阅读说明：本技术 败酱草的应用以及治疗猪蓝耳病的中药组合物 (Application of herba patriniae and traditional Chinese medicine composition for treating porcine reproductive and respiratory syndrome ) 是由 朱善元 秦枫 刘云 吴双 郭长明 吴植 王安平 王永娟 封琦 洪伟鸣 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及中药技术领域,公开了败酱草的应用以及治疗猪蓝耳病的中药组合物。本发明利用Western-Blot、qRT-PCR、细胞凋亡等技术通过各个层面的实验证明了,败酱草提取物能够显著抑制PRRSV感染和复制,具有显著的体内外抗PRRSV病毒作用,可成为新型的防治猪蓝耳病的药物,在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。(the invention relates to the technical field of traditional Chinese medicines, and discloses application of herba patriniae and a traditional Chinese medicine composition for treating porcine reproductive and respiratory syndrome. The invention utilizes Western-Blot, qRT-PCR, apoptosis and other technologies to prove through experiments of various layers that the patrinia extract can obviously inhibit PRRSV infection and replication, has obvious in-vivo and in-vitro PRRSV virus resistance, can become a novel medicament for preventing and treating the porcine reproductive and respiratory syndrome, and has good application prospect in the prevention and treatment of the porcine reproductive and respiratory syndrome.)

败酱草的应用以及治疗猪蓝耳病的中药组合物

技术领域

本发明涉及中药技术领域，更具体的说是涉及败酱草的应用以及治疗猪蓝耳病的中药组合物。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRSV)，俗称猪蓝耳，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种急性、接触性、高度传染性疾病。PRRSV主要的感染对象是妊娠母猪和仔猪，妊娠母猪表现为繁殖障碍，而仔猪及其各年龄猪除了严重的呼吸道症状和持续性的感染外，还能引起生长发育缓慢和神经症状。该病1987年在美国首次报道，之后在德国、荷兰、加拿大等国相继出现报道，随后迅速蔓延至亚洲及其它地区，给全球养猪业带来了巨大的损失。

当前控制和预防该综合征的主要有效措施还是接种疫苗。目前市面上的PRRSV疫苗主要有灭活苗和弱毒苗，但是这两种疫苗均具有严重的功效和安全性问题。最先用于临床治疗PRRSV的疫苗是灭活苗。灭活苗具有安全性，不会导致病毒传播和造成流行疫病，它还具有便于保存以及运输的优势。但是，灭活疫苗的保护效果并不理想。使用灭活疫苗后只能产生体液免疫，所以需要二次免疫才能起到一定的保护作用，灭活苗从免疫到产生免疫保护所需要的时间较长，在这期间中和抗体产生的量可能会很少，或者不产生中和抗体，从而发生无效免疫的情况，所以灭活疫苗并不能有效控制PRRSV的发病与传播。相对而言，弱毒苗可快速诱导产生中和抗体，具有免疫时间长、抵抗力强等优点。但是，弱毒苗存在散毒的危险，并且在免疫的过程中可能会出现毒力返强的状况。

中药种类繁多、资源丰富，且由于安全、低毒、不易产生耐药性等特点，其抗病毒研究日益得到重视，较多中药具有免疫调节作用，可通过提高机体的抵抗力起到抗病毒作用。中药抗PRRSV作用包括阻断、抑制、杀灭等途径，中药抗病毒的机理主要是直接抗病毒和间接抗病毒两种作用。直接抗病毒作用是通过直接阻断病毒增殖过程起到抗病毒的作用，间接抗病毒作用是通过增强机体自身的免疫力起到抗病毒的作用。抗病毒作用机制主要有以下几种：(1)抑制病毒的吸附、穿入、脱壳；(2)抑制病毒核酸的转录和复制；(3)抑制病毒蛋白的合成；(4)阻断细胞受体；(5)抑制病毒的组装；(6)促进机体抵抗力；(7)增强宿主抗病毒能力等。中药治疗病毒感染性疾病，不是单纯着眼于直接的抗病毒作用，而是重视“病毒-机体-中药”三者的关系。不仅直接杀灭病毒，阻止病毒的吸附、穿入、复制、转染，更重要的是还能增强机体免疫力，激发调动机体的一切免疫防御系统发挥抗病毒作用。多途径、多环节，并能改善病毒所致机体的不良反应和症状，这正是中药抗病毒所具有的独特优势。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供败酱草及其提取物在制备治疗和/或预防猪蓝耳病药物中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供败酱草及其提取物在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供包含败酱草的用于治疗猪蓝耳病或抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的中药组合物。

败酱草为败酱科植物白花败酱的干燥全草。性凉，味辛、苦。具有清热解毒，祛痰排脓之功效，常用于肠痈，肺痈，痢疾，产后瘀血腹痛，痈肿疔疮；现有技术中虽有包含败酱草在内的治疗猪蓝耳病的中药制剂，但是这些中药制剂成分较多，未从根本上阐明其抗病毒的作用机制，也未明确说明败酱草是否起治疗的关键作用，是否能够直接抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒。

本发明发现败酱草提取物对猪蓝耳病病毒具有显著的抗病毒作用，具体通过其对PRRSV的不同作用方式、不同作用时间分析了败酱草提取物对PRRSV抗病毒作用，并以利巴韦林作为阳性对照药物进行体外体内试验，利用Western-Blot、qRT-PCR、细胞凋亡等技术通过各个层面的实验证明了，败酱草提取物能够显著抑制PRRSV感染和复制，具有显著的体内外抗PRRSV病毒作用。

因此本发明提出了败酱草或其提取物在制备治疗和/或预防猪蓝耳病药物以及抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用；

更为具体地，本发明所提出的上述应用为败酱草或其提取物单独在制备治疗和/或预防猪蓝耳病药物以及抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用；或者为败酱草或其提取物与排除如下中药组分的其他中药组分联合在制备治疗和/或预防猪蓝耳病药物以及抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用，所述排除的中药组分如下：

西洋参、党参、黄芪、白术、田七、枸杞、菟丝子、灵芝、雷公藤、大黄、川芎、甘草、旱莲草、沙棘、莪术、白花蛇舌草、鱼腥草、金银花、赤芍、薄荷、芦根、栀子、佩兰、连翘、丹参、玄参、山豆根、苍术、板蓝根、大青叶、荆芥、葛根、白芍、淡竹叶、白鲜皮、白薇、白头翁、荆芥、老鹳草、黄芩、芦根、当归、寻骨风、麦冬、牡丹皮和防己；

