阅读说明：本技术 一种鱼鳔胶原低聚肽的提取与制备方法 (Method for extracting and preparing swimming bladder collagen oligopeptide ) 是由 陆晓丹 皮俊飞 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：一种鱼鳔胶原低聚肽的提取与制备方法,具体步骤如下：清洗：选取鱼鳔清洗,破碎成小块后加入氢氧化钠溶液浸泡,水洗至中性后再用5~10%正丁醇或异丙醇溶液浸泡,水洗至中性后进行匀浆,备用；预处理：在匀浆中加入鞣酸,过滤,在碱性环境下加入蛋白酶酶解,过树脂柱；酶解：调节pH,加入0.1~1.0%的复合蛋白酶进行酶解；纯化：包括：膜过滤、纳滤、浓缩、除菌、喷雾干燥。本方案在有效去除鱼腥味的同时,提取工艺简单,且鱼鳔胶原低聚肽得率高、品质佳。(A process for extracting and preparing collagen oligopeptide from fish maw includes such steps as washing fish maw, breaking to become small blocks, immersing in sodium hydroxide solution, immersing in 5 ~ 10% n-butanol or isopropanol solution, washing to become neutral, homogenizing, pre-treating, adding tannic acid, filtering, adding proteinase, enzymolysis, passing through resin column, regulating pH value, adding 0.1-0.1 ~ 1.0.0% compound proteinase, enzymolysis, and purifying.)

一种鱼鳔胶原低聚肽的提取与制备方法

技术领域

本发明属于生物活性成分提取技术领域，具体涉及一种鱼鳔胶原低聚肽的提取与制备方法。

背景技术

活性氧和自由基与人类的许多疾病如癌症、老化、动脉粥样硬化等的发病机理相关，外源性抗氧化剂有助于降低体内自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病。人工合成的抗氧化剂如BHA、BHT、TBHQ、PG虽然抗氧化效果好，但对人体肝、脾、肺有蓄积性致癌作用；近年来，天然抗氧化活性肽因具有较强的活性和很高的安全性，而备受科研工作者的关注，已成为国内外的研究重点。天然抗氧化肽分子质量相对较低，易于被人体消化吸收，可通过减少羟自由基、超氧阴离子自由基、抑制脂质过氧化以及螯合金属离子等达到抗衰老的效果。

胶原蛋白主要存在于动物的骨、腱、软骨和皮肤等***中，是***中胶原蛋白纤维的蛋白质。胶原蛋白在发展历史过程中，其重要的材料来源一直是陆生动物猪和牛，因为它们具有来源丰富的皮和骨。与陆生动物相比，鱼胶原氨基酸组成及含量有共性的一面，又存在显著特殊性，其蛋氨酸含量较陆生动物多而脯氨酸、强脯氨酸含量相对较少；近年来，各类胶原在美容保健、医药卫生、食品领域、组织材料工程及生物材料等中高端领域呈现出良好的应用发展前景，胶原肽作为生物活性肽，是介于蛋白质和氨基酸之间的分子聚合物，通常将由2~10个氨基酸构成氨基酸构成的胶原肽成为胶原低聚肽，其分子量为1000Da以下，由10~100个氨基酸构成的成为胶原多肽。

鱼加工过程中产生大约40%的副产物，研究表明，水产品尤其是鱼类加工副产物可制备具有抗氧化活性的胶原肽，目前国内外研究者已从鱼皮、鱼鳞、鱼骨等副产物中制备除抗氧化胶原肽，如申请号CN108823269A的文件公开了一种鱼胶原低聚肽的制备方法，具有投入低、操作简单、胶原蛋白降解效果好、胶原低聚肽得率高、感官接受度较高的优势。但作为副产物之一的鱼鳔很少被利用或加工，大部分被当做废弃物丢弃，造成大量的资源浪费；鱼鳔富含胶质，胶原蛋白高达80%以上，可作为良好、丰富的胶原蛋白提取资源，如申请号CN105219827A的文件公开了一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，具体包括清洗、酶解、纯化等步骤经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作为目标肽氨基酸序列，但该方法对设备要求高，操作复杂，不适于大规模生产。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的是提供一种鱼鳔胶原低聚肽的提取与制备方法，在有效去除鱼腥味的同时，提取工艺简单，且鱼鳔胶原低聚肽得率高、品质佳。

