阅读说明：本技术 去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂及其应用 (Efficient chemical biological agent for removing pseudomonas aeruginosa biofilm and application thereof ) 是由 汪美贞 肖俊炜 孙峰 李张强 单玉菊 冯华军 沈东升 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂,按总质量为100％计,包括以下组分：微生物制剂60％～75％,活性氧自由基清除剂25％～40％；所述微生物制剂为ΔLasR菌株和/或ΔLasI菌株。本发明的去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂具有绿色、经济、普适、持久等优势,且配方简单,所用的成分价格低廉,来源广泛,是一种低成本、效果好的抑制铜绿假单胞菌生长及其膜形成的制剂。(The invention discloses a high-efficiency chemical biological agent for removing a pseudomonas aeruginosa biomembrane, which comprises the following components by the total mass of 100 percent: 60-75% of microbial preparation and 25-40% of active oxygen radical scavenger; the microbial preparation is a delta LasR strain and/or a delta LasI strain. The efficient chemical biological agent for removing the pseudomonas aeruginosa biomembrane has the advantages of greenness, economy, universality, durability and the like, is simple in formula, low in price of used components, wide in source and low in cost, and has a good effect of inhibiting the growth of the pseudomonas aeruginosa and the formation of the pseudomonas aeruginosa biomembrane.)

去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂及其应用

技术领域

本发明涉及膜污染去除领域，具体涉及一种去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂及其应用。

背景技术

生物膜也称为生物被膜，是微生物有组织生长的聚集体。生物膜由脂类、蛋白质和糖类等物质组成，细菌生物膜对抗生素有很强的物理抗性作用，并且可促进破坏宿主免疫防御机制。生物膜形成在生活管道、工业生产、医疗器械上时，会导致侵蚀和堵塞管道、污染产品、降低热传导和引起细菌感染等，对生产和生活带来很多问题。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)在自然界分布广泛，存在于各种潮湿环境，如水、空气、人的皮肤、呼吸道和肠道等。在很多实际生产操作中，铜绿假单胞菌的成膜问题难以消除，严重影响生产效率。在医院内该菌是使得囊性纤维化、慢性支气管炎等疾病加重的最常见感染细菌之一。其原因就是铜绿假单胞菌株具有很强的生物膜形成能力，使得该菌难以杀灭。

群体感应(quorum sensing，QS)是一种细菌间信息交流机制。通过群体感应，野生型菌株(wild type，WT)分泌弹性蛋白酶等公共物质，来维持种群的稳定，称为群体感应合作。群体感应欺骗是指欺骗子(ΔLasR/ΔLasI)个体自身不分泌但可利用周围其他合作个体产生的公共物质。该行为会对整个种群造成负担，若欺骗子大量繁殖占据种群则会造成种群的崩溃。当欺骗子存在的时候，群体感应合作者可以分泌氰化氢阻断其电子呼吸链从而抑制欺骗子的大量增长。生物膜的形成是一种合作行为，引入欺骗子破坏铜绿假单胞菌群体感应、同时清除胞内活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)使引入的欺骗子加速破坏铜绿假单胞菌群体感应，可为生物膜去除提供新策略。

去除和抑制生物膜形成的现有方法：公告号为CN105613584B的中国发明专利公开了一种提高银离子对生物膜去除及杀菌效率的方法，通过一种对生物膜具有解离效应的小分子物质双(3-氨基丙基)胺与银离子耦合，提高了无机银离子对生物膜去除和杀菌效率，但该发明原料中包含无机银离子和双(3-氨基丙基)胺等高成本材料，不适合商业化生产；公告号为CN1901801B的中国发明专利公开了镓抑制生物膜形成，在设备或设备表明上涂覆足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物，该方法效果显著，但含镓组合物制备过程繁琐。

发明内容

针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂，成本低，各组分来源广泛，可明显抑制铜绿假单胞菌生长及其膜形成，高效去除铜绿假单胞菌生物膜。

一种去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

微生物制剂 60％～75％，

活性氧自由基清除剂 25％～40％；

所述微生物制剂为ΔLasR菌株和/或ΔLasI菌株。

本发明通过干扰微生物的群体感应去除铜绿假单胞菌生物膜。群体感应是指在细菌生长过程中，会不断产生一些自诱导的小分子化合物(自诱导物)，细菌通过感应这些自诱导物浓度，对周围环境进行判断。当这些自诱导物质到达一定阈值时，在群体范围内调控一些相关基因的表达来适应环境的变化。