作为优选，所述其他中药组分选自熟地、太子参、三棵针、陈皮、郁金、地锦草、五指毛桃、绞股蓝、盘龙参、刺五加、黄精、玉竹参、半边莲、锦灯笼、重楼中的一种或两种以上；更优选地，选自熟地、太子参、三棵针、陈皮、郁金、地锦草、五指毛桃、绞股蓝、盘龙参、刺五加、黄精、玉竹参、半边莲、锦灯笼、重楼中的三种或四种以上；在本发明

具体实施方式

中，选自熟地、太子参、三棵针、陈皮、郁金、地锦草、五指毛桃、绞股蓝、盘龙参、刺五加、黄精、玉竹参、半边莲、锦灯笼、重楼中的三种或四种。

作为优选，所述败酱草提取物为败酱草水提物，通过水煎法制备获得，具体可参照如下：

将败酱草中药材粉碎后，称取10g，加入10倍量水，三次煎煮提取并过滤，每次30min，合并滤液，浓缩至1g/mL，冷冻干燥后，放入真空干燥箱干燥，获得所述提取物。

作为优选，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒为直接抗猪繁殖与呼吸综合征病毒。

同时，本发明还提供了一种治疗猪蓝耳病的中药组合物，包括败酱草和选自熟地、太子参、三棵针、陈皮、郁金、地锦草、五指毛桃、绞股蓝、盘龙参、刺五加、黄精、玉竹参、半边莲、锦灯笼、重楼中的一种或两种以上中药组分的提取物。

作为优选，所述中药组合物包括败酱草和选自熟地、太子参、三棵针、陈皮、郁金、地锦草、五指毛桃、绞股蓝、盘龙参、刺五加、黄精、玉竹参、半边莲、锦灯笼、重楼中的三种或四种以上中药组分的提取物；在本发明具体实施方式中，所述中药组合物包括败酱草和选自熟地、太子参、三棵针、陈皮、郁金、地锦草、五指毛桃、绞股蓝、盘龙参、刺五加、黄精、玉竹参、半边莲、锦灯笼、重楼中的三种或四种的中药组分的提取物。

作为优选，所述各中药组分的用量为：

败酱草10-20份、熟地10-20份、太子参10-20份、三棵针10-15份、陈皮6-10份、郁金6-10份、地锦草10-15份、五指毛桃10-20份、绞股蓝10-20份、盘龙参10-20份、刺五加10-20份、黄精10-20份、玉竹参10-20份、半边莲10-15份、锦灯笼10-15份、重楼10-15份。