一种鱼鳔胶原低聚肽的提取与制备方法，包括以下生产工艺：

清洗——预处理——酶解——纯化。

具体步骤如下：

清洗：选取鱼鳔清洗，破碎成小块后加入氢氧化钠溶液浸泡，水洗至中性后再用5~10%正丁醇或异丙醇溶液浸泡，水洗至中性后进行匀浆，备用；

预处理：在匀浆中加入鞣酸，过滤，在碱性环境下加入蛋白酶酶解，过树脂柱；

酶解：调节pH，加入0.1~1.0%的复合蛋白酶进行酶解；

纯化：包括：膜过滤、纳滤、浓缩、除菌、喷雾干燥。

进一步地，氢氧化钠溶液浓度范围为0.10~0.12M，鱼鳔与氢氧化钠溶液的料液比为1:4~8（w/v），鱼鳔与正丁醇或异丙醇溶液的料液比为1:4~6（w/v），鱼鳔胶原低聚肽在制备前因其中含有较多杂蛋白及脂肪，所以经氢氧化钠正丁醇或异丙醇溶液进行清洗处理可去除这些杂蛋白、脂肪等，减少此类物质对制备鱼鳔胶原低聚肽的影响。

进一步地，预处理步骤中的蛋白酶为胰蛋白酶，pH范围为为：7.8~8.5，树脂柱为过聚酰胺树脂柱；鱼鳔的腥味较重，而预处理中的鞣酸对腥味具有极佳的收敛作用，可大大减少鱼腥味；同时，鞣酸可与匀浆中的蛋白质进行充分反应形成不溶性复合物沉淀，匀浆中的蛋白质全部反应成不溶性复合物后，通过过滤的方式即可提取出来，大大降低了提取的难度，缩短了提取的时间，且该不溶性复合物在碱性条件下经胰蛋白酶酶解后可重新酶解成蛋白质和鞣酸，此时液体过对鞣酸具有很好吸附效果而对蛋白质吸附力很小的过聚酰胺树脂柱，鞣酸即被去除掉，不会对后续工艺产生影响，且鞣酸在工艺处理过程还具有抑菌的作用。

优选地，鞣酸的添加量为0.1~1.5%。

进一步地，酶处理过程中复合蛋白酶为木瓜酶、胰蛋白酶、胶原酶、碱性蛋白酶中的一种及多种，酶解时间5~7h，不同蛋白酶作用于蛋白质肽链上的位点不同，造成了酶解程度不同和多肽的组成不同，通过不同蛋白酶复合酶解可使得酶解效果更彻底、更充分，收益更好。

进一步地，所述膜过滤压力0.15~0.20MPa；所述纳滤工作压力为1.0~1.4MPa。

进一步地，所述喷雾干燥的进料压力为3.8~4.2MPa，出风温度82~86℃。

本发明的有益效果如下：

本方案设计，通过在预处理过程中加入鞣酸，一是可以去除鱼鳔带有的鱼腥味，二是简化了鱼鳔匀浆中蛋白质的提取工艺，缩短了提取时间，三是胰蛋白酶配合过聚酰胺树脂柱可有效还原蛋白质和去除鞣酸，鱼鳔胶原低聚肽的得率不会产生影响，通过本方案设计中的工艺处理得到的鱼鳔胶原低聚肽得率高、品质佳。

具体实施方式

实施例1

一种鱼鳔胶原低聚肽的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）清洗：选取鱼鳔进行清洗，破碎成小块后按料液比1:4的比例加入0.1M的氢氧化钠溶液，浸泡并不断搅动，2h后用流动水洗至中性，再按料液比1:4的比例加入5%异丙醇溶液浸泡，12h后用蒸馏水反复清洗至中性后充分沥干，再按料液比1:4的比例加入去离子水，匀浆，备用；

（2）预处理：向匀浆中加入质量分数为0.5%的鞣酸，搅拌45min后过滤，向得到的沉淀物中加入3倍体积的去离子水，用氢氧化钠调节pH范围在7.8~8.5范围内，按加酶量为0.05%加入胰蛋白酶，沉淀消失后升温灭酶，200目筛过滤，滤液过过聚酰胺树脂柱，收集过柱后的液体A；

（3）酶处理：调节pH为8.0，温度37℃，按加酶量为0.1%向液体A中加入复合蛋白酶（胶原酶：胰蛋白酶=2:1），酶解3h后升温灭酶；

（4）膜过滤：过滤压力控制在0.15MPa，流速控制在1L/min；

（5）纳滤：纳滤工作压力控制在1.2MPa，物料浓缩至20%停止纳滤；

（6）浓缩：真空降膜浓缩，温度控制在30℃，真空度控制在-0.06MPa，浓缩至浓度为35%出料；

（7）除菌过滤：经过0.22μm的除菌膜低温除菌保证产品的微生物指标；

（8）喷雾干燥：将除菌过滤后的产品进行喷雾干燥，进料压力3.0MPa，喷雾干燥出风温度84℃。

实施例2

一种鱼鳔胶原低聚肽的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）清洗：选取鱼鳔进行清洗，破碎成小块后按料液比1:6的比例加入0.1M的氢氧化钠溶液，浸泡并不断搅动，2h后用流动水洗至中性，再按料液比1:4的比例加入5%异丙醇溶液浸泡，12h后用蒸馏水反复清洗至中性后充分沥干，再按料液比1:5的比例加入去离子水，匀浆，备用；

