阅读说明：本技术 Mad2蛋白质及其相关生物材料在调控植物免疫与共生反应中的应用 () 是由 农向群 蔡霓 闫多子 王广君 张泽华 涂雄兵 王峰 郝昆 于 2019-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了Mad2蛋白质及其相关生物材料在调控植物免疫与共生反应中的应用。本发明以花生为宿主植物样本,从绿僵菌中克隆得到Mad2基因,并构建重组载体,利用毕赤酵母真核表达系统进行体外表达,得到了有活性的Mad2蛋白质,然后利用Mad2蛋白质体外处理花生根组织,并通过RT-qPCR检测处理组花生的免疫相关基因的表达水平。结果表明,一方面,宿主花生免疫相关基因下调表达,说明Mad2蛋白可以调控宿主植物的免疫反应,另一方面,宿主花生共生相关基因上调表达,说明Mad2蛋白具有参与绿僵菌共生建立的功能,为后续对该蛋白功能研究和利用提供参考。()

Mad2蛋白质及其相关生物材料在调控植物免疫与共生反应中 的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及Mad2蛋白质及其相关生物材料在调控植物免疫与共生反应中的应用。

背景技术

金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae一直被定位为昆虫病原真菌，前人大量的研究都集中在其对寄主致病力、致死机理和生物防治等方面，在科学研究和实践中， 发现有很多的疑问和难题都与生态学有关，研究者逐渐关注到它与土壤和植物的相互 作用。目前，金龟子绿僵菌存在内生性的特点已成为科学研究的热门，且有诸多的科 学报道证实绿僵菌可在多种宿主植物组织中定植。如果能够很好地理解绿僵菌与宿主 植物相互作用的分子机理，将为阐明绿僵菌环境宿存机制提供依据，为害虫持续防控 提供支撑。

金龟子绿僵菌粘附素Mad2(adhesin-like protein2)，涉及植物材料上的定殖与附着，Mad2蛋白的结构类似于白色念珠菌细胞壁上凝集素类序列(ALS)蛋白，含有 稳定的H键与寄主植物表面的信号肽相连。Mad2的N端域，含有一个疏水性的信号肽， C端域含有一个预测的糖基磷脂酰肌醇(GPI)的锚蛋白，侧面的三个串联重复序列被 认为是产生一个刚性的延伸结构，它将N末端固定在分生孢子的表面。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控植物免疫反应。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了Mad2蛋白质的新用途。

本发明提供了Mad2蛋白质或与Mad2蛋白质相关的生物材料在如下(1)-(7)任 一种中的应用：

(1)调控植物免疫反应；

(2)制备调控植物免疫反应的产品；

(3)参与或促进绿僵菌与寄主植物共生关系的建立；

(4)制备参与或促进绿僵菌与寄主植物共生关系的建立的产品；

(5)促进绿僵菌侵染和/或宿存寄主植物；

(6)制备促进绿僵菌侵染和/或宿存寄主植物的产品；

(7)制备植物免疫反应抑制剂；

所述Mad2蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

所述与Mad2蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码Mad2蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或序列3所示的基因组DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至 少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有 98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

进一步的，所述调控植物免疫反应为抑制植物免疫反应；所述抑制植物免疫反应具体体现在下调植物免疫反应相关蛋白的表达水平；

所述参与或促进绿僵菌与寄主植物共生关系的建立或所述促进绿僵菌侵染和/或宿存寄主植物体现在上调共生相关蛋白的表达水平。

所述表达水平具体为转录水平。

更进一步的，所述植物免疫反应相关蛋白为几丁质激发子受体激酶1CERK1、油 菜素类固醇不敏感相关受体激酶1BAK1、促***原活化蛋白激酶MMK1、促***原活化 蛋白激酶MAPK、促***原活化蛋白激酶MAP2K2、钙信号受体钙依赖蛋白激酶CDPK、 抗病相关蛋白PTI1、抗病相关蛋白RML1A和/或细胞膜完整性蛋白SCW1；

所述共生相关蛋白为共生类受体LYK3、共生类受体RPK、共生相关钙信号传递与钙解码蛋白CAM、共生相关钙信号传递与钙解码蛋白CCAMK、离子转运蛋白ABCC1、铁 转移相关蛋白FRI2、氮形成和转移相关蛋白NRT24、脂质形成相关蛋白LTP1和/或次 生代谢物合生相关的蛋白酶F6H1。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1)或M2)所述的方法：

