一种甘胆酸检测试剂盒及其制备方法
阅读说明:本技术 一种甘胆酸检测试剂盒及其制备方法 (Glycocholic acid detection kit and preparation method thereof ) 是由 袁嘉扬 张勇 于 2019-09-12 设计创作,主要内容包括:本发明涉及生物技术领域,涉及一种甘胆酸检测试剂盒,尤其涉及一种甘胆酸检测试剂盒的制备方法,公开了包括试剂R1和试剂R2的组分和浓度,其中R2中加入了生物素、甘胆酸抗体以及链霉亲和素,其中生物素结合甘胆酸抗体比例为1:1-4:1之间,链霉亲和素结合生物素-甘胆酸抗体比例为0.5:1-4:1之间。本发明的优点是:采用级联放大反应,即抗甘胆酸单克隆抗体连接生物素1:2,再与链霉亲和素1:1混合反应,可明显改善重复性和灵敏度,线性范围可做到0.5-80mg/L。(the invention relates to the technical field of biology, relates to a glycocholic acid detection kit, and particularly relates to a preparation method of the glycocholic acid detection kit, and discloses components and concentrations including a reagent R1 and a reagent R2, wherein biotin, a glycocholic acid antibody and streptavidin are added into R2, the ratio of the biotin to the glycocholic acid antibody is 1:1-4:1, and the ratio of the streptavidin to the biotin-glycocholic acid antibody is 0.5:1-4: 1. The invention has the advantages that: by adopting cascade amplification reaction, namely, the monoclonal antibody of the anti-glycocholic acid is connected with the biotin 1:2 and then is mixed with the streptavidin 1:1 for reaction, the repeatability and the sensitivity can be obviously improved, and the linear range can be 0.5-80 mg/L.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域,涉及一种甘胆酸检测试剂盒,尤其涉及一种甘胆酸检测试剂盒的制备方法。
背景技术
甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一。CG正常代谢途径为肠-肝循环,由肝细胞合成,经毛细胆管、胆管排入胆囊,随同胆汁进入十二指肠,帮助食物消化。95%胆酸在回肠末端重吸收,经门静脉再回肝脏,由肝细胞摄取再利用。在血清中主要以蛋白结合形式存在,溢入体循环的总量小于1%。在正常情况下,外周血中胆酸含量甚微,血清CG浓度稳定在较低水平。
当肝细胞受损时,肝细胞摄取CG能力下降,致使血中CG含量增高;胆汁郁滞时,肝脏***胆酸发生障碍,而返流血液循环的CG含量增高,也使血CG含量增高。因此,目前用RIA(radioimmunoassay放射免疫测定法)法测定血清甘胆酸(SCG)是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。
正常人血清甘胆酸含量为1.3±0.8mg/L,范围可在0.4~2.98mg/L内波动,肝炎诊断低限值为<3.18mg/L。各类肝炎、原发性肝癌、肝硬化患者血CG均明显高于正常人,且呈递性增高;胆石症伴黄疸患者胆管、胆囊***功能障碍可引起血清CG显著升高;肝硬化、梗阻性肝病、肠-肝循环障碍血清CG水平高于正常人。
甘胆酸是妊娠晚期血清中最主要的胆汁酸组分。正常妊娠时孕妇血清CG水平随孕周逐步增高,至足月妊娠CG值较非孕时增加30%~60%。部分妊娠妇女血清CG值可出现生理性升高,临床上并没有明显的ICP症状(妊娠期肝内胆汁淤积症)。随着CG值的升高程度不同,对母婴有着不同程度的损伤,且CG值越高危害越大。
目前临床应用中,甘胆酸的测定方法主要包括RIA(放射免疫分析)方法和酶联免疫法等。上述方法的共同特点是需要特别的测定仪器,操作复杂,试验耗时较长,不能应用于临床大流量的自动化分析,且价格昂贵。由于上述缺陷的制约,目前甘胆酸尚未成为临床检测的常规项目。
发明内容
本发明的目的是:针对上述不足,提供一种改善重复性和灵敏度的一种甘胆酸检测试剂盒及其制备方法。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种甘胆酸检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1的各组分及浓度包括:
所述试剂R2的各组分及浓度包括:
所述试剂R1中的第一缓冲液A和第一缓冲液B包括PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲体系中的一种或几种。
所述试剂R1中的第一防腐剂包括叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300中的一种。
所述试剂R2中的第二缓冲液A和第二缓冲液B包括PBS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲体系、MES缓冲液、MOPSO缓冲液、Tris缓冲液中的一种或几种。
所述试剂R2中的稳定剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、甘露醇中的一种或几种。