作为优选，所述提取物为水提物，通过水煎法制备获得。

在本发明具体实施方式中，所述中药组合物中中药组分选择如下之一组合形式：

(1)五指毛桃、败酱草、半边莲、陈皮；(2)五指毛桃、败酱草、地锦草、陈皮；(3)五指毛桃、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(4)五指毛桃、败酱草、半边莲、郁金；(5)五指毛桃、败酱草、地锦草、郁金；(6)五指毛桃、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(7)五指毛桃、败酱草、三棵针、陈皮；(8)五指毛桃、败酱草、三棵针、郁金；(9)五指毛桃、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(10)五指毛桃、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(11)五指毛桃、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(12)五指毛桃、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(13)绞股蓝、败酱草、半边莲、陈皮；(14)绞股蓝、败酱草、地锦草、陈皮；(15)绞股蓝、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(16)绞股蓝、败酱草、半边莲、郁金；(17)绞股蓝、败酱草、地锦草、郁金；(18)绞股蓝、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(19)绞股蓝、败酱草、三棵针、陈皮；(20)绞股蓝、败酱草、三棵针、郁金；(21)绞股蓝、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(22)绞股蓝、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(23)绞股蓝、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(24)绞股蓝、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(25)盘龙参、败酱草、半边莲、陈皮；(26)盘龙参、败酱草、地锦草、陈皮；(27)盘龙参、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(28)盘龙参、败酱草、半边莲、郁金；(29)盘龙参、败酱草、地锦草、郁金；(30)盘龙参、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(31)盘龙参、败酱草、三棵针、陈皮；(32)盘龙参、败酱草、三棵针、郁金；(33)盘龙参、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(34)盘龙参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(35)盘龙参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(36)盘龙参、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(37)刺五加、败酱草、半边莲、陈皮；(38)刺五加、败酱草、地锦草、陈皮；(39)刺五加、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(40)刺五加、败酱草、半边莲、郁金；(41)刺五加、败酱草、地锦草、郁金；(42)刺五加、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(43)刺五加、败酱草、三棵针、陈皮；(44)刺五加、败酱草、三棵针、郁金；(45)刺五加、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(46)刺五加、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(47)刺五加、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(48)刺五加、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(49)黄精、败酱草、半边莲、陈皮；(50)黄精、败酱草、地锦草、陈皮；(51)黄精、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(52)黄精、败酱草、半边莲、郁金；(53)黄精、败酱草、地锦草、郁金；(54)黄精、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(55)黄精、败酱草、三棵针、陈皮；(56)黄精、败酱草、三棵针、郁金；(57)黄精、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(58)黄精、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(59)黄精、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(60)黄精、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(61)玉竹参、败酱草、半边莲、陈皮；(62)玉竹参、败酱草、地锦草、陈皮；(63)玉竹参、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(64)玉竹参、败酱草、半边莲、郁金；(65)玉竹参、败酱草、地锦草、郁金；(66)玉竹参、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(67)玉竹参、败酱草、三棵针、陈皮；(68)玉竹参、败酱草、三棵针、郁金；(69)玉竹参、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(70)玉竹参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(71)玉竹参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(72)玉竹参、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(73)熟地、败酱草、半边莲、陈皮；(74)熟地、败酱草、地锦草、陈皮；(75)熟地、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(76)熟地、败酱草、半边莲、郁金；(77)熟地、败酱草、地锦草、郁金；(78)熟地、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(79)熟地、败酱草、三棵针、陈皮；(80)熟地、败酱草、三棵针、郁金；(81)熟地、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(82)熟地、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(83)熟地、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(84)熟地、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(85)太子参、败酱草、半边莲、陈皮；(86)太子参、败酱草、地锦草、陈皮；(87)太子参、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(88)太子参、败酱草、半边莲、郁金；(89)太子参、败酱草、地锦草、郁金；(90)太子参、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(91)太子参、败酱草、三棵针、陈皮；(92)太子参、败酱草、三棵针、郁金；(93)太子参、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(94)太子参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(95)太子参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(96)太子参、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(97)五指毛桃、败酱草、半边莲、陈皮；(98)五指毛桃、败酱草、地锦草、陈皮；(99)五指毛桃、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(100)五指毛桃、败酱草、半边莲、郁金；(101)五指毛桃、败酱草、地锦草、郁金；(102)五指毛桃、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(103)五指毛桃、败酱草、三棵针、陈皮；(104)五指毛桃、败酱草、三棵针、郁金；(105)五指毛桃、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(106)五指毛桃、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(107)五指毛桃、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(108)五指毛桃、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(109)绞股蓝、败酱草、半边莲、陈皮；(110)绞股蓝、败酱草、地锦草、陈皮；(111)绞股蓝、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(112)绞股蓝、败酱草、半边莲、郁金；(113)绞股蓝、败酱草、地锦草、郁金；(114)绞股蓝、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(115)绞股蓝、败酱草、三棵针、陈皮；(116)绞股蓝、败酱草、三棵针、郁金；(117)绞股蓝、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(118)绞股蓝、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(119)绞股蓝、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(120)绞股蓝、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(121)盘龙参、败酱草、半边莲、陈皮；(122)盘龙参、败酱草、地锦草、陈皮；(123)盘龙参、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(124)盘龙参、败酱草、半边莲、郁金；(125)盘龙参、败酱草、地锦草、郁金；(126)盘龙参、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(127)盘龙参、败酱草、三棵针、陈皮；(128)盘龙参、败酱草、三棵针、郁金；(129)盘龙参、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(130)盘龙参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(131)盘龙参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(132)盘龙参、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(133)刺五加、败酱草、半边莲、陈皮；(134)刺五加、败酱草、地锦草、陈皮；(135)刺五加、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(136)刺五加、败酱草、半边莲、郁金；(137)刺五加、败酱草、地锦草、郁金；(138)刺五加、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(139)刺五加、败酱草、三棵针、陈皮；(140)刺五加、败酱草、三棵针、郁金；(141)刺五加、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(142)刺五加、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(143)刺五加、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(144)刺五加、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(145)黄精、败酱草、半边莲、陈皮；(146)黄精、败酱草、地锦草、陈皮；(147)黄精、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(148)黄精、败酱草、半边莲、郁金；(149)黄精、败酱草、地锦草、郁金；(150)黄精、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(151)黄精、败酱草、三棵针、陈皮；(152)黄精、败酱草、三棵针、郁金；(153)黄精、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(154)黄精、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(155)黄精、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(156)黄精、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(157)玉竹参、败酱草、半边莲、陈皮；(158)玉竹参、败酱草、地锦草、陈皮；(159)玉竹参、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(160)玉竹参、败酱草、半边莲、郁金；(161)玉竹参