M1)抑制植物免疫反应的方法，包括如下步骤：用上述Mad2蛋白质或其溶液处理寄主植物，实现抑制植物免疫反应；

M2)促进绿僵菌与寄主植物共生关系的建立方法，包括如下步骤：用上述Mad2 蛋白质或其溶液处理寄主植物，实现促进绿僵菌与寄主植物共生关系的建立。

进一步的，所述抑制植物免疫反应体现在下调植物免疫反应相关蛋白的表达水平；

所述促进绿僵菌与寄主植物共生关系的建立体现在上调共生相关蛋白的表达水平。

更进一步的，所述植物免疫反应相关蛋白为几丁质激发子受体激酶1CERK1、油 菜素类固醇不敏感相关受体激酶1BAK1、促***原活化蛋白激酶MMK1、促***原活化 蛋白激酶MAPK、促***原活化蛋白激酶MAP2K2、钙信号受体钙依赖蛋白激酶CDPK、 抗病相关蛋白PTI1、抗病相关蛋白RML1A和/或细胞膜完整性蛋白SCW1；

所述共生相关蛋白为共生类受体LYK3、共生类受体RPK、共生相关钙信号传递与钙解码蛋白CAM、共生相关钙信号传递与钙解码蛋白CCAMK、离子转运蛋白ABCC1、铁 转移相关蛋白FRI2、氮形成和转移相关蛋白NRT24、脂质形成相关蛋白LTP1和/或次 生代谢物合生相关的蛋白酶F6H1。

上述方法中，所述用Mad2蛋白质或其溶液处理寄主植物的方法可为将寄主植物的根浸入Mad2蛋白溶液中。进一步的，所述Mad2蛋白溶液的浓度可为20mg/L。更进 一步的，所述处理的时间可为24h。在本发明的一个具体实施例中，所述Mad2蛋白质 是利用毕赤酵母真核表达系统进行体外表达得到的。

上述任一所述的应用或方法中，所述植物为绿僵菌寄主植物；所述绿僵菌寄主植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为豆科植物；所述豆科植物具体 为花生。

本发明以花生Arachis hypogaea为宿主植物样本，从绿僵菌克隆得到了Mad2基因，经过测序验证和NCBI比对分析正确后，构建重组载体，利用毕赤酵母真核表达系 统进行体外表达，得到有活性的Mad2蛋白，然后用Mad2蛋白体外处理花生根组织， 并通过RT-qPCR检测花生根组织中免疫相关基因和共生相关基因的表达水平。结果表 明，一方面，宿主花生免疫相关基因下调表达，免疫反应受到了抑制，说明Mad2可以 调控宿主植物的免疫反应，另一方面，宿主花生共生相关基因上调表达，说明Mad2 蛋白参与绿僵菌共生建立的功能，为后续对该蛋白功能研究和利用提供参考。

附图说明

图1为绿僵菌Mad2基因全长扩增电泳检测图。泳道：M：DL2000plus DNA marker；1：ddH₂O；2：绿僵菌cDNA。

图2为MD平板菌落长势突。

图3为PCR验证阳性克隆的电泳检测图。泳道：M：DL2000 plus DNA marker；1-5：重组酵母菌基因组DNA。

图4为阳性克隆诱导后的SDS-PAGE检测结果。泳道：M：protein marker；1：空 载体菌；2-6：阳性单克隆菌。

图5为发酵液上清纯化后的SDS-PAGE检测结果。泳道：M：Protein marker；1： 发酵液上清；2：10mM imidazole；3：20mM imidazole；4：30mM imidazole；5：50mM imidazole；6：250mM imidazole。

图6为Mad2蛋白体外处理的花生根的免疫相关基因的RT-qPCR检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

下述实施例中的供试菌株金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)M2-2菌株记载于文献“X.Liu,X.Q.Nong,Q.L.Wang,X.J.Li,G.J.Wang,G.C.Cao,Z.H.Zhang,Persistence and proliferation of a Chinese Metarhizium anisopliae s.s.isolatein the peanut plant root zone,Biocontrol Sci.Techn.26(2016)1-36.”中，公 众可从申请人处获得。供试菌株培养及孢子收集方法如下：将绿僵菌和镰刀菌于PDAY 培养基平板上，倒置于26℃恒温培养箱培养两周，收集孢子于4℃保存备用。PDAY培 养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为新鲜土豆200g/L、蔗糖20g/L、 酵母粉5g/L、琼脂18g/L。

