一种封闭抗体的抗原包被酶标板的制备方法及其试剂盒
阅读说明：本技术 一种封闭抗体的抗原包被酶标板的制备方法及其试剂盒 (Preparation method of antigen-coated enzyme label plate for blocking antibody and kit thereof ) 是由 张道兵 于 2021-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人封闭抗体的抗原包被酶标板的制备方法及其试剂盒,用基因工程方法制备特异性重组抗原--HLAⅠ重组抗原和HLAⅡ重组抗原,几种抗原提取纯化后,制成混合抗原包被酶标板,与封闭抗体阳性对照品、阴性对照品、酶标记的抗体、稀释液、清洗液、显色液A、显色液B和终止液组成检测试剂盒,试剂盒建立了快捷简便测试人封闭抗体的检测方法,试剂盒主要用于供科学研究和临床实验的研究使用。(The invention discloses a preparation method of an antigen-coated enzyme label plate of a human blocking antibody and a kit thereof, wherein specific recombinant antigens, namely HLA I recombinant antigen and HLA II recombinant antigen, are prepared by a genetic engineering method, a mixed antigen-coated enzyme label plate is prepared after extracting and purifying a plurality of antigens, and the mixed antigen-coated enzyme label plate, a blocking antibody positive reference substance, a negative reference substance, an enzyme-labeled antibody, a diluent, a cleaning solution, a developing solution A, a developing solution B and a stop solution form a detection kit.)
技术领域
本发明属于体外检测试剂类的技术领域，涉及一种用于人封闭抗体的抗原包被酶标板的制备方法及其试剂盒。
背景技术
妊娠是成功的半同种器官移植。然而现代女性由于各种因素的影响，导致无法正产妊娠，出现自然流产越来越多见。反复自然流产(RSA)是指连续发生了3次或3次以上的自然流产，发生率为0.4％～1.0％，如按连续发生2次计算则为5％。研究表明，40％～80％的RSA患者与免疫因素有关，免疫因素一部分与自身抗体有关外，另一部分原因被认为是母胎双方免疫不适应，其中封闭抗体(BA)缺乏是主要因素。BA与复发性流产密切相关，具有防止辅助性T淋巴细胞对胚胎滋养层的细胞毒作用，防止辅助性T淋巴细胞对胎儿抗原的识别，从而阻止母体免疫系统对胚胎的攻击。正常妊娠妇女血清中的BA主要有抗HLA-DR、抗TLX、抗FC受体抗体和抗独特型抗体(Ab2)等。ELISA法检测的是RSA患者广谱的HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗体，检测的是IgG抗体，包括无反应的抗体和丈夫淋巴细胞主动免疫治疗前可能存在的IgG抗体，但不包括IgM抗体，HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗体强阳性可间接预期有较高的Ab2抗体水平，是一种间接检测封闭效应的方法。
HLA是糖蛋白抗原又称为组织相容性抗原。该抗原由一系列紧密连锁的基因编码组成，这些基因被称为组织相容抗原复合物物，也称为HLA基因。定位在第6号染色体短臂上，共6个座位，至少含有4个基因区：即HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-D。HLA-D又分为HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP亚区。HLA-A、HLA-B、HLA-C基因编码的抗原称为Ⅰ类抗原。HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP基因编码的抗原称为Ⅱ类抗原。编码抗原结合肽的外显子是HLA-A、-B基因的第2-4外显子和HLA-DQB1、-DRB1基因的第2外显子。
发明内容
本发明一种特异性重组抗原HLAⅠ和HLAⅡ包被反应板的制备方法，通过以下步骤制备而成：
(1)HLA-A重组蛋白的获得：
HLA-A的原核表达：用人HLA-A(NM_001242758)cDNA克隆(载体为pDONR223)转化BL21感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性，以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明HLA-A cDNA片段正确克隆至pDONR223，与GenBank中人源HLAⅠ基因同源；