、败酱草、地锦草、郁金；(162)玉竹参、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(163)玉竹参、败酱草、三棵针、陈皮；(164)玉竹参、败酱草、三棵针、郁金；(165)玉竹参、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(166)玉竹参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(167)玉竹参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(168)玉竹参、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(169)熟地、败酱草、半边莲、陈皮；(170)熟地、败酱草、地锦草、陈皮；(171)熟地、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(172)熟地、败酱草、半边莲、郁金；(173)熟地、败酱草、地锦草、郁金；(174)熟地、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(175)熟地、败酱草、三棵针、陈皮；(176)熟地、败酱草、三棵针、郁金；(177)熟地、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(178)熟地、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(179)熟地、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(180)熟地、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(181)太子参、败酱草、半边莲、陈皮；(182)太子参、败酱草、地锦草、陈皮；(183)太子参、败酱草、地锦草、半边莲、陈皮；(184)太子参、败酱草、半边莲、郁金；(185)太子参、败酱草、地锦草、郁金；(186)太子参、败酱草、地锦草、半边莲、郁金；(187)太子参、败酱草、三棵针、陈皮；(188)太子参、败酱草、三棵针、郁金；(189)太子参、败酱草、三棵针、半边莲、陈皮；(190)太子参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(191)太子参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(192)太子参、败酱草、三棵针、半边莲、郁金；(193)五指毛桃、败酱草、锦灯笼、陈皮；(194)五指毛桃、败酱草、地锦草、陈皮；(195)五指毛桃、败酱草、地锦草、锦灯笼、陈皮；(196)五指毛桃、败酱草、锦灯笼、郁金；(197)五指毛桃、败酱草、地锦草、郁金；(198)五指毛桃、败酱草、地锦草、锦灯笼、郁金；(199)五指毛桃、败酱草、三棵针、陈皮；(200)五指毛桃、败酱草、三棵针、郁金；(201)五指毛桃、败酱草、三棵针、锦灯笼、陈皮；(202)五指毛桃、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(203)五指毛桃、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(204)五指毛桃、败酱草、三棵针、锦灯笼、郁金；(205)绞股蓝、败酱草、锦灯笼、陈皮；(206)绞股蓝、败酱草、地锦草、陈皮；(207)绞股蓝、败酱草、地锦草、锦灯笼、陈皮；(208)绞股蓝、败酱草、锦灯笼、郁金；(209)绞股蓝、败酱草、地锦草、郁金；(210)绞股蓝、败酱草、地锦草、锦灯笼、郁金；(211)绞股蓝、败酱草、三棵针、陈皮；(212)绞股蓝、败酱草、三棵针、郁金；(213)绞股蓝、败酱草、三棵针、锦灯笼、陈皮；(214)绞股蓝、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(215)绞股蓝、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(216)绞股蓝、败酱草、三棵针、锦灯笼、郁金；(217)盘龙参、败酱草、锦灯笼、陈皮；(218)盘龙参、败酱草、地锦草、陈皮；(219)盘龙参、败酱草、地锦草、锦灯笼、陈皮；(220)盘龙参、败酱草、锦灯笼、郁金；(221)盘龙参、败酱草、地锦草、郁金；(222)盘龙参、败酱草、地锦草、锦灯笼、郁金；(223)盘龙参、败酱草、三棵针、陈皮；(224)盘龙参、败酱草、三棵针、郁金；(225)盘龙参、败酱草、三棵针、锦灯笼、陈皮；(226)盘龙参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(227)盘龙参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(228)盘龙参、败酱草、三棵针、锦灯笼、郁金；(229)刺五加、败酱草、锦灯笼、陈皮；(230)刺五加、败酱草、地锦草、陈皮；(231)刺五加、败酱草、地锦草、锦灯笼、陈皮；(232)刺五加、败酱草、锦灯笼、郁金；(233)刺五加、败酱草、地锦草、郁金；(234)刺五加、败酱草、地锦草、锦灯笼、郁金；(235)刺五加、败酱草、三棵针、陈皮；(236)刺五加、败酱草、三棵针、郁金；(237)刺五加、败酱草、三棵针、锦灯笼、陈皮；(238)刺五加、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(239)刺五加、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(240)刺五加、败酱草、三棵针、锦灯笼、郁金；(241)黄精、败酱草、锦灯笼、陈皮；(242)黄精、败酱草、地锦草、陈皮；(243)黄精、败酱草、地锦草、锦灯笼、陈皮；(244)黄精、败酱草、锦灯笼、郁金；(245)黄精、败酱草、地锦草、郁金；(246)黄精、败酱草、地锦草、锦灯笼、郁金；(247)黄精、败酱草、三棵针、陈皮；(248)黄精、败酱草、三棵针、郁金；(249)黄精、败酱草、三棵针、锦灯笼、陈皮；(250)黄精、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(251)黄精、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(252)黄精、败酱草、三棵针、锦灯笼、郁金；(253)玉竹参、败酱草、锦灯笼、陈皮；(254)玉竹参、败酱草、地锦草、陈皮；(255)玉竹参、败酱草、地锦草、锦灯笼、陈皮；(256)玉竹参、败酱草、锦灯笼、郁金；(257)玉竹参、败酱草、地锦草、郁金；(258)玉竹参、败酱草、地锦草、锦灯笼、郁金；(259)玉竹参、败酱草、三棵针、陈皮；(260)玉竹参、败酱草、三棵针、郁金；(261)玉竹参、败酱草、三棵针、锦灯笼、陈皮；(262)玉竹参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(263)玉竹参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(264)玉竹参、败酱草、三棵针、锦灯笼、郁金；(265)熟地、败酱草、锦灯笼、陈皮；(266)熟地、败酱草、地锦草、陈皮；(267)熟地、败酱草、地锦草、锦灯笼、陈皮；(268)熟地、败酱草、锦灯笼、郁金；(269)熟地、败酱草、地锦草、郁金；(270)熟地、败酱草、地锦草、锦灯笼、郁金；(271)熟地、败酱草、三棵针、陈皮；(272)熟地、败酱草、三棵针、郁金；(273)熟地、败酱草、三棵针、锦灯笼、陈皮；(274)熟地、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(275)熟地、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(276)熟地、败酱草、三棵针、锦灯笼、郁金；(277)太子参、败酱草、锦灯笼、陈皮；(278)太子参、败酱草、地锦草、陈皮；(279)太子参、败酱草、地锦草、锦灯笼、陈皮；(280)太子参、败酱草、锦灯笼、郁金；(281)太子参、败酱草、地锦草、郁金；(282)太子参、败酱草、地锦草、锦灯笼、郁金；(283)太子参、败酱草、三棵针、陈皮；(284)太子参、败酱草、三棵针、郁金；(285)太子参、败酱草、三棵针、锦灯笼、陈皮；(286)太子参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(287)太子参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(288)太子参、败酱草、三棵针、锦灯笼、郁金；(289)五指毛桃、败酱草、重楼、陈皮；(290)五指毛桃、败酱草、地锦草、陈皮；(291)五指毛桃、败酱草、地锦草、重楼、陈皮；(292)五指毛桃、败酱草、重楼、郁金；(293)五指毛桃、败酱草、地锦草、郁金；(294)五指毛桃、败酱草、地锦草、重楼、郁金；(295)五指毛桃、败酱草、三棵针、陈皮；(296)五指毛桃、败酱草、三棵针、郁金；(297)五指毛桃、败酱草、三棵针、重楼、陈皮；(298)五指毛桃、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(299)五指毛桃、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(300)五指毛桃、败酱草、三棵针、重楼、郁金；(301)绞股蓝、败酱草、重楼、陈皮；(302)绞股蓝、败酱草、地锦草、陈皮；(303)绞股蓝、败酱草、地锦草、重楼、陈皮；(304)绞股蓝、败酱草、重楼、郁金；(305)绞股蓝、败酱草、地锦草、郁金；(306)绞股蓝、败酱草、地锦草、重楼、郁金；(307)绞股蓝、败酱草、三棵针、陈皮；(308)绞股蓝、败酱草、三棵针、郁金；(309)绞股蓝、败酱草、三棵针、重楼、陈皮；(310)绞股蓝、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(311)绞股蓝、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(312)绞股蓝、败酱草、三棵针、重楼、郁金；(313)盘龙参、败酱草、重楼、陈皮；(314)盘龙参、败酱草、地锦草、陈皮；(315)盘龙参、败酱草、地锦草、重楼、陈皮；(316)盘龙参、败酱草、重楼、郁金；(317)盘龙参、败酱草、地锦草、郁金；(318)盘龙参、败酱草、地锦草、重楼、郁金；(319)盘龙参、败酱草、三棵针、陈皮；(320)盘龙参、败酱草、三棵针、郁金；(321)盘龙参、败酱草、三棵针、重楼、陈皮；(322)盘龙参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(323)盘龙参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(324)盘龙参、败酱草、三棵针、重楼、郁金；(325)刺五加、败酱草、重楼、陈皮；(326)刺五加、败酱草、地锦草、陈皮；(327)刺五加、败酱草、地锦草、重楼、陈皮；(328)刺五加、败酱草、重楼、郁金；(329)刺五加、败酱草、地锦草、郁金；(330)刺五加、败酱草、地锦草、重楼、郁金；(331)刺五加、败酱草、三棵针、陈皮；(332)刺五加、败酱草、三棵针、郁金；(333)刺五加、败酱草、三棵针、重楼、陈皮；(334)刺五加、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(335)刺五加、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(336)刺五加、败酱草、三棵针、重楼、郁金；(337)黄精、败酱草、重楼、陈皮；(338)黄精、败酱草、地锦草、陈皮；(339)黄精、败酱草、地锦草、重楼、陈皮；(340)黄精、败酱草、重楼、郁金；(341)黄精、败酱草、地锦草、郁金；(342)黄精、败酱草、地锦草、重楼、郁金；(343)黄精、败酱草、三棵针、陈皮；(344)黄精、败酱草、三棵针、郁金；(345)黄精、败酱草、三棵针、重楼、陈皮；(346)黄精、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(347)黄精、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(348)黄精、败酱草、三棵针、重楼、郁金；(349)玉竹参、败酱草、重楼、陈皮；(350)玉竹参、败酱草、地锦草、陈皮；(351)玉竹参、败酱草、地锦草、重楼、陈皮；(352)玉竹参、败酱草、重楼、郁金；(353)玉竹参、败酱草、地锦草、郁金；(354)玉竹参、败酱草、地锦草、重楼、郁金；(355)玉竹参、败酱草、三棵针、陈皮；(356)玉竹参、败酱草、三棵针、郁金；(357)玉竹参、败酱草、三棵针、重楼、陈皮；(358)玉竹参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(359)玉竹参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(360)玉竹参、败酱草、三棵针、重楼、郁金；(361)熟地、败酱草、重楼、陈皮；(362)熟地、败酱草、地锦草、陈皮；(363)熟地、败酱草、地锦草、重楼、陈皮；(364)熟地、败酱草、重楼、郁金；(365)熟地、败酱草、地锦草、郁金；(366)熟地、败酱草、地锦草、重楼、郁金；(367)熟地、败酱草、三棵针、陈皮；(368)熟地、败酱草、三棵针、郁金；(369)熟地、败酱草、三棵针、重楼、陈皮；(370)熟地、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(371)熟地、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(372)熟地、败酱草、三棵针、重楼、郁金；(373)太子参、败酱草、重楼、陈皮；(374)太子参、败酱草、地锦草、陈皮；(375)太子参、败酱草、地锦草、重楼、陈皮；(376)太子参、败酱草、重楼、郁金；(377)太子参、败酱草、地锦草、郁金；(378)太子参、败酱草、地锦草、重楼、郁金；(379)太子参、败酱草、三棵针、陈皮；(380)太子参、败酱草、三棵针、郁金；(381)太子参、败酱草、三棵针、重楼、陈皮；(382)太子参、败酱草、三棵针、地锦草、陈皮；(383)太子参、败酱草、三棵针、地锦草、郁金；(384)太子参、败酱草、三棵针、重楼、郁金。

