阅读说明：本技术 一种利用雾培和固相萃取技术高效收集纯化向日葵列当萌发刺激物的方法 (Method for efficiently collecting and purifying broomrape herb germination stimulators by using aeroponics and solid-phase extraction technology ) 是由 胡露飏 周伟军 杨翀 许玲 章娜 王建蘇 朱金文 白全江 云晓鹏 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用雾培和固相萃取技术高效收集纯化向日葵列当萌发刺激物的方法,该方法包括：取向日葵种子,萌发后,将向日葵幼苗定植于雾培装置中,利用雾培体系培育向日葵幼苗；在雾培阶段,先采用含磷的雾培营养液培育向日葵幼苗,培育20～25天后,再更换为无磷的雾培营养液进行饥饿培养处理,饥饿培养处理的时间为5～7天；将雾培装置中的所有营养液通过固相萃取小柱,进行固相萃取,得到向日葵列当萌发刺激物。本发明先利用雾培体系技术快速培育化向日葵,再结合固相萃取技术分离、纯化向日葵根系分泌物中的向日葵列当萌发刺激物,得到的向日葵列当萌发刺激物不仅种类多,而且浓度和纯度高。(The invention discloses a method for efficiently collecting and purifying a broomrape herb germination stimulant by utilizing an aeroponics and solid-phase extraction technology, which comprises the following steps: taking sunflower seeds, germinating, planting sunflower seedlings in an aeroponics device, and culturing the sunflower seedlings by using an aeroponics system; in the aeroponics stage, firstly, cultivating sunflower seedlings by adopting phosphorus-containing aeroponics nutrient solution, and after cultivating for 20-25 days, replacing the seedlings with phosphorus-free aeroponics nutrient solution for starvation cultivation treatment, wherein the time for starvation cultivation treatment is 5-7 days; and (3) passing all nutrient solution in the aeroponics device through a solid phase extraction column for solid phase extraction to obtain the broomrape germination stimulant. The invention firstly utilizes the aeroponic system technology to rapidly cultivate sunflower, and then combines the solid phase extraction technology to separate and purify the broomrape germination stimulant in the sunflower root secretion, and the obtained broomrape germination stimulant has multiple types, high concentration and high purity.)

一种利用雾培和固相萃取技术高效收集纯化向日葵列当萌发 刺激物的方法

技术领域

本发明涉及植物栽培技术和生物化学技术领域，尤其涉及一种利用雾培和固相萃取技术高效收集纯化向日葵列当萌发刺激物的方法。

背景技术

向日葵是世界上重要的油料作物之一，也是我国的主要油料作物之一，因其经济价值高、易于管理、成本低、效益高、耐盐碱力强等特点，使其在我国的东北和西北地区广泛种植，其中内蒙古自治区是我国最大的向日葵生产区，其次是新疆。近年来，随着向日葵产量的增加，向日葵生产地区出现了寄生杂草向日葵列当(Orobanchecumana)严重危害向日葵产量的情况，防控杂草刻不容缓。

寄生植物是指由于根系或叶片退化或缺乏足够的叶绿素而必须从寄主植物中掠夺某些营养物质和水分等以满足自身生长发育需求的一类植物。寄生植物约占被子植物1％，与典型的植物自养生活方式截然不同，它们以异养的方式获得有机碳源，利用被称为吸器的特殊器官与寄主植物的根或茎中的维管组织直接相连。寄生植物根据对寄主的依赖程度，主要可分为两类：一类是没有叶片或叶片退化成鳞片状，不能进行正常的光合作用，自身所需的养料完全来自于寄主，称为全寄生植物，例如菟丝子(Cusutachinensis)和列当(Orobanche spp.)等；另一类含有叶绿素，并且能进行正常的光合作用，但是根多退化，导管直接与寄主植物相连，从寄主植物内吸收水分和无机盐，称为半寄生植物，例如独脚金(Striga asiatica)、桑寄生(Scurrulaparasitica)和槲寄生(Viscum coloratum)等。

向日葵列当(Orobanche cumana)是一种全寄生植物，通过吸器寄生于向日葵根上。一株成熟的向日葵列当可以产生数量惊人的粉尘状种子，从5万粒到50万粒不等，这些种子可以在土壤中保持长达10年的活力，从而增加它们找到寄主的可能性。向日葵列当是目前世界上向日葵产量最大的限制因素之一，其危害范围主要在欧洲和亚洲，特别是在西班牙、法国、土耳其、俄罗斯、乌克兰、以色列、哈萨克斯坦和中国。在欧洲以及南北美洲，向日葵种植品种以油用向日葵为主，而在中国，向日葵的种植品种主要以食用型向日葵为主(食葵)。