所述试剂R2的助悬剂包括葡萄糖、D-海藻糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、丙三醇中的一种或两种以上组合。
所述试剂R2的第二防腐剂包括叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300等中的一种。
所述试剂R1的pH值在6.00-8.50之间,所述试剂R2的pH值在7.0-8.0之间。
所述生物素结合甘胆酸抗体比例为1:1-4:1之间,链霉亲和素结合生物素-甘胆酸抗体比例为0.5:1-4:1之间。
一种甘胆酸检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:A)、试剂R1制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,以0.8-3.2g/L标准,边搅拌边投入第一缓冲液A,以8.75-24.31g/L的标准投入第一缓冲液B,搅拌5-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到6.00-8.50之间,之后以5.8-20.0g/L标准投入氯化钠,待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和第一防腐剂,PEG 6000和第一防腐剂的标准分别为20-70g/L和0.8-2.0ml/L,投料完成后,继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B)、试剂R2制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,以0.5-2.8g/L标准,边搅拌边投入第二缓冲液A,以11.5-23.4g/L标准第二缓冲液B,注意不要让水溅出,搅拌5-30分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到7.00-8.00之间,之后以5.8-20.0g/L的标准投入氯化钠,待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入稳定剂、助悬剂和第二防腐剂,稳定剂、助悬剂和第二防腐剂的投料标准分别为:1-10g/L、5-30g/L和0.8-2.0ml/L,投料完成后,继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀;
烧杯中以5-20g/L的标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边以25-75mg/L的标准加入抗甘胆酸单克隆抗体,搅拌1-4h反应,反应结束后透析去除未结合上的游离抗体,以5-20g/L的标准加入链霉亲和素反应1-4h,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-抗甘胆酸单克隆抗体加入配液罐中,继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识。
与现有技术相比,本发明所达到的技术效果是:采用级联放大反应,即抗甘胆酸单克隆抗体连接生物素1:2,再与链霉亲和素1:1混合反应,可明显改善重复性和灵敏度,线性范围可做到0.5-80mg/L。
附图说明
图1是本发明实施例4未采用级联放大反应R2试剂的定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度,Y轴表示dOD。
图2是本发明实施例4采用级联放大反应R2试剂的定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度,Y轴表示dOD。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
实施例一:
一种甘胆酸检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1的各组分及浓度包括:作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠,浓度为0.8g/L,作为第一缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠,浓度为8.75g/L,氯化钠,浓度为5.8g/L,PEG 6000,浓度为20g/L,以及作为第一防腐剂的Proclin-950,浓度为0.8ml/L;所述试剂R2的各组分及浓度包括:作为第二缓冲液A的二水合磷酸二氢钠,浓度为0.5g/L,作为第二缓冲液B十二水合磷酸氢二钠,浓度为11.5g/L,氯化钠,浓度为5.8-20.0g/L,作为稳定剂的牛血清白蛋白,1g/L,作为助悬剂的D-海藻糖,浓度为5g/L,作为第二防腐剂的Proclin-950,浓度为0.8ml/L,以及抗甘胆酸单克隆抗体、链霉亲和素、生物素,浓度分别为25mg/L、5g/L、5g/L。
一种甘胆酸检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:A)、试剂R1制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,以0.8g/L标准,边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠,以8.75g/L的标准投入十二水合磷酸氢二钠,搅拌5分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到6.00,之后以5.8g/L标准投入氯化钠,待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和Proclin-950,PEG 6000和Proclin-950的标准分别为20g/L和0.8ml/L,投料完成后,继续搅拌5分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B)、试剂R2制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,以0.5g/L标准,边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠,以11.5g/L标准投入十二水合磷酸氢二钠,注意不要让水溅出,搅拌5分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到7.00,之后以5.8g/L的标准投入氯化钠,待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入牛血清白蛋白、D-海藻糖和Proclin-950,牛血清白蛋白、D-海藻糖和Proclin-950的投料标准分别为:1g/L、5g/L和0.8ml/L,投料完成后,继续搅拌5分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀;