由以上技术方案可知，本发明利用Western-Blot、qRT-PCR、细胞凋亡等技术通过各个层面的实验证明了，败酱草提取物能够显著抑制PRRSV感染和复制，具有显著的体内外抗PRRSV病毒作用，可成为新型的防治猪蓝耳病的药物，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1所示为含N基因重组质粒的凝胶电泳图；

图2所示为400μg/mL的败酱草提取物对PRRSV进行阻断作用，作用24h、48h、72h后，qRT-PCR检测N基因表达水平，*P<0.05，**P<0.01；

图3所示为400μg/mL的败酱草提取物对PRRSV进行抑制作用，作用24h、48h、72h后，qRT-PCR检测N基因表达水平，*P<0.05，**P<0.01；

图4所示为400μg/mL的败酱草提取物对PRRSV进行直接灭活作用，作用24h、48h、72h后，qRT-PCR检测N基因表达水平，*P<0.05，**P<0.01；

图5所示为400μg/mL的败酱草提取物对PRRSV进行阻断作用，作用24h、48h、72h后，Western Blot检测N蛋白表达水平；其中，1：S提取物组；2：阳性对照利巴韦林组；3：PRRSV对照组；4：细胞对照组；

图6所示为400μg/mL的败酱草提取物对PRRSV进行抑制作用，作用24h、48h、72h后，Western Blot检测N蛋白表达水平；其中，1：S提取物组；2：阳性对照利巴韦林组；3：PRRSV对照组；4：细胞对照组；

图7所示为400μg/mL的败酱草提取物对PRRSV进行直接灭活作用，作用24h、48h、72h后，Western Blot检测N蛋白表达水平；其中，1：S提取物组；2：阳性对照利巴韦林组；3：PRRSV对照组；4：细胞对照组；

图8所示为未感染PRRSV和感染PRRSV分别培养24h、48h、72h后，流式细胞仪检测的细胞凋亡情况；其中，图中左下象限表示活细胞，右下象限表示早期凋亡的细胞，右上象限表示晚期凋亡或死亡的细胞，左上象限表示死亡细胞；LL为活细胞率，LR为细胞早期凋亡率，UR为细胞晚期凋亡或死亡率，UL为细胞死亡率；N1、N2、N3分别代表24h、48h、72h的细胞对照组，D1、D2、D3分别代表24h、48h、72h的病毒对照组；

图9所示为400μg/mL的败酱草提取物对PRRSV进行阻断作用，作用24h、48h、72h后，流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响；其中，图中左下象限表示活细胞，右下象限表示早期凋亡的细胞，右上象限表示晚期凋亡或死亡的细胞，左上象限表示死亡细胞；LL为活细胞率，LR为细胞早期凋亡率，UR为细胞晚期凋亡或死亡率，UL为细胞死亡率；A1、A2、A3分别表示24h、48h、72h的S提取物组，B1、B2、B3分别表示24h、48h、72h的阳性对照药物利巴韦林组；

图10所示为400μg/mL的败酱草提取物对PRRSV进行抑制作用，作用24h、48h、72h后，流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响；其中，图中左下象限表示活细胞，右下象限表示早期凋亡的细胞，右上象限表示晚期凋亡或死亡的细胞，左上象限表示死亡细胞；LL为活细胞率，LR为细胞早期凋亡率，UR为细胞晚期凋亡或死亡率，UL为细胞死亡率；A1、A2、A3分别表示24h、48h、72h的S提取物组，B1、B2、B3分别表示24h、48h、72h的阳性对照药物利巴韦林组；

图11所示为400μg/mL的败酱草提取物对PRRSV进行直接灭活作用，作用24h、48h、72h后，流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响；其中，图中左下象限表示活细胞，右下象限表示早期凋亡的细胞，右上象限表示晚期凋亡或死亡的细胞，左上象限表示死亡细胞；LL为活细胞率，LR为细胞早期凋亡率，UR为细胞晚期凋亡或死亡率，UL为细胞死亡率；A1、A2、A3分别表示24h、48h、72h的S提取物组，B1、B2、B3分别表示24h、48h、72h的阳性对照药物利巴韦林组；

图12所示为感染病毒后各组仔猪的体温变化监测；

图13所示为感染病毒后各组仔猪的临床症状评分；

图14所示为试验各组仔猪的肺脏病变观察；

图15所示为试验各组仔猪的肺脏病理切片观察结果；

图16所示为试验仔猪的血清病毒血症动态监测；

图17所示为试验仔猪猪的组织器官病毒载量RT-PCR检测，*P<0.05，**P<0.01；

图18所示为试验仔猪的PRRSV抗体检测。

具体实施方式

本发明公开了败酱草的应用以及治疗猪蓝耳病的中药组合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用和中药组合物已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用和中药组合物进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，通过败酱草水提物进行抗病毒试验，具体如下：