目前，防除列当主要通过培育抗性育种、化学防治，生物防治，利用诱捕作物轮作倒茬，人工机械除草等方法。选育抗性品种是经济有效的防控措施，但是抗性育种往往进展缓慢，而且抗源在油葵中广泛存在，但在食葵品种中却很少，而且列当的进化速度较快，增加了育种难度。化学除草主要针对列当的地上部，不能长效控制列当，而且可能影响后茬作物生长，对环境造成危害，防除效果并不理想。生物防治是指利用拮抗微生物如真菌灰黄青霉和放线菌密旋链霉菌等抑制列当萌发。人工机械除草只对首次侵染地区有效。

诱捕作物是指作物的根系能够分泌刺激列当种子萌发的物质，但不会被列当寄生，本身可以正常收获的农作物。由于列当种子微小，自身储藏的营养物质极其有限，如果其萌发后不能在几天之内寄生到寄主根部，那么它们会在有限的营养耗尽后死去，这种现象叫做“***萌发”。轮作可改善土壤理化性质，降低土传真菌群落，是一种有效减轻植物病虫害的耕作制度。已有研究表明亚麻、大豆、小麦、水稻和玉米可刺激向日葵列当种子萌发。许多试验表明寄主植物与诱捕作物轮作，可减少寄生杂草量并提高寄主作物产量。

现研究已发现寄生植物种子的萌发需要特殊的化学物质刺激，如独脚金内酯(strigolcatones)。但目前还未在向日葵的根系分泌物中发现具有活性的独脚金内酯。第一次从向日葵根系分泌物提取的向日葵列当萌发刺激物被鉴定为去氢木香内酯(dehydrocostus lactone)，属于一种倍半萜内酯。随后研究发现了向日葵根系分泌物中的木香烃内酯(costunolide)，tomentosin和8-epixanthatin都可在纳摩尔和微摩尔浓度级别刺激向日葵列当种子萌发。这些萌发刺激物的活性浓度都极低，故高效提纯这些物质在分析化学中极为重要。雾培技术可以快速繁殖植物，经济、高效，是理想的实验体系。但是，利用该技术收集纯化寄生植物萌发刺激物的研究未见报道。

目前，对向日葵列当的萌发刺激物的种类以及机制缺乏深入了解，同时缺乏相应的高效提取纯化浓缩方法，本方法目的在于利用雾培体系技术收集列当萌发刺激物，结合固相萃取技术预处理列当萌发刺激物的样品，以便进行后期的超高效液相色谱分析其中的寄生植物的萌发刺激物组分，为深入研究寄生植物萌发刺激物的机制做铺垫。

发明内容

本发明的目的在于通过利用雾培和固相萃取技术高效收集纯化向日葵列当萌发刺激物的方法，解决现有技术中提取纯化的向日葵列当萌发刺激物种类少、浓度和纯度低的问题。

具体技术方案如下：

一种利用雾培和固相萃取技术高效收集纯化向日葵列当萌发刺激物的方法，包括以下步骤：

(1)取向日葵种子，萌发后，将向日葵幼苗定植于雾培装置中，利用雾培体系培育向日葵幼苗；

在雾培阶段，先采用含磷的雾培营养液培育向日葵幼苗，培育20～25天后，再更换为无磷的雾培营养液进行饥饿培养处理，饥饿培养处理的时间为5～7天；

(2)将雾培装置中的所有营养液通过固相萃取小柱，进行固相萃取，得到向日葵列当萌发刺激物。

本发明首次提出先利用雾培体系技术快速培育化向日葵，再结合固相萃取技术分离、纯化向日葵根系分泌物中的向日葵列当萌发刺激物，得到的向日葵列当萌发刺激物不仅种类多，而且浓度和纯度高。雾培体系技术能够减少环境因素的干扰，使实验环境趋于均一化，省时、省力，固相萃取技术与传统的液液萃取法相比可以提高分析物的回收率，更有效的将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力，显著提高分析分泌物纯度和浓度。

由于向日葵列当是近年来向日葵产量的最大限制因素，严重降低向日葵种植产量和质量，深入研究向日葵列当萌发刺激物，以诱导其***式萌发，明确萌发机制，对防治这种寄生性杂草具有重要意义。