HLA-A蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经Western blotting鉴定，能与Human HLA classⅠantibody发生强阳性反应，说明该重组蛋白具有较强的免疫原性；
HLA-A重组蛋白的大量表达、纯化：经过大量诱导、表达和亲和层析纯化后得到大量HLA-A重组蛋白；
(2)HLA-B重组蛋白的获得：
HLA-B的原核表达：用人HLA-B(NM_005514)cDNA克隆(载体为pDONR223)转化BL21感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性；以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明HLA-B cDNA片段正确克隆至pDONR223，与GenBank中人源HLAⅠ基因同源；
HLA-B蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经Western blotting鉴定，能与Human HLA classⅠantibody发生强阳性反应，说明该重组蛋白具有较强的免疫原性；
HLA-B重组蛋白的大量表达、纯化：经过大量诱导、表达和亲和层析纯化后得到大量HLA-B重组蛋白；
(3)HLAⅡ重组蛋白的获得：
HLAⅡ的原核表达：人HLA-DRB1(NM_001243965)cDNA克隆(载体为pDONR223)转化BL21感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性，以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明HLAⅡcDNA片段正确克隆至pDONR223，与GenBank中人源HLAⅡ基因同源；
HLAⅡ蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经Western blotting鉴定，能与Human HLA-DR antibody发生强阳性反应，说明该重组蛋白具有较强的免疫原性；
HLAⅡ重组蛋白的大量表达、纯化：经过大量诱导、表达和亲和层析纯化后得到大量HLAⅡ重组蛋白；
(4)将HLAⅠ重组蛋白抗原和HLAⅡ重组蛋白抗原用pH7-10的缓冲液稀释后包被微孔板，20-300μl/孔，包被2-40小时，PBST洗板2-6次，每次1-10min，然后拍干；
(5)用含有2-20％小牛血清的PBS加满孔，37℃孵育，封闭0.5-5h，洗板2-6次后密封；该板即为HLAⅠ抗原和HLAⅡ抗原包被的酶标反应板，可用于封闭抗体IgG的特异性检测。
本发明还提供了一种封闭抗体ELISA检测试剂盒，包括：所述试剂盒由上述他异性的混合重组抗原包被的酶标板、封闭抗体阳性对照品、辣根过氧化物酶标记的二抗构成，具体分为：(1)酶标板：由混合重组抗原包被；(2)样本稀释液：含2-20％小牛血清和0.5-10％抗人IgM的pH6-10的缓冲液；(3)阳性对照品；(4)阴性对照品；(5)辣根过氧化物酶标记的二抗；(6)清洗液；(7)显色液：TMB-H2O2系统；(8)终止液：0.5-5mol/L的浓硫酸溶液。
进一步，封闭抗体阳性对照品的制备：将购买的Human HLA classⅠantibody和Human HLA-DR antibody溶于含30％甘油、5％BSA、2％蔗糖和0.1％硫柳汞钠的0.01MpH7.4的PBS中。
进一步，封闭抗体阴性对照品的制备：含有30％甘油、5％BSA、2％蔗糖和0.1％硫柳汞钠的0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲液；
进一步，酶标二抗为购买的辣根过氧化物(HRP)标记的鼠抗人IgG。
进一步，稀释液为含8％小牛血清和2％抗人IgM的pH7.4的磷酸盐缓冲液。
进一步，本试剂盒对封闭抗体的ELISA检测步骤包括：
(1)待测样品、阳性对照品一次加入微孔中，进行孵育，封闭抗体与固相载体表面的捕获抗原—预先包被在孔内的抗原结合；
(2)经过洗涤，将酶标二抗加入孔内，进行第二次孵育，酶标二抗与上一步的检测抗体相结合；
(3)洗去未结合的酶标二抗，加入酶的底物3,3’，5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，孔内液体在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，加入终止液，转化成黄色。颜色的深浅和样品中封闭抗体的含量成正相关；
(4)用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，判断样品中封闭抗体的阴性或阳性，判断值(OD)值＝阴性对照平均OD值×2.1，样品OD值大于判断为阳性，小于等于为阴性。
本发明选取了与封闭抗体检测有关的编码HLAⅠ和HLAⅡ蛋白的部分基因序列，采取了基因重组技术，原核表达，亲和层析后获得几种新的重组蛋白。经过改造后的重组蛋白即保留了其抗原性，又提高了重组蛋白的原核表达量。而且同时包被几个重组抗原可以保证封闭抗体的检出率，加入了抗人IgM的稀释液可以减少样本中IgM的存在造成的假阳性的干扰。该发明成功的用ELISA的方法，方便快速的检出封闭抗体。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