败酱草中药材购自于安国药源商贸有限公司，经江苏农牧科技职业学院动物药学院于生兰教授鉴定，标本存放于江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制品高技术研究重点实验室。

将败酱草中药材粉碎后，称取1000g，加入10倍量水，三次煎煮提取并过滤，每次30min，合并滤液，浓缩至1g/mL，放入真空干燥箱干燥，备用。

干燥后败酱草提取物质量为290g，提取率为29.0％。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，采用软件SPSS17.0软件进行单因素方差分析，所有数据均以Mean±SD表示，Student’s test统计学分析。用Image J分析所得的蛋白条带灰度值，用目的条带灰度值除以相对应的β-actin条带灰度值，所得比值即为相对表达值。所有柱状图采用Graphd Prism5进行作图。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：败酱草提取物和利巴韦林的细胞毒性

1、材料

(1)利巴韦林购自于南通飞宇生物科技有限公司。

(2)四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自于北京索莱宝科技有限公司。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

2、试验方法

用含10％FBS的DMEM将细胞瓶中长至单层的细胞消化后稀释至约2×10⁵/mL，加入96孔板,每孔100μL细胞悬液。待细胞长至单层后，弃去旧培养液，第1～10列依次从高浓度至低浓度加入稀释的药液，每个浓度重复4孔，每孔100μL，11～12列加入细胞培养液作为细胞对照。培养72h后，弃去药液，加入MTT溶液，20μL/孔，继续培养4h后，弃去MTT溶液，加入DMSO完全溶解结晶，测OD_490nm值。计算公式如下：

生长抑制率(％)＝(细胞对照组OD_490nm值-药物组OD_490nm值)/细胞对照组OD_490nm值×100％

当抑制率为0时，则该浓度下药物对细胞没有毒性作用，从而确定药物的最大安全浓度，结果如表1所示。

表1不同浓度药物对Marc-145细胞的抑制率(％)

注：败酱草提取物的起始浓度为25mg/mL，利巴韦林起始浓度为1mg/mL。

3、结果

由表1可知，当败酱草提取物浓度为400μg/mL及以下时，利巴韦林浓度为15.63μg/mL及以下时，其对Marc-145细胞没有毒性。故后续试验所采用的败酱草提取物的起始浓度为400μg/mL，利巴韦林的起始浓度为15.63μg/mL。

实施例2：病毒滴度(TCID₅₀)测定

用不含FBS的DMEM培养液将病毒液按照10倍比依次稀释成10^-1～10^-8，8个浓度梯度，接种于96孔细胞培养板上，100μL/孔。每个稀释度接种8孔，同时设立病毒对照组和细胞对照组，置于5％CO₂、37℃培养箱培养2h后，弃去病毒液，加入细胞维持液，观察5～7天，记录细胞病变情况，用Reed-Muench法计算TCID₅₀，计算公式如下：

LgTCID₅₀＝高于50％病变率的病毒稀释度对数+(高于50％病变率-50％)/(高于50％病变率-低于50％病变率)×稀释倍数的对数

病毒滴度测定的结果如表2所示，根据公式计算得到PRRSV对Marc-145细胞的TCID₅₀值为10^-4.6/0.1mL，即接种0.1mL病毒浓度为10^-4.6的病毒液可使50％细胞发生病变。

表2PRRSV TCID₅₀测定结果

实施例3：MTT法检测败酱草提取物体外抗PRRSV的作用效果

采用阻断、抑制、直接灭活3种作用方式检测败酱草提取物体外抗PRRSV的作用效果。第1种方式为先加药物后加病毒(阻断)，目的是观察药物能否与细胞膜表面受体结合而阻止病毒的吸附和进入；第2种作用方式为先加病毒后加药物(抑制)，目的是观察药物是否能进入细胞对细胞内的病毒起作用，进入细胞内抑制病毒的生物合成和复制；第3种作用方式为药物和病毒作用一段时间后再加入(直接灭活)，目的是观察药物对病毒是否具有直接灭活作用，感染前宿主细胞外直接抑灭病毒。这3种作用方式分别与临床预防、治疗和消毒试验的设计相吻合，通过临床来看，第1种作用方式是药物对病毒性疾病的预防作用，而后两种作用方式是药物对病毒性疾病的治疗作用。

(1)败酱草提取物对PRRSV的阻断作用

Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入以最大安全质量浓度为起始浓度的中药提取物溶液，每孔100μL，2倍比稀释4个浓度梯度，培养4h后，弃去药液，加入100TCID₅₀ PRRSV液，每孔100μL，培养2h后，弃去病毒液，加入含2％FBS的DMEM生长维持液。通过公式计算得到药物对病毒的抑制率。

结果如表3所示，可以得到败酱草提取物和利巴韦林在最大安全浓度时对PRRSV的最大抑制率分别为117.94％、63.31％，败酱草提取物对利巴韦林的抑制率显著高于利巴韦林(P<0.01)，说明败酱草提取物对PRRSV具有较强的阻断作用。

表3药物的阻断作用对PRRSV的抑制率(％)

注：C1、C2、C3、C4表示从药物的最大安全浓度开始的2倍倍比稀释的4个不同浓度，所有数据均用平均值±标准差(Mean±SD)表示。与利巴韦林对照组比较，*P<0.05，**P<0.01(作用增强)；^aP<0.05，^aaP<0.01(作用减弱)。下同。

(2)败酱草提取物对PRSV的抑制作用

Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入100TCID₅₀PRRSV液，每孔100μL，培养2h后，弃去病毒液，加入以最大安全质量浓度为起始浓度的中药提取物溶液，每孔100μL，2倍比稀释4个浓度梯度，培养4h后，弃去药液，加入含2％FBS的DMEM生长维持液。通过公式计算得到药物对病毒的抑制率。

结果如表4所示，败酱草提取物和利巴韦林对PRRSV的最大抑制率分别为109.14％、68.85％，败酱草提取物对利巴韦林的抑制率显著高于利巴韦林(P<0.01)，说明败酱草提取物对PRRSV具有较强的抑制作用。

表4药物的抑制作用对PRRSV的抑制率(％)

(3)败酱草提取物对PRRSV的直接灭活作用

Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，同时加入50μL中药提取物溶液和50μL病毒液(使药液最高浓度为最大安全质量浓度和病毒液终浓度为100TCID₅₀)，培养4h后，弃去药液，加入含2％FBS的DMEM生长维持液。通过公式计算得到药物对病毒的抑制率。