本发明在种子处理和萌发后，利用雾培体系培育幼苗，并用改良无磷霍格兰氏营养液对幼株进行饥饿处理，能够诱导植物根系分泌更多萌发刺激物。

本发明根据向日葵幼苗的发芽生长过程，合理设计操作步骤，具体为：向日葵幼苗一般需要3-4周才能长出大量成熟根系，产生较多的列当萌发刺激物，当向日葵处于6叶期时，与在田间列当开始萌发并寄生于向日葵根部的时间大致吻合。为此，本发明先采用含磷的雾培营养液培育向日葵幼苗，培育20～25天后，再更换为无磷的雾培营养液进行饥饿培养处理。

萌发培养分两个阶段，第一阶段：用无菌水湿润滤纸，将消毒过的种子放于培养皿内的滤纸上，用锡箔包裹培养皿，置于28摄氏度24小时。第二阶段：将种子的黑色外壳去掉，将种子的薄膜状内种皮剥去，放入无菌岩棉中，胚根朝下，用营养液湿润岩棉。将种子内种皮剥去为了让实验幼苗均一，让幼苗在一致的条件下生长，控制实验变量趋于一致。

进一步地，所述雾培装置包括喷雾器、栽培桶和循环定时控制器；

所述喷雾器设置于栽培桶的底部，栽培桶的内部盛装有液面高度低于向日葵幼苗根系底端的雾培营养液，栽培桶的顶部设有带定植孔的承载盖以及设于定植孔下方的定植架。

进一步地，所述循环定时控制器的设定程序为：循环喷液，喷液的时间间隔设为15～20min，每次喷液20～30s。

进一步地，雾培阶段，培育向日葵幼苗的条件为：在温室或室内培养箱内培养，光照周期为16h光培养/8h暗培养，昼夜温度分别为25℃和20℃。

进一步地，步骤(1)中，所述含磷的雾培营养液为改良的1/2霍格兰营养液，其配方为：以质量浓度计，硝酸铵430～450mg/L，磷酸氢二钾90～100mg/L，硫酸镁180～200mg/L，硫酸钾130～140mg/L，硫酸铁50～60mg/L，乙二胺四乙酸二钠二水合物60～70mg/L，氯化钙220～240mg/L，微量元素硼酸1.3～1.5mg/L，四水氯化锰0.80～0.90mg/L，五水硫酸铜0.070～0.080mg/L，氯化锌0.10～0.30mg/L，二水钼酸钠0.020～0.030mg/L；

所述无磷的雾培营养液为无磷1/2霍格兰营养液，其配方为：以质量浓度计，硝酸铵430～450mg/L，硝酸钾75.0～85.0mg/L，硫酸镁180～200mg/L，硫酸钾130～140mg/L，硫酸铁50～60mg/L，乙二胺四乙酸二钠二水合物60～70mg/L，氯化钙220～240mg/L，微量元素硼酸1.3～1.5mg/L，四水氯化锰0.80～0.90mg/L，五水硫酸铜0.070～0.080mg/L，氯化锌0.10～0.30mg/L，二水钼酸钠0.020～0.030mg/L。

进一步地，步骤(2)中，将固相萃取小柱与水泵连通，并一同浸没于栽培桶内的雾培营养液中，进行固相萃取。

进一步地，步骤(2)中，所述固相萃取小柱为C18反相萃取柱。

进一步地，所述固相萃取的步骤如下：

(a)依次采用甲醇和水活化C18反相萃取柱，得到活化后的C18反相萃取柱；

(b)将C18反相萃取柱与水泵连通，并一同浸没于栽培桶内的雾培营养液中，先启动水泵，让栽培桶内的雾培营养液进入到固相萃取小柱内，收集向日葵列当萌发刺激物，再依次进行上样、淋洗和洗脱，洗脱剂为丙酮，得到向日葵列当萌发刺激物粗品；

(c)依次采用乙酸乙酯和正己烷活化硅胶柱，得到活化后的硅胶柱；

(d)将步骤(b)获得的向日葵列当萌发刺激物粗品溶解于体积比为1:80～100的乙酸乙酯和正己烷的混合液中，过硅胶柱后，再采用依次正己烷和体积比为1:8～9的正己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱硅胶柱，离心浓缩后，得到向日葵列当萌发刺激物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明先利用雾培体系技术快速培育化向日葵，再结合固相萃取技术分离、纯化向日葵根系分泌物中的向日葵列当萌发刺激物，得到的向日葵列当萌发刺激物不仅种类多，而且浓度和纯度高。