本发明根据待去除铜绿假单胞菌生物膜中的铜绿假单胞菌种类选择微生物制剂对应的野生型菌株，可采用市售菌株，如中国普通微生物菌种保藏管理中心出售的各种铜绿假单胞菌。

ΔLasR为铜绿假单胞菌敲除lasR基因得到的突变菌株，该突变菌株无法收到信号分子合成酶LasI发出的信号，即会缺失对野生型铜绿假单胞菌的一些响应和功能。该突变菌株用于本发明可很好地去除生物膜。

lasI基因控制着铜绿假单胞菌群体感应顶端信号分子的合成，敲除lasI基因的ΔLasI突变菌株无法合成细菌间交流的中间物质，使得种群无法启动群体感应，即同样会缺失对野生型铜绿假单胞菌的一些相应和功能。该突变菌株用于本发明亦可很好地去除生物膜。

本发明主要运用群体感应，通过引入欺骗子ΔLasR菌株和/或信号分子合成酶突变株ΔLasI，大量利用野生株的公共物质使种群公共物质供应不足以及活性氧自由基清除剂而抑制甚至杀灭细菌，经济高效地加快铜绿假单胞菌生物膜去除。

作为优选，所述的去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

微生物制剂 60％～70％，

活性氧自由基清除剂 30％～40％。

进一步优选，所述的去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

微生物制剂 65％～70％，

活性氧自由基清除剂 30％～35％。

作为优选，所述微生物制剂为在LB培养基中生长至对数生长期的ΔLasR菌株和/或ΔLasI菌株。

作为优选，所述微生物制剂为ΔLasR菌株和ΔLasI菌株。通过细菌种群中欺骗子ΔLasR和/或ΔLasI菌株数量增多来影响群体感应合作，通过活性氧自由基去除剂来使得种群分泌的氰化物不能发挥作用，降低群体感应监管作用，破坏群体感应的稳定，进而使种群崩溃，达到加快铜绿假单胞菌生物膜去除的目的。

进一步优选，所述微生物制剂按总质量为100％计，组成为：

ΔLasR菌株 80％～90％，

ΔLasI菌株 10％～20％。

再进一步优选，所述微生物制剂按总质量为100％计，组成为：

ΔLasR菌株 80％～85％，

ΔLasI菌株 15％～20％。

作为优选，所述活性氧自由基清除剂为N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物岐化酶(SOD)中的至少一种。NAC是一种含巯基的抗氧化剂，能增加细胞自由基捕获。CAT称为过氧化氢酶，主要作用是清除H₂O₂，且H₂O₂浓度越高反应速率越快。两者都能有效的清除细菌体内的活性氧自由基，加快铜绿假单胞菌种群的崩溃和去除生物膜。

进一步优选，所述活性氧自由基清除剂为N-乙酰-L-半胱氨酸和过氧化氢酶。将N-乙酰-L-半胱氨酸和过氧化氢酶混合均匀即得复合活性氧自由基清除剂。采用复合活性氧自由基清除剂比单一组分的活性氧自由基清除剂效果更好，其中的N-乙酰-L-半胱氨酸和过氧化氢酶能发挥协同作用，增强抑制效果，同时保持较好的稳定性，进一步提高抑制效率。

再进一步优选，所述活性氧自由基清除剂按总质量为100％计，组成为：

N-乙酰-L-半胱氨酸 70％～80％，

过氧化氢酶 20％～30％。

更进一步优选，所述活性氧自由基清除剂按总质量为100％计，组成为：

N-乙酰-L-半胱氨酸 75％～80％，

过氧化氢酶 20％～25％。

本发明还提供了一种所述的去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂在去除铜绿假单胞菌生物膜中的应用。

所述的去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂中，微生物制剂需冷冻保存，使用时先将冷冻保存的微生物制剂恢复活性，在LB培养基中培养至对数生长期，然后再投加使用，根据生物膜的厚度及形态确定微生物制剂的投加量和处理时间。活性氧自由基清除剂充分溶解于水中后再投加使用。

作为优选，所述的应用包括：向铜绿假单胞菌生物膜中投加微生物制剂，间隔1～5h后再投加活性氧自由基清除剂。该投加方式可加快破坏铜绿假单胞菌种群稳定性，能有效地加快生物膜的去除，铜绿假单胞菌种群在7～8天内迅速崩溃。结合激光共聚焦显微镜观察，结果表明，在添加本发明制剂后，生物膜量显著减少，且生物膜厚度显著减小。