结果如表5所示，败酱草提取物和利巴韦林对PRRSV的最大抑制率分别为113.25％、65.46％，败酱草提取物对利巴韦林的抑制率显著高于利巴韦林(P<0.01)，说明败酱草提取物对PRRSV具有较强的直接灭活作用。

表5药物的直接灭活作用对PRRSV的抑制率(％)

实施例4：败酱草提取物对PRRSV作用下N基因、N蛋白表达及细胞凋亡的影响

1.败酱草提取物对PRRSV作用下N基因表达的影响

1.1引物设计

参照NCBI PubMed基因库，使用软件Primer Premier 5.0设计了PRRSV N基因引物，见表6。

表6引物序列及PCR产物大小

1.2标准品制备

从病毒液中提取RNA，并对提取的RNA进行反转录，利用针对N基因编码的特异性引物进行PCR扩增，连接pMD-18T载体，转化DH5α感受态细胞，试剂盒提取质粒，测定浓度。对质粒进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小，并测定N基因重组质粒的浓度，计算标准品模板量。

测序结果表明，重组质粒基因序列与NCBI数据库对应序列同源性达99.6％。普通PCR扩增重组质粒，将扩增产物进行电泳，可看到一条整齐的条带，并且与预期条带大小一致，结果见图1。重组质粒OD260/OD280值为1.89，并根据浓度与拷贝数的换算公式，计算出重组质粒的拷贝数为2.94×10⁹copies/μL。

1.3重组质粒浓度测定及标准曲线建立

制作标准曲线。将使用EASY Dilution 10倍比稀释的标准品(10-1～10-6)作为模板，应用ABI 7300荧光定量PCR仪，进行扩增，反应体系如下，见表7：

表7荧光定量PCR反应体系

两步法进行荧光定量PCR反应：预变性95℃30s；变性95℃5s，退火延伸60℃31s，40个循环，延伸结束，收集荧光信号；最后60～90℃过程中制作熔解曲线。

1.4败酱草提取物对PRRSV作用下N基因表达的影响

已长至单层的Marc-145细胞的六孔板中，弃去旧培养液，采用先加药液后加病毒液、先加病毒液后加药液和同时加入病毒液和药液的方式，使药液浓度为最大安全浓度和病毒液终浓度为100TCID₅₀，5％CO₂、37℃分别继续培养24h、48h、72h，每个时间点设3个重复。同时设阳性药物利巴韦林对照组(利巴韦林和病毒液)、细胞对照组(只加细胞维持液)和病毒对照组(只加病毒液)。

按照TaKaRa MiniBEST UniversalRNAExtraction Kit试剂盒操作说明提取细胞总RNA，并反转录得到的各处理组cDNA，使用RNase-free H₂O将各组样品稀释至上样浓度，按反应体系：SYBR Green Premix ExTaq II(2×)10μL，PCRForward Primer(10μM)0.8μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.8μL，ROX Reference Dye(50×)0.4μL，cDNA 2μL，灭菌水6μL，总体系为20μL进行反应，利用同一批所制作的标准曲线，参照各组Ct值，计算各组样品中PRRSV N基因拷贝数。结果如附图2、图3、图4所示，败酱草提取物和利巴韦林均可抑制N基因的合成，且败酱草提取物效果强于利巴韦林，表明败酱草提取物具有抗PRRSV的作用。

2.败酱草提取物对PRRSV作用下N蛋白表达的影响

按照上述1.4中方法培养细胞，弃掉培养液，吸尽，加入4℃预冷PBS轻轻洗涤后弃去，将板置于冰上，每孔细胞加入100μL含PMSF的裂解液(1mL裂解液含100μL PMSF)，于冰上裂解30min，经常摇动使其充***解；以β-actin为内参，进行western blot检测。

结果如附图5、图6、图7所示，败酱草提取物和利巴韦林均可抑制N蛋白的表达，且败酱草提取物效果强于利巴韦林，该结果与基因水平检测结果一致。

3.败酱草提取物对PRRSV作用下细胞凋亡的影响

按照上述1.4中方法培养细胞，按照Annexin V-EGFP/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书收集细胞样品，使用流式细胞仪检测败酱草提取物在细胞感染PRRSV后对细胞凋亡的影响。

结果如附图8、图9、图10、图11，表8、表9、表10、表11所示，细胞在感染PRRSV 24h后，出现了细胞凋亡，但并不十分明显，在细胞感染病毒48h和72h后，细胞凋亡明显，并且病毒对照组在72h时出现了明显的晚期凋亡。在24h～72h内，败酱草提取物进行三种作用方式抗PRRSV的研究结果显示晚期凋亡细胞率与细胞对照组均没有显著差异，且总凋亡率显著低于病毒对照组(P<0.05)。这提示败酱草提取物可能是通过抑制细胞晚期凋亡达到抗PRRSV的作用效果。

表8病毒对照和细胞对照组的细胞凋亡检测结果

注：与细胞对照比较，^#P<0.05，^##P<0.01；

表9阻断作用时的细胞凋亡检测结果

注：与PRRSV对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与细胞对照组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；与利巴韦林对照组相比，^aP<0.05，^aaP<0.01；

表10抑制作用时的细胞凋亡检测结果

注：与PRRSV对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与细胞对照组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；与利巴韦林对照组相比，^aP<0.05，^aaP<0.01

表11直接灭活作用时的细胞凋亡检测结果

注：与PRRSV对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与细胞对照组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；与利巴韦林对照组相比，^aP<0.05，^aaP<0.01

实施例5：体内试验

1.试验猪病原检测

从PRRS非免疫猪场购买28日龄杜长大三元杂交断奶猪12头，负压隔离器饲养3～5天观察有无异常；实验前前腔静脉采血分离血清，用试剂盒提取DNA/RNA，合成PRRSV特异引物(F:GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA，R:GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC)，以本实验室保存的病毒基因组为阳性对照，用PCR/RT-PCR检测试验猪的病原感染情况，并用猪蓝耳病毒(PRRSV)酶联免疫吸附测定试剂盒检测PRRSV特异抗体。

2.实验方案

将9头32日龄断奶仔猪分成4组，每组3头，分别饲养于4个负压隔离器，第1组注射败酱草提取液，第2组注射阳性对照药物利巴韦林药液，第3组不注射作为攻毒对照组，第4组作为不注射不攻毒对照组。给药第4日后，第1、2、3组仔猪肌肉注射加滴鼻接种SH1705株PRRSV(10⁵TCID₅₀)。