(2)本发明利用雾培技术快速高效的特点，建立雾培体系，对植物进行无磷营养液饥饿处理，结合固相萃取技术，优化了从寄主植物根系分泌物中提取纯化向日葵列当萌发刺激物的方法，省时省力，可循环利用，得到的萌发刺激物浓度更高更纯，进行后续质谱分析以及相关研究。

附图说明

图1为实施例1中不同向日葵品种的列当萌发刺激物去氢木香内酯(dehydrocostus lactone)单位植株的浓度比较。

图2为实施例1中不同向日葵品种的列当萌发刺激物木香烃内酯(costunolide)单位植株的浓度比较。

图3为实施例1中不同向日葵品种的列当萌发刺激物8-epixanthatin单位植株的峰面积比较。

图4为实施例1中不同向日葵品种的列当萌发刺激物heliolactone单位植株的峰面积比较。

图5为实施例1中不同向日葵品种的列当萌发刺激物去氢木香内酯(dehydrocostus lactone)单位根部鲜重含量比较。

图6为实施例1中不同向日葵品种的列当萌发刺激物木香烃内酯(costunolide)单位根部鲜重含量比较。

图7为实施例1中不同向日葵品种的列当萌发刺激物8-epixanthatin单位根部鲜重峰面积比较。

图8为实施例1中不同向日葵品种的列当萌发刺激物heliolactone单位根部鲜重峰面积比较。

图9为实施例1中雾培体系的实物图；

A为植物栽培系统之塑料培养桶的8孔定植盖；B为底部镂空的定植篮，内装岩棉，向日葵根系从定植篮底部延伸伸展；C为无土栽培体系的示意图。

图10为实施例1中固相萃取装置的实物图。

图11为实施例1中本发明方法流程示意图。

图12为比较例1中常规水培体系下不同向日葵品种的列当萌发刺激物去氢木香内酯(dehydrocostus lactone)单位植株的浓度比较。

图13为比较例1中常规水培体系下不同向日葵品种的列当萌发刺激物木香烃内酯(costunolide)单位植株的浓度比较。

图14为比较例1中常规水培体系下不同向日葵品种的列当萌发刺激物8-epixanthatin单位植株的峰面积比较。

图15为比较例1中常规水培体系下不同向日葵品种的列当萌发刺激物heliolactone单位植株的峰面积比较。

图16为比较例1中常规水培体系下不同向日葵品种的列当萌发刺激物去氢木香内酯(dehydrocostus lactone)单位根部鲜重含量比较。

图17为比较例1中常规水培体系下不同向日葵品种的列当萌发刺激物木香烃内酯(costunolide)单位根部鲜重含量比较。

图18为比较例1中常规水培体系下不同向日葵品种的列当萌发刺激物8-epixanthatin单位根部鲜重峰面积比较。

图19为比较例1中常规水培体系下不同向日葵品种的列当萌发刺激物heliolactone单位根部鲜重峰面积比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

一、试验方法

(1)种子准备和处理

根据种子的萌发率(提前进行发芽率测试)计算所需的种子用量。本次实验选择4个向日葵品种(genotye)，每个品种有24个重复，共需要96棵植株，每个品种预先准备约100颗向日葵种子。

(2)营养液配置

向日葵植物培养液用改良1/2霍格兰氏营养液(half strength Hoagland’ssolution)。改良1/2霍格兰溶液的配置见表格，最终pH值为5.8。营养液的容量体积根据实验情况而定，本实验先配置营养液的浓缩液，装瓶备用，随后稀释使用。如用25L体积容量的塑料桶。

表1改良1/2霍格兰氏营养液(half strength Hoagland’s solution)浓缩母液配置表

溶质成分	有磷1000X g/100ml	无磷1000X g/100ml
			硝酸铵NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>	44.8	44.8
硝酸钾KNO<sub>3</sub>	/	8.08
			磷酸氢二钾K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	9.85	/
硫酸镁MgSO<sub>4</sub>	19.7	19.7
			硫酸钾K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	13.94	13.94
硫酸铁FeSO<sub>4</sub>	5.75	5.75
			乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA-Na<sub>2</sub>)	6.6	6.6
氯化钙CaCl<sub>2</sub>	23.5	23.5
			微量元素1000X	/	/