（2）预处理：向匀浆中加入质量分数为0.2%的鞣酸，搅拌35min后过滤，向得到的沉淀物中加入3倍体积的去离子水，用氢氧化钠调节pH范围在7.8~8.5范围内，按加酶量为0.01%加入胰蛋白酶，沉淀消失后升温灭酶，200目筛过滤，滤液过过聚酰胺树脂柱，收集过柱后的液体A；

（3）酶处理：调节pH为7.8，温度37℃，按加酶量为0.1%向液体A中加入复合蛋白酶（碱性蛋白酶：胰蛋白酶=1:1），酶解4h后升温灭酶；

（4）膜过滤：过滤压力控制在0.18MPa，流速控制在1.5L/min；

（5）纳滤：纳滤工作压力控制在1.4MPa，纳滤膜截留分子量为1KDa，物料浓缩至20%停止纳滤；

（6）浓缩：真空降膜浓缩，温度控制在30℃，真空度控制在-0.06MPa，浓缩至浓度为35%出料；

（7）除菌过滤：经过0.22μm的除菌膜低温除菌保证产品的微生物指标；

（8）喷雾干燥：将除菌过滤后的产品进行喷雾干燥，进料压力3.5MPa，喷雾干燥出风温度82℃。

实施例3

一种鱼鳔胶原低聚肽的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）清洗：选取鱼鳔进行清洗，破碎成小块后按料液比1:8的比例加入0.1M的氢氧化钠溶液，浸泡并不断搅动，2h后用流动水洗至中性，再按料液比1:4的比例加入5%异丙醇溶液浸泡，12h后用蒸馏水反复清洗至中性后充分沥干，再按料液比1:6的比例加入去离子水，匀浆，备用；

（2）预处理：向匀浆中加入质量分数为0.6%的鞣酸，搅拌50min后过滤，向得到的沉淀物中加入3倍体积的去离子水，用氢氧化钠调节pH范围在7.8~8.5范围内，按加酶量为0.08%加入胰蛋白酶，沉淀消失后升温灭酶，200目筛过滤，滤液过过聚酰胺树脂柱，收集过柱后的液体A；

（3）酶处理：调节pH为8.0，温度37℃，按加酶量为0.1%向液体A中加入复合蛋白酶（木瓜酶：胶原蛋白酶=1:1.5），酶解5h后升温灭酶；

（4）膜过滤：过滤压力控制在0.20MPa，流速控制在1.8L/min；

（5）纳滤：纳滤工作压力控制在1.0MPa，物料浓缩至20%停止纳滤；

（6）浓缩：真空降膜浓缩，温度控制在30℃，真空度控制在-0.06MPa，浓缩至浓度为35%出料；

（7）除菌过滤：经过0.22μm的除菌膜低温除菌保证产品的微生物指标；

（8）喷雾干燥：将除菌过滤后的产品进行喷雾干燥，进料压力4.0MPa，喷雾干燥出风温度86℃。

设置对比例1，与实施例1的不同之处在于，不进行步骤（2）的处理；

设置对比例2，采用CN108823269A文件采用的方法制备得到。

对实施例1~3和对比例1、2采用海洋鱼低聚肽粉GB/T22729-2008中所规定的标准及检测方法检测鱼胶原低聚肽的分子量进行检测及评价，结果见表1：

表1.测定结果

由表1可知，采用本方法制备得到的鱼鳔胶原低聚肽，其分子量小于1000Da的比例在94.5~96.2%左右，与对比例2相差不多，说明鞣酸的加入不会影响鱼鳔胶原低聚肽的得率，对比例1的得率较低，原因是不加预处理后经过相同的工艺处理，反应时间不够，造成鱼鳔胶原低聚肽的得率低，证明加入预处理步骤可简化提取工艺、缩短提取时间。

观感上本实施例1~3制备的鱼鳔胶原低聚肽的鱼腥味相比对比例1、2制备的鱼胶原低聚肽几乎不可闻，证明鞣酸的加入可有效收敛鱼腥味。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。