缬草在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用
阅读说明：本技术 缬草在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用 (Application of valerian in preparation of product for promoting proliferation of intestinal beneficial bacteria ) 是由 刘庆军 沈鹤霄 李国龙 张帆 彭文聪 熊云 刘慧敏 吕永玲 于 2021-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了缬草在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用,涉及生物技术领域。通过体内模拟实验,发现缬草可以有效促进多种肠道有益菌的增殖,特别是可以特异性地促进Lactobacillus的增殖,可以制备形成促进肠道有益菌增殖的产品,还可以用于治疗肠道有益菌含量下降所导致的疾病,为临床应用提供科学依据,而且具有非常好的应用前景。(The invention discloses application of valerian in preparation of a product for promoting proliferation of beneficial bacteria in intestinal tracts, and relates to the technical field of biology. Through in vivo simulation experiments, the valerian is found to be capable of effectively promoting the proliferation of various intestinal beneficial bacteria, particularly specifically promoting the proliferation of Lactobacillus, preparing and forming a product for promoting the proliferation of the intestinal beneficial bacteria, and treating diseases caused by the reduction of the content of the intestinal beneficial bacteria, so that a scientific basis is provided for clinical application, and the valerian has a very good application prospect.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及缬草在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。
背景技术
缬草的分布十分广泛，如中国的东北至西南的广大地区，在欧洲和亚洲西部也广为分布。缬草的作用也较为广泛，主要表现在：(1)具有安神镇痛的作用，可以抑制大脑皮层对于反射的兴奋性，还可以用于治疗心血管神经官能症和甲状腺机能亢进等疾病，且有着良好的功效；(2)缬草具有降血压的功效；(3)具有一定的利尿功效，用来治疗小便不利。然而，其对于肠道微生物的调节作用，目前未见相关报道。
人体肠道中存在的数量庞大的微生物，这群微生物依靠人体的肠道生活，同时帮助人体完成多种生理生化功能。肠道微生物不仅在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用，其本身以及代谢产物也能调节人体健康，因此肠道微生物与人体健康密切相关。肠道微生物通过与宿主之间的动态性生理作用，达到微生态平衡，有效防止肠道内细菌及内毒素易位。当正常的微生物群落受到宿主及外环境影响时，原有的平衡遭到破坏，肠道菌群失调，肠道正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化，转变为病理性组合状态，进而导致宿主致病。目前研究表明，人体的多种疾病都与肠道有益菌减少具有密切关联，多个文献报道Lactobacillus属与结肠癌、克罗恩和便秘等有关联。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供缬草在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。
本发明的另一目的在于提供用于促进肠道有益菌增殖的产品，旨在利用缬草促进肠道有益菌增殖。
本发明的第三目的在于提供缬草在制备用于治疗肠道有益菌含量下降所导致的疾病的药物中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供缬草在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。
在可选的实施方式中，肠道有益菌包括乳酸杆菌、粪杆菌和副萨特氏菌。
在可选的实施方式中，肠道有益菌包括乳酸杆菌和粪杆菌。
在可选的实施方式中，肠道有益菌为乳酸杆菌。
在可选的实施方式中，缬草为缬草提取物。
在可选的实施方式中，缬草提取物提取自缬草的根及根茎部。
第二方面，本发明提供一种用于促进肠道有益菌增殖的产品，包括缬草。