表2.改良1/2霍格兰氏营养液(half strength Hoagland’s solution)微量元素配置表

(3)幼苗发芽

种子消毒处理：先用1％氯漂白剂处理种子5分钟，再用无菌蒸馏水漂洗种子5次。根据不同植物而定，可以自由选择常用的消毒溶液。种子的消毒处理是非常重要的步骤，会影响到后续的实验，因此消毒时间可适当延长。

种子萌发：将一层玻璃纤维滤纸放于直径为100mm的培养皿内，用无菌水湿润滤纸，将种子均匀分散放置于湿润的滤纸上，用封口膜(美国parafilm公司)封口，以防水分丧失，外部用锡箔纸包裹覆盖以保持完全黑暗。置于28摄氏度一天即24小时(时间根据不同植物不同品种萌发条件而定)。

种子发芽：先将种子的外种子剥去，用手指或者镊子小心剥除种子的薄膜状内种皮，这样做是为了让实验幼苗有均一性，让幼苗在一致的条件下生长，否则每个幼苗的生长速度很可能会很不一样，从而影响实验结果。将种子小心放入装有方块状无菌岩棉中，胚根朝下，用改良1/2霍格兰营养液浇灌湿润岩棉。培养条件为温室或室内培养箱，光照周期16/8h,昼夜温度25/20℃，培养2-3天，至向日葵胚根显露。

(4)雾培体系构建

植物雾培体系组成：喷雾系统，栽培系统，循环控制器，营养液。相关产品可在淘宝等购物平台购买。

其中，喷雾系统由高压喷雾泵，喷雾循环水管、喷雾支撑架、喷雾头等组成。栽培系统由塑料栽培桶，8定植孔承载盖、雾培定植杯/定植篮等组成。循环控制器用于营养液定时循环喷雾。营养液根据不同植物而异。

本次实验使用塑料栽培桶容积20L，桶直径30厘米，高39厘米。8定植孔承载盖上有八个定植孔，中间一个大孔用于穿过连接电源设备的导线。

雾培定植杯/定植篮网眼密布，便于水培植物生根，深度足够，便于固定植株。

栽培系统专用黑色塑料水桶的清洗，依次用自来水，乙醇，除盐水(demi water)清洗水桶，晾干备用。

塑料黑色镂空定植篮/定植杯的准备，注意定植篮的底部必须是空的，可以手工用剪刀减掉底部，以便植物根系的良好伸展。准备无菌的岩棉，预先高温高压灭菌。岩棉的尺寸根据定植篮的大小剪裁，或者购买相应的尺寸。将岩棉放进底部镂空的定植篮内。准备黑色的布料，裁剪成岩棉的尺寸，稍微小一点即可，裁剪成中空的形状。标签准备，每个桶对应相应的数字，如本次实验有12个桶，依次给每个桶贴上标签1,2，3……，12。

(5)幼苗移植

每个向日葵品种分别移栽到三个桶内，每个桶有8个重复即8株幼苗。一共4个品种随机移栽到12个桶内。

随机将每个品种空间分散是因为温室内部的光照可能是不均匀的，以及其他因素可能会影响实验结果，为了得到更科学合理的数据，防止特异性结果出现，将每个桶即品种空间随机分布更合理。温室温度设定至22℃(温度设定根据培养植物不同而异)。将每株幼苗移栽到装有岩棉的定植篮内，最后用中空的黑布盖在岩棉上，黑布是为了防止藻类等的生长。给每个桶都标注上向日葵品种的序号。

(6)雾培体系设定

准备12个带盖的黑色苏联水桶，每个桶内倒入2L植物营养培养液，放置喷雾器，连接无刷直流水泵(BRUSHLESS DC PUMP,12V,4.2W)，调节循环定时控制器。本次实验使用4个计时控制器，第一个控制器设定30秒喷水时间，第二个定时器设定20秒喷水时间，第三个定时器设定20秒喷水时间，第四个定时器设定20秒喷水时间，每个定时控制器的喷水间隔时间为5秒，设定一个大循环延迟时间为15分钟。

日常管理：开启半个小时后检查喷雾器是否运行良好。平时基本上很少需要管理，隔几天查看栽培桶内营养液运行雾培体系。每天观察记录植物的生长情况，根据向日葵长势确定采集列当萌发刺激物的时间。

