛇足石杉绿藻的分离

同实施例1。

(2)绿藻用于蛇足石杉野生植株的移栽

同实施例4。蛇足石杉植株在绿藻培养液中浸泡的时间为6小时。60天后蛇足石杉移栽植株的成活率为75％。

核苷酸序列表电子文件

<110>西北大学

<120>一种蛇足石杉内生绿藻及其应用

<160>2

<210>1

<211>1119

<212>DNA

<213> CGMCC17587胶球藻

<220> CGMCC17587胶球藻的18S rDNA

<400>1

CTTGCTACTCGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACGTGCGGAAATCCCGACTCCTGGAAGGGACGTATTTATTAGATAAAAGGCCGACCGGACTCGTCCGACTCGCGGTGAATCATGATAACTCCACGAATCGCATGGCCCAGCGCCGGCGATGTTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGACGGTAAGGTATTGGCTTACCGTGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCTTGACACAAGCAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGGTTTTTCAACTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAACCCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAGTGTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGCGGGCCCGGCCGGTCCGCCTCACGGTGTGCACTGACCGGGCCCGTCCTGCTGCCGGGGACGGGCTCCTGGGCTTCACTGTCCGGGACTCGGAGTCGGCGAGGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCATCCGCCTTGAATACGTTAGCATGGAATAACACGATAGGACTCTGGCCTATCTTGTTGGTCTGTGGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTGGGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCCTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGCGGGCGTTCTATTGATGACCCCGCCAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGATTGACAGATTGAGAGAGCTC。

<210>2

<211>749

<212>DNA

<213> CGMCC17587胶球藻

<220> CGMCC17587胶球藻的18S ITS

<400>1

CGCGGGTGCCCTTGCCTGAACTCAGGTCGAATGGATGATTCGGTCGCCGCGGCGGGGTCTCCCCCGTCGCGAGCCGCACCGTCTCCTGCTCGGCGTCCAGCGGGGTCCCGGGGCCCAGCAGCGGCATGCGATCGTCTCTCCGGAGAGAGGACGGCTCACCTACCGGTCTGTTGTTCCCACGTTAGAAGGGACTCCCGCTCAAGCCTCTGCGCTTCAGCCGACCCGATCGCCAGGATCGGGACGGCCAGGTCCGCTCTCACGCAACCGGATGGGAGGTGAGGCGAGGGGGGAACCGACACTGAGGCAGGCATGCTCTCGGCCGAGGCCTCGAGCGCAATTTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACATTATCTGCAATTCACACTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATACGGGAGCCAAAATATCCGTTGTTGAAAGTTGTCTTTGGTTTCTGTGGCGACGGGGGACCGGGTAGGCCCAGCGCGCACGAAGGCTTCAAATTTCGAGGGTCACGGATCGGTTGGGGTTGTTCCCAGCCGGTGACCCGCGGGAGTCGTCGGCCGCCTCACGAGAAGGCAACCTCATCCCTCGGACCGGCTCCGTCCCCGCCCCGATCGGCGAACCGACAGGGGAGCGGGCGCACGCTCGAGCGGCATCCGCCTCTTTCGTTCGGTCGAAACCGAAGACGTCATGAGCGGACCGCACAGCCCGAGCGCGGGGAGACGGGCGTTCGCGTGAAAGGT。