使用便捷，不需要复杂仪器；步骤简单，所得结果准确可靠，提供阳性对照，保证结果的准确。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的方案，下面结合示例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的示例仅仅是本发明的一部分示例，而不是全部的示例。基于本发明的中示例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施方式都应当属于本发明保护的范围。
实施例
一种封闭抗体的酶联免疫检测试剂盒，包括人封闭抗体的抗原包被酶标板、阳性对照、阴性对照、酶标二抗、稀释液、清洗液、显色液A、显色液B和终止液。
其中，人封闭抗体的抗原包被酶标板的制备方法为：(1)HLA-A重组蛋白的获得：
HLA-A的原核表达：用人HLA-A(NM_001242758)cDNA克隆(载体为pDONR223)转化BL21感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性，以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明HLA-A cDNA片段正确克隆至pDONR223，与GenBank中人源HLAⅠ基因同源；
HLA-A蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经Western blotting鉴定，能与Human HLA classⅠantibody发生强阳性反应，说明该重组蛋白具有较强的免疫原性；
HLA-A重组蛋白的大量表达、纯化：经过大量诱导、表达和亲和层析纯化后得到大量HLA-A重组蛋白；
(2)HLA-B重组蛋白的获得：
HLA-B的原核表达：用人HLA-B(NM_005514)cDNA克隆(载体为pDONR223)转化BL21感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性；以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明HLA-B cDNA片段正确克隆至pDONR223，与GenBank中人源HLAⅠ基因同源；
HLA-B蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经Western blotting鉴定，能与Human HLA classⅠantibody发生强阳性反应，说明该重组蛋白具有较强的免疫原性；
HLA-B重组蛋白的大量表达、纯化：经过大量诱导、表达和亲和层析纯化后得到大量HLA-B重组蛋白；
(3)HLAⅡ重组蛋白的获得：
HLAⅡ的原核表达：人HLA-DRB1(NM_001243965)cDNA克隆(载体为pDONR223)转化BL21感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性，以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明HLAⅡcDNA片段正确克隆至pDONR223，与GenBank中人源HLAⅡ基因同源；
HLAⅡ蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经Western blotting鉴定，能与Human HLA-DR antibody发生强阳性反应，说明该重组蛋白具有较强的免疫原性；
HLAⅡ重组蛋白的大量表达、纯化：经过大量诱导、表达和亲和层析纯化后得到大量HLAⅡ重组蛋白；
(4)将HLAⅠ蛋白抗原和HLAⅡ蛋白抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔板，100μl/孔，置湿盒中4℃10-24小时，PBST洗板4次，每次3min，然后拍干，得到HLA重组混合抗原包被的酶标板；
(5)用含有10％小牛血清的PBS加满孔，37℃孵育，封闭1.5h，洗板4次后密封；即可得到HLA重组混合抗原包被的酶标反应板。
需要说明的是，步骤(4)和步骤(5)中试剂可在给定范围内进行选择，上述为最适配比，如：步骤(4)中碳酸盐缓冲液的pH为7-10,96孔板加样20-300μl/孔，洗板次数为2-6次，每次1-10min；步骤(5)中的PBS含有2-20％的小牛血清，封闭时间为0.5-5h，洗板次数为2-6次，因此上述步骤可为：
(4)将HLAⅠ蛋白抗原和HLAⅡ蛋白抗原用pH7的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔板，20μl/孔，置湿盒中4℃2小时，PBST洗板2次，每次1min，然后拍干，得到HLA重组混合抗原包被的酶标板；
(5)用含有2％小牛血清的PBS加满孔，37℃孵育，封闭0.5h，洗板2次后密封；即可得到HLA重组混合抗原包被的酶标反应板。
或者为：
(4)将HLAⅠ蛋白抗原和HLAⅡ蛋白抗原用pH10的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔板，300μl/孔，置湿盒中4℃40小时，PBST洗板6次，每次10min，然后拍干，得到HLA重组混合抗原包被的酶标板；
(5)用含有20％小牛血清的PBS加满孔，37℃孵育，封闭5h，洗板6次后密封；即可得到HLA重组混合抗原包被的酶标反应板。
试剂盒内其余试剂按照下列步骤配制：