(7)定期更换改良霍格兰营养液。

(8)本次实验采集移栽28天后的根系分泌物。采集后用电子天平记录每个桶内植物的根系新鲜重量。

(9)培育21天后，更换用无磷的1/2改良霍格兰营养液，进行饥饿处理一周时间。营养液配置请见表1和表2。

培育26天后，收集列当萌发刺激物，采用固相萃取方法(Solid-PhaseExtraction，简称SPE)，相关操作在通风橱内进行。

①萃取柱的活化：将固相萃取小柱(色谱科/SupelcoDSC-18萃取小柱(6ml)放入固相真空萃取装置(SUPELCO Visiprep 24^TM DL)，打开真空萃取装置开关，往每个萃取小柱倒入6ml甲醇，等到小柱内的甲醇抽空之后，倒入6ml超纯水(MillQ)，等到小柱的超纯抽空，将所有萃取小柱压入装满无菌蒸馏水的大桶内，确保所有的固相萃取小柱都浸在水中。用甲醇湿润活化小柱是为了分析物能与固相表面紧密接触，易于发生吸附作用，并除去小柱内的杂质，减少污染。选择用蒸馏水是因为根系分泌物溶液pH值与水接近，使得样品溶液与吸附剂表面良好接触，提高萃取效率。

②样品收集：准备无刷直流水泵、电线设备。选择一个装满水的固相提取小柱，用拇指堵住柱口，确保没有空气进入柱子内部。将萃取柱子和无刷直流水泵连接，放入桶内。等到水开始从萃取小柱柱体内冒泡，说明设备运行良好。依次将12个小柱分别放入桶内。48小时后，准备装满超纯水的瓶子。关闭电源，将每个水桶内的固相提取小柱小心取出，立即放入装满水的瓶子中。

③上样和淋洗：将装满样品的固相萃取小柱放入固相真空提取装置中，打开电源，至小柱内的根系分泌物溶液抽空后，用超纯水(MillQ)淋洗，重复淋洗三次。

④洗脱：用2ml丙酮(acetone)作为洗脱剂，洗脱液用玻璃小管接收。换上新的玻璃小管，再次用2ml丙酮洗脱，洗脱液用玻璃小管接收。每个桶的根系分泌物溶液收集两次，一共12个桶，本次实验一共收集24个玻璃小管。可以将玻璃小瓶保存于-20℃冰箱。

(10)纯化样品

①取出上述步骤后保存于-20℃冰箱的2ml样品。

②每个瓶内加入200ul内标物，([email protected] mol/mL)，放入真空离心蒸发浓缩仪，直至水分消失，样品完全干燥。

③在每个干燥样品中加入37.5ul乙酸乙酯和3ml正己烷溶解样品，活化硅胶柱(silica column，200mg/3ml)，加入2ml乙酸乙酯直至完全流出小柱，随后加入4ml正己烷直至完全流出。

④将同一品种收集的两个2ml样品，即4ml样品一起加入活化了的硅胶小柱，等待4ml样品溶液全部流出小柱。

⑤淋洗：加入2ml 100％正己烷直至全部流出。

⑥收集:加入2ml的10:90(正己烷：乙酸乙酯)以进行LC/MS质谱分析，放入在真空离心蒸发浓缩仪干燥，加入200ul的25％氰化甲烷(acetonitrile)，在LC/MS专用分析瓶中用注射过滤器(Sartoriussyringe filters)过滤。

⑦用高效液相色谱仪和三重四极质谱法联合(UHPLC-TQ-MS)分离检测列当萌发刺激物的组分。

向日葵根系分泌物中列当萌发刺激物的鉴定使用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)法，使用微质量串联质谱仪(Micromass Quattro Premier XE tandem massspectrometer)(Waters,USA)进行分析，该质谱仪配备电喷雾电离源(ESI)，并与超高液相色谱系统联合。色谱条件：使用超高液相色谱C18柱(100×2.1毫米,1.7μm)，流动相为水-甲醇。

梯度洗脱过程：30％甲醇1分钟，80％甲醇的梯度转变5分钟，保持1分钟后以0.2分钟梯度回到30％甲醇。该柱在此溶剂组合物中平衡1.8分钟，然后进行下一次运行。每一运行约9分钟。柱温50℃，流速为0.4ml/min，进样量为30μl。