下述实施例中的供试植物花生(Arachis hypogaea)鲁花11品系是青岛嘉华种业有限公司的产品。

下述实施例中的pPIC9K表达载体和酵母菌GS115均是苏州泓讯生物科技股份有限公司的产品。

下述实施例中的主要试剂如下：RNA分离试剂(invitrogen原装)，PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)，DL2000 DNA marker(Takara)，RNA spin column(全式金)，Trans1-T1Phage Rsistant Chemically CompetentCell(全式金)，无核酸酶水(Ambion)，胶回收试剂盒(Axygen)，少量质 粒提取试剂盒(Axygen)，EX Taq DNA聚合酶(Takara)，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(Takara)，pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)，无水乙醇、异丙 醇、丙三醇等试剂为国产分析纯。克隆、表达以及荧光定量PCR引物均由上海生工生 物工程股份有限公司合成。

下述实施例中所用到的特异性引物序列如表1所示。

表1、特异性引物序列

引物	序列	引物	序列
				LYK3	5'-CACTCACTTCACGGTGCTGT	CERK1	5'-GAGCAGTGACACCTATGATACC
	5'-ACATCGCTTTCCTCTTCCTG		5'-GACTCCAAAGAATCCTCAGG
				MAPK	5'-TACGAAGTGATAATGCTCGCAG	RPK	5'-AAGGTGGAGTTTGTTATGCC
	5'-TCAGTGAATGACGGTTGCTC		5'-CCTAAGGACTTGAGACCCTG
				MAP2K2	5'-TCAAGGCAACAGACAACCAG	FRI2	5'-GTTGATGTTCCTTCTAAGCCAC
	5'-GGTAGCAGACAACAACATAAGGAC		5'-CAAATCCCTTGAGAGCAATG
				RPL7	5'-ACAGTTGGTCCTCACTTCAG	cMad2	5'-TTACGTAGAATTCGCCACCATGAA
	5'-GCTCATTTATGTAAGCTTCCCT		5'-AATTAATTCGCGGCCGCTCA
				Mad2	5'-TCCAACCGCTCTCACCTTATACC	LTP1	5'-CAACCAACCAATCACCCTC
	5'-GATATATGCTGTGCGGTCAACAC		5'-GGGCTAATCTTGTATGGGATG
				CCAMK	5'-ATCCGCCTTTCATTGCTC	NRT24	5'-CCCACGGAGAAGAGAATCATC
	5'-GAACATCTTTGGCTACATCACC		5'-GGAATGGCAAACATCATAGCAC
				MMK1	5'-AACTCGGAGACGAATGAGCA	F6H1	5'-CCCTTACCATCGTGCTTGA
	5'-TTGGTGAAGGTCAGTGTCCA		5'-CCTTTGGAGTTGCTGGAATC
				RML1A	5'-CAGTGAGCGTTGCGAGATAC	CAM	5'-TGATGGCTAAGTGAGGACC
	5'-TTGGGTTTCTTTCAGCGACT		5'-AATGAAAGCAAGGGACAGAG
				CDPK	5'-CAAGACCATTGTTGAGGTTG	PTI1	5'-TTTGACCTGGGCACAGAGAG
	5'-CTCCACACATCTGATTCTGG		5'-GACACGGGTGGAATGAAGAC
				ABCC1	5'-CTCATAGGCATTGTCAGCAC	BAK1	5'-TCTTGTTCCTTGATTGGGTG
	5'-GTGAATCGGATGTTGTTGTC		5'-TCACATCCTCTTTCTGCCAC
				SCW1	5'-GAGTAAGCGATTGCGGACAG
	5'-TGTTCTCTCCCAAGTTCCCA