3.体温监测

试验仔猪感染PRRSV后，每日定时测量直肠温度一次，记录数据，绘制体温变化趋势图。结果如图12所示，在感染病毒第4日开始，攻毒对照组和药物组的仔猪体温均明显升高，并第11日体温下降并逐渐恢复正常。观察各组仔猪的体温，尚不能看出败酱草提取物体内抗PRRSV的作用。

4.临床症状评分

每日观察临床症状2次并记录，根据表12临床症状评分标准进行评分。

表12临床症状评分标准

结果如图13所示，攻毒对照组仔猪于第3日开始出现腹泻、消瘦等临床症状(1-4分)，随后逐渐严重(4-10分)，出现皮疹、皮肤溃烂、呼吸急促和掉毛等临床症状，于第17日症状缓解并持续至第22日；阳性对照药物利巴韦林组仔猪在第8日开始出现腹泻、皮疹等临床症状，并持续至第22日(2-3分)；败酱草提取物组仔猪在第3日出现轻微症状并逐渐恢复正常(1-3分)，第4-16日临床症状评分显著低于攻毒对照组(P<0.05)。空白对照组猪在试验期间未发生明显症状。

5.样品采集及检测

在PRRSV感染后第1、3、5、8、11、15、18、22日，对每只仔猪前腔静脉采集血液5mL分离血清，并在第8、15、22日的时候另外采集5mL抗凝血做流式检测，同时每组采集粪便1g用PBS重悬；对病死或试验结束扑杀动物进行剖检，采集心、肝、脾、肺、肾、***等样品，-80℃冰箱冻存备用。采集肺脏组织块，切成1mm³的小块，经4℃4％缓冲液固定，对固定组织样品进行石蜡包埋，常规HE染色后观察其病理组织学变化。

5.1肺脏剖检及病理切片观察

各组仔猪的肺脏变化见图14，病理切片观察结果见图15。由图14可见，攻毒对照组仔猪肺脏明显出血、肿大，表面可见大量坏死灶，败酱草提取物组和阳性对照药物利巴韦林组仔猪肺脏无明显肉眼变化，仅见少量出血点和坏死灶。图15显示：攻毒对照仔猪的肺脏的间质性肺炎明显，肺泡壁增厚，淋巴细胞浸润，支气管内出现大量渗出物，阳性对照组病理损伤较攻毒对照组减轻，败酱草组病理损伤较阳性对照组轻，空白对照组仔猪肺脏正常，均未发现病理损伤，表明败酱草提取物和阳性对照药物利巴韦林体内能减轻PRRSV感染所引起的组织损伤和组织病变。

5.2病毒载量检测

用TaKaRa MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit试剂盒从各样品提取病毒RNA，其中血清取200μL，组织器官各取100mg，按照上述建立的荧光定量RT-PCR检测各样品的病毒基因组拷贝数。

病毒血症检测结果如图16所示，攻毒对照组仔猪血清在第3天PRRSV检测阳性，病毒RNA拷贝数于第8天时升至最高(4.6-5.1log10/mL)，期间无仔猪死亡，在第22天时仔猪的血清病毒含量降低至1.1-1.6log10/mL；阳性对照药物利巴韦林组和败酱草提取物组仔猪同样也是在感染后第3天PRRSV检测阳性，病毒RNA拷贝数均在第8天时升至最高，血清病毒含量分别为4.1-5.1log10/mL，4.0-4.8log10/mL，并且分别在第22天时降至0.4-0.9log10/mL，0.1-0.9log10/mL，败酱草提取物组在第12-20天猪血清中病毒含量显著低于阳性对照药物利巴韦林组和感染组(P<0.05)。

器官病毒载量检测结果如图17所示，攻毒对照组的心、肝、脾、肺、肾、***病毒载量分别为1.9-4.2，1.2-1.9，4.1-4.2，4.1-4.7，1.2-2.1，4.4-4.6log10/g；阳性对照药物利巴韦林组分别为0.9-2.0，0.5-1.6，4.1-4.7，1.4-2.3，1.4-1.7，3.5-4.9log10/g，其中肝和肺的病毒载量明显低于攻毒对照组(P<0.05，P<0.01)；败酱草提取物组分别为0.6-2.5，1.1-1.3，3.2-3.6，1.8-4.0，0.9-1.6，2.7-3.8log10/g，其中脾、肺和***等器官的病毒载量显著低于攻毒对照组(P<0.05)，***的病毒载量显著低于阳性对照药物利巴韦林组(P<0.05)，而肺的病毒载量显著高于阳性对照药物利巴韦林组(P<0.05)。该结果表明，阳性对照药物利巴韦林和败酱草提取物均具有体内抑制PRRSV的作用，且败酱草提取物的抗PRRSV的作用效果较利巴韦林稍强。

5.3PRRSV抗体检测

感染PRRSV SH1705后，定期采集各组仔猪血清，按照江莱猪蓝耳病毒(PRRSV)酶联免疫吸附测定试剂盒说明书进行PRRSV抗体水平的检测。

结果如图18所示，在攻毒后第1天时，攻毒对照组、阳性对照药物利巴韦林组和败酱草提取物组抗体检测均为阳性，随后攻毒对照组和败酱草提取物组抗体水平迅速升高，并且均在第8天时抗体水平达到最高值，在第3-8天时，败酱草提取物组抗体水平显著高于攻毒对照组(P<0.05)，表明败酱草提取物能够刺激机体免疫，促进抗体产生，从而使抗体水平快速升高。在第9-15天时败酱草提取物组抗体水平逐渐降低，并在第15-22天时，抗体水平趋于平缓，表明在这期间败酱草提取物可能发挥直接杀灭病毒的作用。同样地，阳性对照药物利巴韦林抗体水平在第1-15天时显著低于攻毒对照组(P<0.05)，表明利巴韦林不具有调节免疫的作用，而是发挥其直接杀灭病毒的作用。试验期间空白对照组仔猪PRRSV抗体检测结果均为阴性(未列出)。

以上结果表明，败酱草提取物具有体内外抗PRRSV病毒的作用。在体内，其通过阻断病毒吸附、抑制病毒复制、直接杀灭病毒以及抑制PRRSV所诱导的细胞凋亡实现。并且，败酱草提取物还通过抑制N基因合成和N蛋白表达，发挥其抗PRRSV病毒作用。为进一步验证败酱草提取物抗PRRSV的作用，进行了PRRSV SH1705毒株的攻毒保护试验，肺脏病变观察、病毒血症、器官病毒载量等结果均表明，败酱草提取物可有效抑制PRRSV在体内的增殖，并具有调节机体免疫的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。