质谱条件：电喷雾离子源ESI，采用正离子扫描方式，雾化器和脱溶气体流速分别为50|h-1和800|h-1。毛细管电压2.7kV，萃取锥管电压20V，源温120℃，脱溶气体温度450℃。采用3.0×10-3mbar氩气碰撞诱导离解破碎。对每个化合物的碰撞能进行了优化。采用多反应监测(MRM)扫描模式寻找列当萌发刺激物。质核比扫描范围数据参见(Raupp&Spring2013；Ueno et al.2014)。

数据采集和分析使用masslynx 4.1软件(Waters)。使用genstat广义线性模型、广义线性混合模型或方差分析(anova)分析数据。

二、实验结果

图1显示的是不同向日葵品种的列当萌发刺激物去氢木香内酯(dehydrocostuslactone)的单位植株浓度比较。向日葵品种RIL306，RIL340，RIL348去氢木香内酯平均每株植株分泌的浓度在10-30皮摩尔，向日葵品种RIL265氢木香内酯平均每株植株浓度在5皮摩尔以下。图5显示的是不同向日葵品种平均根部鲜重列当萌发刺激物去氢木香内酯(dehydrocostus lactone)比较。向日葵品种RIL306，RIL340，RIL348去氢木香内酯平均根部鲜重(克)含量在5-10皮摩尔，向日葵品种RIL265氢木香内酯平均每株植株浓度在1皮摩尔以下。结果显示不论是向日葵单位植株产生的去氢木香内酯，还是单位根部鲜重产生的去氢木香内酯，结果相似，具有可比性。说明每个植株的根系鲜重都几近相同，长势良好，进一步证明雾培体系下的实验具有可控性，可重复性。

图2显示的是不同向日葵品种的列当萌发刺激物木香烃内酯(costunolide)单位植株的浓度比较。向日葵品种RIL306，RIL340，RIL348木香烃内酯(costunolide)平均每株植株浓度在20-60皮摩尔，向日葵品种RIL265氢木香内酯平均每株植株浓度在20皮摩尔以下。图6显示的是不同向日葵品种的列当萌发刺激物木香烃内酯(costunolide)单位根部鲜重含量比较。向日葵品种RIL306，RIL340，RIL348木香烃内酯(costunolide)平均根部鲜重(克)含量在10-30皮摩尔，向日葵品种RIL265氢木香内酯平均每株植株含量小于5皮摩尔。

图3为不同向日葵品种的列当萌发刺激物8-epixanthatin单位植株的高效液相色谱(UPLC)峰面积比较。向日葵品种RIL306，RIL340，RIL348中8-epixanthatin平均每株植株峰面积在2e-3e*10^6，向日葵品种RIL265氢木香内酯平均每株植株峰面积约在1e*10^6。图7为不同向日葵品种的列当萌发刺激物8-epixanthatin单位根部鲜重含量比较，日葵品种RIL306，RIL340，RIL348中8-epixanthatin平均根部鲜重的峰面积在7e-10e*10^6，向日葵品种RIL265氢木香内酯平均每株植株峰面积约在2.5e*10^6。

图4为不同向日葵品种的列当萌发刺激物heliolactone单位植株的高效液相色谱(UPLC)峰面积比较。向日葵品种RIL306列当萌发刺激物中heliolactone平均每株植株峰面积在12000左右，而在RIL340，RIL348中则未有检测到。向日葵品种RIL265中heliolactone平均每株植株峰面积约在5000。图8为不同向日葵品种的列当萌发刺激物heliolactone单位根部鲜重浓度比较。向日葵品种RIL306列当萌发刺激物中heliolactone单位根部鲜重峰面积在4000左右，而在RIL340，RIL348中则未有检测到。向日葵品种RIL265中heliolactone平均每株植株峰面积约在1000。可见所以的向日葵品种列当萌发刺激物中heliolactone的含量极低甚至无法检测到，无法量化，且峰面积的大小也远远低于8-epixanthatin。

结果显示，相比于向日葵品种RIL265，向日葵品种RIL306，RIL340，RIL348的列当萌发刺激物中含有相对较多的去氢木香内酯(dehydrocostus lactone)，木香烃内酯(costunolide)，8-epixanthatin。但是却只在RIL265和RIL306检测到了heliolactone,且含量极低。

三、结果分析

本实验选择向日葵品种RIL306，RIL340，RIL348，RIL265。在前期向日葵列当萌发率测试试验中(在此不做详细说明)，向日葵品种RIL340，RIL306有较高的列当萌发率，而向日葵品种RIL265，RIL348的列当萌发率较低。