下述实施例中的主要培养基与缓冲液配方如下：

LB液体培养基，PH＝7，配方如表2所示。

表2、LB液体培养基

成分	含量(g/L)
		胰蛋白胨	10
氯化钠	10
		酵母粉	1

LB固体培养基，PH＝7，配方如表3所示。

表3、LB固体培养基

产菌丝培养基，自然PH，配方如表4所示。

表4、产菌丝培养基

成分	含量(g/L)
		硫酸镁	2
蔗糖	20
		酵母粉	10
磷酸氢二钾	5

YPD培养基，自然PH，配方如表5所示。

表5、YPD培养基

成分	含量(g/L)
		蛋白胨	20
葡萄糖	20
		酵母粉	10

MD培养基，自然PH，配方如表6所示。

表6、MD培养基

成分	含量(g/L)
		琼脂糖	20
YNB	13.4
		生物素	4×10<sup>-4</sup>

BMGY培养基，自然PH，配方如表7所示。

表7、BMGY培养基

成分	含量(g/L)
		酵母粉	10
YNB	13.4
		生物素	4×10<sup>-4</sup>
磷酸二氢钾	11.8
		蛋白胨	20
甘油	10mL

BMMY培养基，自然PH，配方如表8所示。

表8、BMMY培养基

成分	含量(g/L)
		酵母粉	10
YNB	13.4
		生物素	4×10<sup>-4</sup>
磷酸二氢钾	11.8
		蛋白胨	20
甲醇	5mL

50倍TAE缓冲液，配方如表9所示。

表9、50倍TAE缓冲液

成分	含量
		Tris	242g/L
冰醋酸	57.1mL
		EDTA(0.5mol/L)	20mL

10×SDS-PAGE电泳缓冲液(pH值8.3)，配方如表10所示。

表10、10×SDS-PAGE电泳缓冲液

成分	含量(g/L)
		Tris	0.3
甘氨酸	188
		SDS	10

1M D-山梨醇：182g D-山梨醇，加H₂O定容至1L。

实施例1、Mad2蛋白的制备

一、cDNA的获得

1、菌丝的培养及总RNA的提取

将收集的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)M2-2菌株孢子粉溶于0.1％Tween-80(HOTAI生物公司)，然后接种到产菌丝液体培养基中，28℃培养3d。将菌丝 通过真空泵(Air Cadet公司)抽滤，然后将抽干的菌丝立即放入液氮中速冻，再按 照如下方法提取总RNA：

1)液氮研磨样品后装入1.5mL离心管中，立即加1mL 试剂。

2)室温下静置5min，13000g离心10min。

3)取上清，加200μL氯仿(三氯甲烷)，震荡15s，静置5min，13000g离心10min。

4)用枪头吸取上层清液(一般是400μL)，加200μL氯仿(三氯甲烷)，震荡15s， 静置5min，13000g离心10min。

5)用枪头吸取上清液(一般是300μL)到新管中，加入等体积异丙醇，震荡15s， 转移至RNA spin column(北京全式金生物技术有限公司)中，冰上静置10min。

6)10000g离心2min，弃滤液。

7)加600μL RNA Wash solution(无水乙醇)，10000g离心2min，弃滤液。

8)重复步骤(7)。

9)13000g空离2min除去多余的乙醇，将RNA spin column转移到新1.5mL离心 管中。

10)加50μL预热过的RNase-free water(Ambion)，余热下静置5min，13000g 离心2min洗脱RNA。

11)收集洗脱液，并利用(IMPLEN公司)检测RNA浓度和OD_260/280确定RNA提取质量。

12)取2μL提取的RNA产物电泳检测确定RNA提取质量，然后储存于-20℃冰箱保 存备用。

2、cDNA的获得

检测总RNA提取质量后，利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA sythesis kit 反转录试剂盒(Takara公司)，将提取的总RNA反转录成cDNA。具体步骤如下：

1)按表11配置反应液

表11、反应液

试剂	使用量
		Oligo dT Primer或Random 6mers	1μL
dNTP Mixture	1μL
		Template RNA	Total:<5μg
RNase free ddH<sub>2</sub>O	Up to 10μL

2)上述10μL反应液体系65℃保温5min后冰上迅速冷却。

3)按表12配置20μL反应液。

表12、反应液

试剂	使用量
		上述变性后反应液	10μL
5x PrimeScript Buffer	4μL
		RNase Inhibitor(40U/μL)	0.5μL(20units)
PrimerScript RTase(200U/μL)	1μL(200units)
		RNase free dH<sub>2</sub>O	4.5μL(up to 20μL)

4)将上述反转录体系缓慢混匀，42℃下水浴60min，最后95℃金属浴5min使酶 失活。

5)NanoPhotometer(IMPLEN公司)微量分光光度计检测反转录后的cDNA浓度。

二、粘附素Mad2基因的克隆

1、PCR扩增

以步骤一获得的cDNA为模板，利用设计好的扩增Mad2全长的特异性引物Mad2-F和Mad2-R进行PCR扩增，得到PCR产物。

PCR反应体系如表13所示。PCR反应程序如表14所示。

表13、PCR反应体系

反应成分	含量
		Ex Taq	0.25μL
10×Ex Taq Buffer	5μL
		dNTP Mixture	4μL
Mad2-F	2μL
		Mad2-R	2μL
cDNA	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	35.75μL
Total volume	50μL

表14、PCR反应程序

2、PCR产物的电泳检测

将PCR产物取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。其余产物用PCR产物纯化回收试剂 盒(Biomed公司)进行切胶回收，具体步骤如下：

1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)把琼脂糖凝胶块放入紫外仪器中，将单一的目的DNA条带从琼脂凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。