烧杯中以5g/L的标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边以25mg/L的标准加入抗甘胆酸单克隆抗体,搅拌1h反应,反应结束后透析去除未结合上的游离抗体,以5g/L的标准加入链霉亲和素反应1h,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-抗甘胆酸单克隆抗体加入配液罐中,继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,所述生物素结合甘胆酸抗体比例为2:1之间,链霉亲和素结合生物素-甘胆酸抗体比例为1:1。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识。
实施例二:
一种甘胆酸检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1的各组分及浓度包括:作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠,浓度为2g/L,作为第一缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠,浓度为16g/L,氯化钠,浓度为12g/L,PEG 6000,浓度为50g/L,以及作为第一防腐剂的Proclin-300,浓度为1.4ml/L;所述试剂R2的各组分及浓度包括:作为第二缓冲液A的二水合磷酸二氢钠,浓度为1.5g/L,作为第二缓冲液B十二水合磷酸氢二钠,浓度为17.5g/L,氯化钠,浓度为12g/L,作为稳定剂的酪蛋白,6g/L,作为助悬剂的葡萄糖,浓度为20g/L,作为第二防腐剂的Proclin-300,浓度为1.4ml/L,以及抗甘胆酸单克隆抗体、链霉亲和素、生物素,浓度分别为50mg/L、12g/L、12g/L。
一种甘胆酸检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:A)、试剂R1制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,以2g/L标准,边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠,以16g/L的标准投入十二水合磷酸氢二钠,搅拌20分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到7.00,之后以12g/L标准投入氯化钠,待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和Proclin-950,PEG 6000和Proclin-300的标准分别为50g/L和1.4ml/L,投料完成后,继续搅拌20分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B)、试剂R2制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,以1.5g/L标准,边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠,以17.5g/L标准投入十二水合磷酸氢二钠,注意不要让水溅出,搅拌20分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到7.50,之后以12g/L的标准投入氯化钠,待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入酪蛋白、葡萄糖和Proclin-300,酪蛋白、葡萄糖和Proclin-300的投料标准分别为:6g/L、20g/L和1.4ml/L,投料完成后,继续搅拌20分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀;
烧杯中以12g/L的标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边以50mg/L的标准加入抗甘胆酸单克隆抗体,搅拌2h反应,反应结束后透析去除未结合上的游离抗体,以12g/L的标准加入链霉亲和素反应2h,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-抗甘胆酸单克隆抗体加入配液罐中,继续搅拌20分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,所述生物素结合甘胆酸抗体比例为2:1之间,链霉亲和素结合生物素-甘胆酸抗体比例为1:1。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识。
实施例三:
一种甘胆酸检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1的各组分及浓度包括:作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠,浓度为3.2g/L,作为第一缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠,浓度为24.31g/L,氯化钠,浓度为20.0g/L,PEG 6000,浓度为70g/L,以及作为第一防腐剂的叠氮钠,浓度为2.0ml/L;所述试剂R2的各组分及浓度包括:作为第二缓冲液A的二水合磷酸二氢钠,浓度为2.8g/L,作为第二缓冲液B十二水合磷酸氢二钠,浓度为23.4g/L,氯化钠,浓度为20.0g/L,作为稳定剂的甘露醇,10g/L,作为助悬剂的麦芽糖,浓度为30g/L,作为第二防腐剂的叠氮钠,浓度为2.0ml/L,以及抗甘胆酸单克隆抗体、链霉亲和素、生物素,浓度分别为75mg/L、20g/L、20g/L。