在可选的实施方式中，缬草为缬草提取物。
第三方面，本发明提供缬草在制备用于治疗肠道有益菌含量下降所导致的疾病的药物中的应用。
在可选的实施方式中，肠道有益菌含量下降所导致的疾病包括结肠癌、克罗恩和便秘中的至少一种。
本发明具有以下有益效果：发明人通过体内模拟实验，发现缬草可以有效促进多种肠道有益菌的增殖，可以制备形成促进肠道有益菌增殖的产品，还可以用于治疗肠道有益菌含量下降所导致的疾病，为临床应用提供科学依据，而且具有非常好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为将缬草应用到促进肠道有益菌增殖中，菌群经缬草干预前后的丰度变化示意图；
图2为试验组和对照组中Lactobacillus生长曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
发明人通过在体外模拟肠道环境，并以健康人体粪便中收集的肠道菌群作为样本，将缬草提取物应用到促进肠道有益菌增殖发酵中。发明人发现，缬草可以有效促进肠道有益菌增殖，并且对特定的菌种有突出的效果。
本发明实施例提供缬草在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用，肠道有益菌包括乳酸杆菌(Lactobacillus)、粪杆菌(Faecalibacterium)、副萨特氏菌(parasutterella)，缬草对以上四种肠道有益菌有一定的促进作用，可以对该肠道有益菌群起促进作用。
在优选的实施方式中，肠道有益菌包括乳酸杆菌、粪杆菌和副萨特氏菌。发明人发现，缬草对以上三种肠道有益菌的促进效果要优于大肠杆菌志贺菌。
在更优选的实施方式中，肠道有益菌包括乳酸杆菌和粪杆菌。发明人发现，缬草对以上两种肠道有益菌的促进效果，要优于副萨特氏菌，效果较为显著。
在进一步优选的实施方式中，肠道有益菌为乳酸杆菌。发明人发现，缬草对乳酸杆菌的促进效果最为显著，表现出显著的特异性。
在一些实施例中，缬草为缬草提取物，可以为市购产品，缬草提取物提取自缬草的根茎部。
本发明实施例提供一种用于促进肠道有益菌增殖的产品，包括缬草，还包括其他组分，如其他能够促进肠道有益菌增殖的中药组分，形成组合物的形式；该产品也可以是以缬草为单一活性成分制成的产品，可以是添加剂，可以是食品或保健品。
在一些实施例中，缬草为缬草提取物，可以是提取自缬草根及根茎部的提取物，采用市购产品即可。
多个文献报道Lactobacillus属与结肠癌、克罗恩和便秘等有关联，如：
Zaharuddin,L.,Mokhtar,N.M.,Muhammad Nawawi,K.N.,&Raja Ali,R.A.(2019).A randomized double-blind placebo-controlled trial of probiotics in post-surgicalcolorectal cancer.BMC Gastroenterology,19(1).这一文献公开了以上肠道有益菌减少会引发结肠癌。
El Mouzan,M.I.,Winter,H.S.,Assiri,A.A.,Korolev,K.S.,AlSarkhy,A.A.,Dowd,S.E.,…Menon,R.(2018).Microbiota profile in new-onset pediatric Crohn’sdisease:data from a non-Western population.Gut Pathogens,10(1).这一文献公开了以上肠道有益菌减少会引发克罗恩。
Wang,L.,Chen,C.,Cui,S.,Lee,Y.,Wang,G.,Zhao,J.,…Chen,W.(2019).Adhesive Bifidobacterium Induced Changes in Cecal Microbiome AlleviatedConstipation in Mice.Frontiers in Microbiology,10.这一文献公开了以上肠道有益菌减少会引发便秘。
本发明实施例还提供缬草在制备用于治疗肠道有益菌含量下降所导致的疾病的药物中的应用，利用缬草促进肠道有益菌增殖的特性，可以有效缓解由于肠道有益菌含量下降所导致的疾病，如结肠癌、克罗恩和便秘等。
试验例1
考虑到来源于人体的肠道菌群无法完全在小鼠体内进行定殖，导致菌群丰度测定结果不准确的问题，在体外进行体内模拟实验，取人体粪便作为肠道菌群样品，观察缬草干预对于肠道菌群的作用，具体操作过程如下：
1、粪便样品处理
(1)PBS缓冲液配制
以1000mL为例，用电子分析天平分别称取下列药品，倒入1000mL烧杯中，包括：KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 2.90g，NaCl 8.00g，KCl 0.20g。用量筒量取800mL超纯水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力加热搅拌器上搅拌至完全溶解，然后用校准后的pH计测量上述溶液的pH，用0.1M的HCl或NaOH调整pH＝7.4±0.05。
将上述完全溶解并调节pH后的溶液用玻璃棒引流至1000mL容量瓶中，用少量超纯水冲洗烧杯后倒入容量瓶，重复3次。将容量瓶中的液体用超纯水定容至刻度线，塞上盖子后上下颠倒10次，确保溶液充分混匀。
将定容后的溶液倒入洁净黄色盖子的玻璃瓶，每1000mL的瓶子内放500mL溶液，防止高压灭菌时喷出。将黄色玻璃瓶盖子拧松后，放入高压灭菌锅，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15分钟。取出后迅速拧紧盖子。待降至室温后，将溶液需存于4℃冰箱中，可保存6个月。