3)向胶块中加入等体积溶液PN(如果凝胶重0.1g，其体积可视为100μL PN溶液)。50℃水浴放置，其间不断温和的上下翻转离心管，确保胶块充分溶解。若有未溶胶块， 继续放置几分钟或再补一些溶胶液，直至完全溶解。

4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)室温放置2min，12000g离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

5)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW(已加无水乙醇)，12000g离心30-60s， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

6)重复步骤5)。

7)将吸附柱CA2放回收集管中，12000g离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱 CA2置于室温放置数分钟，彻底的晾干，以防止残留的漂洗液去影响下一步的实验。

8)将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL 65℃预热的ddH₂O进行洗脱。

9)收集洗脱液，并利用(IMPLEN公司)检测回收DNA浓度和OD_260/280确定DNA提取质量。

10)取2μL回收DNA产物电泳检测确定DNA提取质量，然后储存于-20℃冰箱保存 备用。

3、PCR产物测序

1)经回收纯化的PCR产物与PMD19-T载体(Takara公司)连接，按照表15配置 连接体系。

表15、反应液

2)将连接体系置于16℃连接10h后，转化大肠杆菌感受态Tans1-T1(北京全式 金生物技术有限公司)。具体步骤如下：首先，取一支大肠杆菌感受态Tans1-T1置于 冰上3-5min，待融化后加入上一步的连接体系中，每个体系加入100μL大肠杆菌感受 态Tans1-T1，冰浴15min，然后40℃水浴热激90s，迅速置于冰上静置20min。

3)在转化好的体系中加入800μL的液体LB培养基，水平放入振荡摇床中37℃，200g培养2h。

4)取50μL上述培养的菌液，10μL的IPTG(40mg/mL)，20μL的X-gal(20mg/mL) 均匀涂布在含有氨苄抗性的固体LB培养基上，放入恒温培养箱中，37℃培养12h。

5)蓝白斑筛选挑选阳性转化子，放入1mL液体LB培养基，水平放入振荡摇床中 37℃，200g培养10h。

6)以1μL菌液为模板，用克隆全长基因的体系和程序来进行菌液PCR后，琼脂糖 凝胶电泳检测有无目标条带，取500μL阳性转化子的菌液提取质粒，送公司测序、核 对序列是否正确。剩余菌液加入终浓度20％的丙三醇，-80℃保存。

测序结果表明：利用设计扩增全长特异性引物Mad2-F和Mad2-R，克隆得到了Mad2基因的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，全长为921bp，核苷酸序列如序列 表中的序列1所示，将序列1所示的基因命名为Mad2基因，Mad2基因的电泳检测结 果如图1所示。该基因编码306个氨基酸，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示， 将序列2所示的氨基酸序列命名为Mad2蛋白。该蛋白的理论分子量为31.5KD。

三、重组表达载体的构建

将序列3所示的DNA分子(序列1第1-918位)替换pPIC9K表达载体的EcoR I 和NotI酶切位点间的片段，得到重组表达载体pPIC9K-Mad2。

四、重组菌的构建

1、酵母电转感受态的制作

1)宿主菌GS115的甘油冻存菌划线培养于YPD平板，30℃培养2-3d，挑选单克 隆于50mL YPD培养基中25-28℃培养过夜。

2)次日，待OD长至1.0左右时用无菌的50mL离心管，1600g，5min离心收集菌 体。用30mL左右的无菌ddH₂O重悬，1600g，5min离心收集菌体，重复洗两次。

3)用30mL左右的无菌的1M D-山梨醇重悬，1500g，5min离心收集菌体。用1mL 1MD-山梨醇液体培养基重悬，置于冰上备用。

2、重组质粒线性化及电转

1)按照表16配置线性化体系。

表16、线性化体系

试剂	使用量
		质粒	5μL
10×Buffer	10μL
		SacI	5μL
ddH<sub>2</sub>O	to 100μL

2)线性化后2倍体积无水乙醇沉淀回收，用30μL ddH₂O溶解。

3)取200μL酵母感受态细胞，加入30μL线性化质粒，混合后转入电转杯(d＝0.2cm)中，冰上放置数分钟后，放入电转仪(Eppendorf)中电击(电压：1680V，电击时间： 5ms)，电击后，立刻加入1mL YPD培养基，轻轻吹打数次，将电转后的酵母吸到1.5mL EP管中，冰上放置数分钟。