(1)包被液(0.05mol/L，pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)：Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，硫柳汞钠1.0g，加纯化水至1000mL，调pH至9.6。
(2)样本稀释液(含8％小牛血清和2％抗人IgM的0.01MPBS pH7.4)：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，硫柳汞钠1g，加纯化水至1000mL，调pH至7.4配成0.01M的PBS溶液；80mL小牛血清，20mL抗人IgM，900mLPBS配成样本稀释液。
(3)封闭液：(10％小牛血清/PBS溶液)小牛血清100mL，1×PBS(pH7.4)900mL。
(4)洗涤液(PBST，pH7.4)：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 205mL，硫柳汞钠1g，加纯化水至1000mL，调pH至7.4。
(5)酶标二抗：购买的辣根过氧化物(HRP)标记的鼠抗人IgG，使用时用PBS稀释5000倍使用。
(6)阳性对照品：购买的Human HLA classⅠantibody和Human HLA-DR antibody溶于含30％甘油、5％BSA、2％蔗糖和0.1％硫柳汞钠的0.01M pH7.4的PBS配制的保护液中，使用时用保护液均稀释5000倍。
(7)阴性对照品：含30％甘油、5％BSA、2％蔗糖和0.1％硫柳汞钠的0.01M pH7.4的PBS。
(8)底物液(TMB-H2O2尿素溶液)：
①底物A(3,3’，5,5’-四甲基联苯胺，TMB)：TMB200mg，无水乙醇100mL，加纯化水至1000mL；
②底物B缓冲液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0～5.4)：Na2HPO414.6g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加纯化水至1000mL，调pH至5.0～5.4。
(9)终止液：(2mol/LH2SO4)：纯化水600mL,浓硫酸100mL(缓慢滴加并不断搅拌)，加纯化水至900mL。
本示例中，酶标板的制备流程为：
1、主要仪器
(1)酶标仪
(2)水浴锅
2、方法
(1)酶标二抗最适滴度的选择
①用100ng/mL人IgG进行包被，洗涤；
②将酶标抗人IgG单抗用稀释液作一系列稀释后分贝加入已包被的孔中，保温、洗涤；
③加底物显色，加酸终止反应后，读取吸光度(A)，取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标二抗的最适滴度，最滴度为1:2000。
(2)棋盘滴定法选择包被抗原最适滴度
①用包被液将几种重组抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。
②将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液按10倍递增系列稀释，加样，保温，洗涤。
③加按最适滴度稀释的酶标二抗，保温，洗涤。
④加底物显色，加酸终止反应后读取A值。
⑤选择强阳性参考血清的A值为0.8～1.0间、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度作为最适滴度，HLA-A抗原为15～55μg/孔，HLA-B抗原为10～50μg/孔，HLAⅡ抗原为10～40μg/孔。
(3)特异性重组抗原包被反应板的制备方法
①将HLAⅠ蛋白抗原和HLAⅡ蛋白抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔板，100μl/孔，置湿盒中4℃10-24小时，PBST洗板4次，每次4min，然后拍干，得到HLA重组混合抗原包被的酶标板。
②用含有10％小牛血清的PBS加满孔，37℃孵育，封闭1.5h，洗板4次后密封；即可得到HLA重组混合抗原包被的酶标反应板。
酶标板制备完成后，利用上述试剂盒采用ELISA法检测血清中的封闭抗体的步骤为：
加样：分别设定空白孔，不加任何溶液；阴性对照孔2孔，加阴性对照100μL；阳性对照孔2孔，加阳性对照100μL；预控加100μL样本稀释液，然后加入待测样本5μL。轻轻晃动混匀，酶标板覆膜，37℃放置30min。
弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2min，200μL/每孔，甩干。
每孔加酶标结合物150μL(空白孔除外)，充分混匀，酶标板覆膜，37℃放置30min。
弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2min，200μL/每孔，甩干。
每孔加底物溶液A和B各50μL，37℃避光显色15min。
每孔加终止液50μL，终止反应。
空白孔调零，用酶标仪读取450nm波长处吸光度。
计算结果，判断值(OD)值＝阴性对照平均OD值×2.1，样品OD值大于判断为阳性，小于等于为阴性。
需要说明的是，除了上述给出的具体示例之外，其中的一些步骤可有不同选择。而这些都是本领域技术人员在理解本发明思想的基础上基于其基本技能即可做出的，故在此不再一一例举。
最后，可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。
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