(2)粪便样品处理
以10g为例，最终浓度为5％。
用百分之一的天平称量出10g粪便样品，用自动移液枪取适量上述PBS缓冲液加至离心管中，在振荡器上充分混匀。然后将完全混匀的样品平均分装至新50mL离心管中，每管再加适量PBS缓冲液。
混匀后在生物安全柜内进行过滤，把稀释好的样品依次通过20目、50目、100目、200目的滤网。收集滤液至离心管中，将离心管放入离心机，配平，6000G，4℃离心15min，弃上清。将沉淀称量之后，以终浓度为5％用PBS溶液定容，得到肠道微生物样品。
2、缬草干预实验
(1)基础培养基配制
配制用于培养肠道微生物的基础培养基：GAM培养基，以1000mL为例。用电子分析天平称取60g改良GAM肉汤药品，倒入1000mL烧杯中。用量筒量取800mL超纯水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力加热搅拌器上搅拌至完全溶解。将上述完全溶解的溶液用玻璃棒引流至1000mL容量瓶，并用少量超纯水冲洗烧杯后倒入容量瓶，重复3次。将容量瓶中的液体用超纯水定容至刻度线，塞上盖子后上下颠倒10次，确保溶液充分混匀。
将定容后的溶液倒入洁净黄色盖子的玻璃瓶，每1000mL的瓶子内放500mL培养基，防止高压灭菌时喷出。将装有培养基的黄色盖子的玻璃瓶，瓶盖拧松，放入脉冲高压灭菌锅，使用液体程序，121℃，15分钟。灭菌完后，立即把瓶盖拧紧，冷却至室温。
(2)缬草-GAM培养基配制
于无菌操作台上，用1mL的移液枪取上述GAM培养基分装至玻璃管中，每管2mL。将黑色盖子放在瓶口上微掩。接着用1mL移液器取缬草溶液(缬草购于西安奥赛生物科技有限公司，用PBS缓冲液溶解至质量百分浓度为：5％)，加入上述装有GAM培养基的玻璃管中，每管2mL，作为试验组。同时还设置有空白对照组，每组3个重复，分组具体如下：
试验组：2mL GAM培养基+2mL缬草溶液+1mL PBS缓冲液；
对照组：2mL GAM培养基+3mL PBS缓冲液；
确认好每个玻璃管盖拧紧后，转移至厌氧箱传递箱中，放置之前需用84消毒液消毒处理。放入厌氧箱后，拧松瓶盖，置换氧气，需置换12个小时。
将上述处理后得到的肠道微生物样品分别接种至试验组(缬草-GAM培养基-PBS缓冲液)以及空白对照组(GAM培养基-PBS缓冲液)中，每管1mL。
于厌氧箱中培养72小时后，观察菌群的生长状况，拍照留存。
接着分别将试验组样品和对照组样品，10000rpm，3min离心，弃上清，将沉淀用液氮处理，并送至武汉艾康健生物科技有限公司，分别测定试验组和对照组中的肠道菌群丰度，即不同肠道微生物在检测到的所有菌种中所占的百分比，其中部分肠道菌群的丰度测定结果如表1所示。
表1不同处理组的肠道菌群丰度
若以：(试验组均值-对照组均值)/对照组均值，计算提升效果，则缬草对以上四种菌均有提升效果，且Lactobacillus、Faecalibacterium、Parasutterella的提升效果依次减弱，对Lactobacillus具有特异性提升的效果。
并对部分肠道菌群经缬草干预前后的丰度变化进行显著性分析。分析结果如图1所示，其中*表示P＜0.05，即丰度变化有显著差异。Lactobacillus丰度水平有极其明显的升高，达到促进肠道有益菌增值的作用，Faecalibacterium，Parasutterella提升效果不明显。
本试验例通过体外模拟肠道环境，并以健康人体粪便中收集的肠道菌群作为样本，将缬草提取物应用到促进肠道有益菌增殖发酵，为临床应用提供科学依据，达到高效制备肠道有益菌剂。
试验例2
进一步观察缬草对于乳杆菌Lactobacillus生长的动态变化，即经缬草处理后，乳杆菌Lactobacillus丰度随时间的变化曲线，具体如下：
准备100μl无菌枪头，需在高压灭菌锅内进行115℃、20mins的灭菌。移液枪、无菌96孔板事先用酒精消毒后放入生物安全柜进行30分钟的紫外灭菌。再转移至厌氧箱内进行取样测定OD600值。
采用缬草对乳杆菌Lactobacillus进行培养作为试验组，以未添加缬草的培养液作为对照组，定时取样测定。培养液充分摇匀再取样，每个培养瓶取三次100μl样品的量，分别纵向添加，再横向稀释三至五组连续的梯度，每个培养瓶使用一根无菌枪头。以此类推，对所有的培养液进行测定。
使用系统:Tecan i-control,2.0.10.0，设定系统数值如表2。
表2系统设定参数
根据系统得出的数据如表3所示。
表3缬草对Lactobacillus的促进作用
根据上述表3的数据，以测点时间为X轴，测定OD值为Y值，绘制试验组(缬草)和对照组相应的生长曲线图，如图2所示。
结果显示，试验组和对照组的乳杆菌Lactobacillus在两小时后开始迅速生长，4小时后开始进入对数生长期，12-24h为稳定期，24h后进入衰亡期。对比试验组和对照组的生长曲线可以得出，在缬草的培养下，乳杆菌Lactobacillus生长得更加旺盛，这也说明缬草对乳杆菌Lactobacillus的生长有促进作用。
综上所述，本发明提出一种缬草在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用，通过体内模拟实验，发现缬草可以有效促进多种肠道有益菌的增殖，特别是可以特异性地促进Lactobacillus的增殖，可以制备形成促进肠道有益菌增殖的产品，还可以用于治疗肠道有益菌含量下降所导致的疾病，为临床应用提供科学依据。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。