4)将EP管放到28℃培养箱中孵育1h后涂布于MD平板。48h后观察平板菌落长 势(图2)。

3、PCR筛选阳性克隆

1)从MD平板上各挑取5个单克隆至含有4mL YPD液体培养基的单管之中，28℃ 培养36h。取500μL菌液至1.5mL EP管中，离心收集菌体，使用TIANamp Yeast DNA Kit 酵母基因组DNA提取试剂盒(天根生物技术有限公司)提取酵母菌的基因组。

2)从目的基因序列两段设计引物进行PCR扩增验证，F端引物为cMad2-F，R端 引物为cMad2-R。

3)以酵母菌的基因组为模板，采用cMad2-F和cMad2-R引物进行PCR扩增，PCR 扩增得到大小为959bp(包括Mad2基因序列和载体上41bp的序列)的目的片段的酵 母菌为阳性重组酵母菌。PCR反应体系如表17所示。PCR反应程序如表18所示。

表17、PCR扩增体系

反应成分	含量
		Ex Taq	0.25μL
10×Ex Taq Buffer	5μL
		dNTP Mixture	4μL
cMad2-F	2μL
		cMad2-R	2μL
DNA	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	35.75μL
Total volume	50μL

表18、PCR反应程序

结果如图3所示，通过验证引物的扩增，泳道1-5中的重组酵母菌基因组DNA的 扩增结果均为单一条带，表明已将重组质粒pPIC9K-Mad2转入宿主毕赤酵母中，并将 阳性重组酵母菌用于下述诱导表达实验。

按照上述方法将pPIC9K表达载体转入宿主毕赤酵母，得到空载体菌。

五、重组酵母的诱导表达及发酵液上清纯化

1、重组酵母的诱导表达

1)将筛选得到的阳性菌株进行YPD平板划线生长48h，挑选单菌落，置于有5mLBMGY培养基的试管中，28℃，250-300g培养，直到OD600达到2-6(16-20h)。

2)室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用1mL BMMY培养基重悬菌体，并 混匀。

3)将上述步骤2)所得的菌液置于装有100mL BMMY培养基的500mL锥形瓶中， 放置于28℃，250-300g的摇床上继续生长。

4)每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％，共培养72h。

5)12000g离心10min，分离发酵液上清和沉淀，4℃保存菌液，-20℃冻存菌体。

将发酵液上清浓缩后进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示。结果表明：5号和6 号(泳道5和泳道6)对应阳性克隆菌检测到目的蛋白，并将5、6号表达菌发酵液上 清进行下述镍柱纯化。

2、发酵液上清的纯化

将步骤1收集的发酵液上清进行镍柱纯化，填料类型为Ni-IMAC(必拓生物公司)。用5-10CV的平衡液缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，pH8.0)平衡层析柱，至流出液 电导和PH不变(与平衡也一致)。洗脱液：20mM Tris，500mM NaCl，500mM imidazole， pH8.0。分别使用含有10mM、20mM、30mM、50mM、250mM和500mM imidazole的6种 洗脱液进行洗脱，根据吸收峰值收集洗脱液。SDS-PAGE分别检测酵母发酵上清液、过 柱穿漏液和洗脱液。结果如图5所示，结果表明：在含有50mM imidazole洗脱时可以 检测到大量的目的蛋白Mad2(目的蛋白Mad2的理论分子量大约是31.5KD)。将纯化的 Mad2蛋白用10KD蛋白超滤管(Millipore)离心，浓缩并更换缓冲液为ddH₂O。纯化 后的Mad2蛋白保存在20mM PBS，500mM NaCl，pH7.8。聚丙烯酰胺凝胶配方如表19 所示。

表19、SDS-PAGE电泳凝胶配方

	15％分离胶	10％分离胶	5％浓缩胶
				ddH<sub>2</sub>O	0.6mL	1.4mL	2.8mL
Tris buffer(pH8.8)	1.3mL	1.3mL	1.3mL
				30％Acryl amid	2.5mL	1.7mL	0.8mL
10％SDS	0.05mL	0.05mL	0.05mL
				10％AP(过硫酸铵)	0.05mL	0.05mL	0.05mL
TEMED	0.003mL	0.003mL	0.003mL
				丙三醇	0.5mL	0.5mL	无

3、蛋白的浓缩

将纯化的Mad2蛋白用10KD蛋白超滤管(Millipore)离心，浓缩并更换缓冲液为ddH₂O，得到浓缩后的Mad2蛋白。

实施例2、Mad2蛋白的功能试验

一、试验方法

1、种子消毒处理

将花生种子先进行表面消毒处理，具体方法如下：将种子先在无菌水中浸泡30min，然后用4％的次氯酸钠溶液浸泡2.5h后将溶液倒掉，用无菌水冲洗掉表面，再 用15％过氧化氢溶液浸泡30min后，无菌水冲洗3次，完成种子表面消毒。