在雾培体系下，向日葵幼苗长势旺盛，根系生长良好健康，两周后的根系开始快速伸长。四周后几乎全部植株进入6叶期。列当萌发刺激物的样品收集预处理后，用高效液相色谱仪和三重四极质谱法联合(UHPLC-TQ-MS)分离检测列当萌发刺激物的组分。

本次实验根据前期文献资料，选择四种向日葵列当萌发刺激物进行探测，其中三种是向日葵列当萌发刺激物分离出来的具有生物活性的倍半萜烯，即去氢木香内酯(dehydrocostus lactone)，木香烃内酯(costunolide)，8-epixanthatin，最后一种是一种非倍半萜烯heliolactone。

结果显示，在雾培体系下，收集得到的列当萌发刺激物确实探测到了四种向日葵列当萌发刺激物的生物活性，其中去氢木香内酯(dehydrocostus lactone)，木香烃内酯(costunolide)，8-epixanthatin活性较强，而非倍半萜烯heliolactone则活性极低。不同向日葵品种的向日葵列当萌发刺激物中活性浓度也不尽相同。

不论是向日葵单位植株产生的萌发刺激物，还是单位根部鲜重产生的萌发刺激物，结果相似，具有可比性。说明每个植株的根系鲜重都几近相同，长势良好，进一步证明雾培体系下的实验具有可控性，可重复性。

本发明利用雾培技术快速高效的特点，建立雾培体系，对植物进行无磷营养液饥饿处理，结合固相萃取技术，优化了从寄主植物向日葵根系分泌物中提取纯化向日葵列当萌发刺激物的方法，省时省力，可循环利用，得到的萌发刺激物浓度更高更纯，进行后续的质谱分析以及相关研究。

对比例1

本对比例采用常规的水培方法，水培实验在室内气候培养箱内进行。

具体步骤如下：

(1)在培养皿底部放一片玻璃滤纸，将向日葵种子均匀放置其上，再加盖一片滤纸于种子上，倒入消毒液(Metalaxyl)，浸泡3-4小时。将种子转移至用杀菌液(Metalaxyl)或蒸馏水湿润的发芽纸，整齐排列，小心卷起来。将卷起来的发芽纸垂直放入5L的桶状容器。用薄膜包裹容器以保湿，放入28℃恒温箱48小时，或者25℃72小时。

(2)准备水培体系：水培25L培养箱，植物营养液(低磷1/2Long Ashton阿仕顿营养液)，人工穿孔的防水泡沫塑料板、循环水泵。温室培养温度22℃，16/8小时白天/黑夜，70％湿度。剥去种子薄膜状内种皮，将健康发芽的种子小心放入泡沫塑料板的小孔内，使其胚根与营养液接触；培养幼苗14天或21天。

(3)将植株根部用超纯水淋洗，放入50ml试管，倒入30ml超纯水，根据植株根系大小调整水的体积。用铝箔包裹试管使得根部处在黑暗环境中24小时。测量每个样品的体积，植株根系分泌溶液用0.22μm的针孔过滤器过滤。

(4)剪切向日葵根部，干燥，称重。调整每个样品使得每1ml根系分泌液对应1g植株根部干重量。提取纯化根系分泌物中的萌发刺激物，其萃取方法与雾培方法相同。用高效液相色谱仪和三重四极质谱法联合(UHPLC-TQ-MS)分离检测列当萌发刺激物的组分。

本实验选择向日葵品种RIL306，RIL340，RIL348，RIL265。在前期向日葵列当萌发率测试试验中(在此不做详细说明)，向日葵品种RIL340，RIL306有较高的列当萌发率，而向日葵品种RIL265，RIL348的列当萌发率较低。列当萌发刺激物的样品收集预处理后，用高效液相色谱仪和三重四极质谱法联合(UHPLC-TQ-MS)分离检测列当萌发刺激物的组分。

结果如图12～图19所示，在水培体系下，向日葵列当萌发刺激物的浓度均比雾培体系下低很多倍，相同品种之间比较，水培体系下有的品种甚至没有检测到萌发刺激物，如向日葵品种RIL348的根系分泌物中没有检测到萌发刺激物costunolide。结果表明此雾培体系比常规水培条件下的得到的列当萌发刺激物更纯浓度更高。