一种甘胆酸检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:A)、试剂R1制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,以3.2g/L标准,边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠,以24.31g/L的标准投入十二水合磷酸氢二钠,搅拌30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到8.50,之后以20.0g/L标准投入氯化钠,待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和叠氮钠,PEG 6000和叠氮钠的标准分别为70g/L和2.0ml/L,投料完成后,继续搅拌30分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B)、试剂R2制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,以2.8g/L标准,边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠,以23.4g/L标准投入十二水合磷酸氢二钠,注意不要让水溅出,搅拌30分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到8.00,之后以20.0g/L的标准投入氯化钠,待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入甘露醇、麦芽糖和叠氮钠,甘露醇、麦芽糖和叠氮钠的投料标准分别为:10g/L、30g/L和2.0ml/L,投料完成后,继续搅拌30分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀;
烧杯中以20g/L的标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边以75mg/L的标准加入抗甘胆酸单克隆抗体,搅拌4h反应,反应结束后透析去除未结合上的游离抗体,以20g/L的标准加入链霉亲和素反应4h,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-抗甘胆酸单克隆抗体加入配液罐中,继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀;所述生物素结合甘胆酸抗体比例为2:1之间,链霉亲和素结合生物素-甘胆酸抗体比例为1:1。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识。
实施例四:
采用R2试剂未采用级联放大反应,使用标准品进行定标,结果如表1所示,定标曲线如图1所示。
表1:R2试剂未采用级联放大反应定标结果
校准品浓度(mg/L)
dOD
0
0.0024
1.81
0.0483
6.24
0.1024
13.13
0.1992
39.87
0.3639
81.25
0.5071
结果解析:如图1和表1所示,校准品浓度大于13.13mg/L时检测值上升幅度变小。
采用R2试剂采用级联放大反应,使用标准品进行定标,结果如表1所示,定标曲线如图1所示。
表2:R2试剂采用级联放大反应定标结果:
校准品浓度(g/L)
dOD
0
0.0016
1.81
0.0547
6.24
0.1147
13.13
0.2238
39.87
0.5262
81.25
0.7876
结果解析:如图2和表2所示,线性范围可做到0.5-80g/L。
实施例六:
精密度CV检测:
R2试剂未采用级联放大反应,随机取一样本,使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次,检测结果如表3所示。
表3:检测样本的甘胆酸及变异系数
1
2.40
17.83
67.65
2
3.84
15.01
66.30
3
3.91
15.35
68.79
4
2.07
15.06
63.05
5
3.13
17.67
68.51
6
3.40
17.53
63.72
7
3.23
17.95
63.03
8
3.31
16.44
65.64
9
2.20
15.97
65.14
10
2.14
18.25
65.54
均值
2.96
16.71
65.74
SD
0.703
1.2841
2.1084
CV
23.7%
7.7%
3.2%
结果解析:精密度CV56%。
R2试剂采用级联放大反应,随机取一样本,使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次,检测结果如表4所示。
表4:检测样本的甘胆酸及变异系数
1
3.00
16.04
66.19
2
2.98
16.12
66.96
3
2.77
16.61
66.02
4
2.91
16.51
65.28
5
2.71
16.27
65.93
6
3.09
16.34
65.60
7
2.69
16.52
66.33
8
3.04
16.76
65.19
9
2.98
16.05
66.19
10
2.97
16.76
66.15
均值
2.91
16.40
65.98
SD
0.141
0.275
0.5231
CV
4.8%
1.7%
0.8%
结果解析:精密度CV<5%。
结果分析:采用级联放大反应,即抗甘胆酸单克隆抗体连接生物素1:2,再与链霉亲和素1:1混合反应,可明显改善重复性和灵敏度,线性范围可做到0.5-80mg/L。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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