2、Mad2蛋白处理

将表面消毒后的花生种子用无菌水浸泡24h催芽，然后于恒温气候箱(25℃，L:D14:10)中培养。取生长一致的花生幼根，浸入20mg/L的Mad2蛋白处理液(溶剂为 ddH₂O)中作为实验组，以ddH₂O为空白对照组，分别置于25℃恒温培养箱(上海智城) 处理24h后，取出幼根并用吸水纸吸干，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃超低温冰 箱备用。

3、免疫相关基因转录水平表达检测

利用RT-qPCR检测实验组和对照组花生根中免疫相关基因及共生相关基因的表达水平。具体步骤如下：分别提取对照组和实验组花生根总RNA，用DNaseⅠ消化残留 DNA，利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA第一链合成试剂盒(Takara公司)合成 cDNA第一条链，并用(IMPLEN公司)检测cDNA浓度后于-80℃冰箱 保存备用。反转录成cDNA，用SYBR Green荧光定量试剂盒(Takara公司)在7500 型(ABI公司)实时荧光定量PCR体系进行候选基因的转录水平分析。使用60s ribosomal protein L7(RPL7)基因为内参基因，为了检测结果更为准确，同一处理 不同的重复进行混样后提取花生根的总RNA。每个处理重复3次，每个重复2株花生。RT-qPCR反应体系如表20所示，RT-qPCR反应程序如表21所示。

表20、RT-qPCR反应体系

反应成分	含量
		SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)	10μL
模板(样本cDNA)	1μL
		Primer F(20μM)	0.4μL
Primer R(20μM)	0.4μL
		ddH<sub>2</sub>O	8.2μL
总体积	20μL

表21、RT-qPCR反应程序

结果如图6所示，结果表明：一方面，与对照组相比，实验组的抗病相关的细胞 膜受体CERK1(几丁质激发子受体激酶1)和BAK1(油菜素类固醇不敏感相关受体激 酶1)，促***原活化蛋白激酶MMK1、MAPK和MAP2K2，钙信号受体钙依赖蛋白激酶CDPK， 抗病相关蛋白PTI1、RML1A以及细胞膜完整性蛋白SCW1的转录水平都受到了抑制。而 另一方面，共生类受体LYK3和RPK，共生相关钙信号传递与钙解码蛋白CAM、CCAMK， 离子转运蛋白ABCC1，铁转移相关蛋白FRI2，氮形成和转移相关蛋白NRT24，脂质形 成相关蛋白LTP1和次生代谢物合生相关的蛋白酶F6H1的表达水平均呈现上调。说明 Mad2蛋白具有生物活性，不仅对寄主花生的免疫反应有一定的抑制作用，并且还激活 了共生相关基因的转录，具有参与绿僵菌与寄主植物共生关系的建立的功能，对于绿 僵菌成功地侵染并且宿存寄主植物有促进作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本 发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>Mad2蛋白质及其相关生物材料在调控植物免疫与共生反应中的应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>921

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgaagtctg tcattgctgt tgcggctatc gccgccgttg cttcggctca cgaggctcgc 60

tccccccttg acctcgacct caacgtcggc aacgtggtca aggtcgagct ctgcctgggt 120

cttcatatca agcttcccgc tggcatctct atcgacactg atgattgccc taaacaaggc 180

cctcctgctg gctgcatcga cgtctggcac cctcctcacc acgttcccat ggacggctgt 240

gacgacaacg acaacgacga gtggcattat gtccaccctt gcgactgcaa gcccgaggct 300

cctcacacct ggaccaccag cactgtcact cagactcagg tcaagaccct catcagctgt 360

gctcctaccg tgaccgactg ccctgctggt cctcacgtca ccactgtggt tgtcccggcc 420

acaacaacca tctgccccgt gccagttcac tctaccacca tggctactgt ccctgccggc 480

aatactctcc ctgctaccgc ccctgctacc atgcccggta ctgttcctgc taccatgccc 540

ggcaccgtcc ccggcaccat gcccggctcg gctcccggta ctgttcccgc cgtcgtgccc 600

ggaaccgccc cgggcactct gcctgctacc gcccctgttg ctacgcaggc accggtttgg 660

accaagcctg ccaatcagtc gatgcctgct actcaggtcc ctccccctgc cattaccaca 720

cctgtcgtcg tggctccttc tcctgccacc acgccttccg aggcctcgtc tcccgcggtc 780

gtcgttctcc ctcccgttgg caccggcgca ccccctactg gcaactggac gacccctcct 840

gtcatggctg gtgccgccca gaacagccag aaggtcggtg ccgttgtcgc catgggcctc 900

atcgccgttc tcctgatcta g 921

<210>2

<211>306

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Lys Ser Val Ile Ala Val Ala Ala Ile Ala Ala Val Ala Ser Ala

1 5 10 15

His Glu Ala Arg Ser Pro Leu Asp Leu Asp Leu Asn Val Gly Asn Val

20 25 30

Val Lys Val Glu Leu Cys Leu Gly Leu His Ile Lys Leu Pro Ala Gly

35 40 45

Ile Ser Ile Asp Thr Asp Asp Cys Pro Lys Gln Gly Pro Pro Ala Gly

50 55 60

Cys Ile Asp Val Trp His Pro Pro His His Val Pro Met Asp Gly Cys

65 70 75 80

Asp Asp Asn Asp Asn Asp Glu Trp His Tyr Val His Pro Cys Asp Cys

85 90 95

Lys Pro Glu Ala Pro His Thr Trp Thr Thr Ser Thr Val Thr Gln Thr

100 105 110

Gln Val Lys Thr Leu Ile Ser Cys Ala Pro Thr Val Thr Asp Cys Pro

115 120 125

Ala Gly Pro His Val Thr Thr Val Val Val Pro Ala Thr Thr Thr Ile

130 135 140

Cys Pro Val Pro Val His Ser Thr Thr Met Ala Thr Val Pro Ala Gly

145 150 155 160

Asn Thr Leu Pro Ala Thr Ala Pro Ala Thr Met Pro Gly Thr Val Pro

165 170 175

Ala Thr Met Pro Gly Thr Val Pro Gly Thr Met Pro Gly Ser Ala Pro

180 185 190

Gly Thr Val Pro Ala Val Val Pro Gly Thr Ala Pro Gly Thr Leu Pro

195 200 205

Ala Thr Ala Pro Val Ala Thr Gln Ala Pro Val Trp Thr Lys Pro Ala

210 215 220

Asn Gln Ser Met Pro Ala Thr Gln Val Pro Pro Pro Ala Ile Thr Thr

225 230 235 240

Pro Val Val Val Ala Pro Ser Pro Ala Thr Thr Pro Ser Glu Ala Ser

245 250 255

Ser Pro Ala Val Val Val Leu Pro Pro Val Gly Thr Gly Ala Pro Pro

260 265 270

Thr Gly Asn Trp Thr Thr Pro Pro Val Met Ala Gly Ala Ala Gln Asn

275 280 285

Ser Gln Lys Val Gly Ala Val Val Ala Met Gly Leu Ile Ala Val Leu

290 295 300

Leu Ile

305

<210>3

<211>918

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

atgaagtctg tcattgctgt tgcggctatc gccgccgttg cttcggctca cgaggctcgc 60

tccccccttg acctcgacct caacgtcggc aacgtggtca aggtcgagct ctgcctgggt 120

cttcatatca agcttcccgc tggcatctct atcgacactg atgattgccc taaacaaggc 180

cctcctgctg gctgcatcga cgtctggcac cctcctcacc acgttcccat ggacggctgt 240

gacgacaacg acaacgacga gtggcattat gtccaccctt gcgactgcaa gcccgaggct 300

cctcacacct ggaccaccag cactgtcact cagactcagg tcaagaccct catcagctgt 360

gctcctaccg tgaccgactg ccctgctggt cctcacgtca ccactgtggt tgtcccggcc 420

acaacaacca tctgccccgt gccagttcac tctaccacca tggctactgt ccctgccggc 480

aatactctcc ctgctaccgc ccctgctacc atgcccggta ctgttcctgc taccatgccc 540

ggcaccgtcc ccggcaccat gcccggctcg gctcccggta ctgttcccgc cgtcgtgccc 600

ggaaccgccc cgggcactct gcctgctacc gcccctgttg ctacgcaggc accggtttgg 660

accaagcctg ccaatcagtc gatgcctgct actcaggtcc ctccccctgc cattaccaca 720

cctgtcgtcg tggctccttc tcctgccacc acgccttccg aggcctcgtc tcccgcggtc 780

gtcgttctcc ctcccgttgg caccggcgca ccccctactg gcaactggac gacccctcct 840

gtcatggctg gtgccgccca gaacagccag aaggtcggtg ccgttgtcgc catgggcctc 900

atcgccgttc tcctgatc 918