对于一些日常的生物膜感染，间隔时间优选为1～1.5h；对于某些工程上的生物膜堵塞如膜生物反应器(MBR)的膜污染，间隔时间优选为2.5～3.5h。

本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明的去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂利用群体感应欺骗和干扰群体感应监管，能在七天以内使铜绿假单胞菌种群崩溃，具有绿色、经济、普适、持久等优势，且配方简单，所用的成分价格低廉，来源广泛，是一种低成本、效果好的抑制铜绿假单胞菌生长及其膜形成的制剂，值得推广使用。

附图说明

图1为应用例1中各组种群密度随时间的变化图；

图2为应用例3中结晶紫染色法检测生物膜的结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

ΔLasR菌株+ΔLasI菌株 70％，

N-乙酰-L-半胱氨酸 24％，

过氧化氢酶 6％。

其中，ΔLasR菌株和ΔLasI菌株的质量比为90:10。

实施例2

去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

ΔLasR菌株+ΔLasI菌株 65％，

N-乙酰-L-半胱氨酸 26％，

过氧化氢酶 9％。

其中，ΔLasR菌株和ΔLasI菌株的质量比为85:15。

实施例3

去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

ΔLasR菌株 70％，

N-乙酰-L-半胱氨酸 24％，

过氧化氢酶 6％。

实施例4

去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

ΔLasI菌株 70％，

N-乙酰-L-半胱氨酸 24％，

过氧化氢酶 6％。

实施例5

去除铜绿假单胞菌生物膜用的高效化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

ΔLasR菌株+ΔLasI菌株 65％，

N-乙酰-L-半胱氨酸 28％，

过氧化氢酶 7％。

其中，ΔLasR菌株和ΔLasI菌株的质量比为80:20。

对比例1

去除铜绿假单胞菌生物膜用的化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

铜绿假单胞菌野生型菌株(WT) 70％，

ΔLasR菌株 15％，

ΔLasI菌株 15％。

对比例2

去除铜绿假单胞菌生物膜用的化学生物制剂，按总质量为100％计，包括以下组分：

WT 100％。

应用例1

实施例1～5、对比例1～2的化学生物制剂充分溶解于去离子水中待用。在无菌环境中接种起始OD₆₀₀＝0.05的铜绿假单胞菌与4mL酪蛋白培养基，接种时先向培养基中投加200μL微生物制剂，放入摇床3小时后投加100μL活性氧自由基清除剂，然后在36℃、250rpm的摇床环境下培养一共24小时，待测。每组实施例或对比例设置3个生物学平行。每两天检测种群密度，如表1、图1所示。

本应用例的铜绿假单胞菌野生型菌株采用中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为CGMCC 1.2421的铜绿假单胞菌，ΔLasR菌株和ΔLasI菌株为通过同源重组或CRISPR基因敲除获得的突变型菌株。

本应用例的LB培养基：1％胰蛋白胨(TRYPTONE，10g/L)、0.5％NaCl(5g/L)、0.5％酵母提取物(YEAST EXTRACT，5g/L)按比例溶于去离子水，再通过120℃高压灭菌锅灭菌，待用。

本应用例的酪蛋白培养基：PM培养基高温灭菌后，摇匀，静置至澄清状态。按10g/L加入酪蛋白，搅拌至完全溶解。用0.22μm过滤系统过滤灭菌，待用。

PM培养基：1g/L(NH₄)₂SO₄，1.7g/L KH₂PO₄，1.775g/L NaHPO₄，0.0025g/L EDTA，0.011g/L ZnSO₄·7H₂O，0.00154g/L MnSO₄·H₂O，0.000392g/L CuSO₄·5H₂O，0.00025g/LCo(NO₃)₂·6H₂O，0.000177g/L Na₂B₄O₇·10H₂O，0.0667g/LCaCl₂·2H₂O，0.289g/L MgSO₄，0.000185g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H2O，0.146g/L KOH，0.2g/L氨三乙酸。

表1稀释10^-6时的CFU数

组别	第1天CFU	第3天CFU	第5天CFU	第7天CFU
					实施例1	82±2	79±3	3±1	4±1
实施例2	96±3	91±2	58±1	3±2
					实施例3	105±2	100±1	75±2	4±1
实施例4	102±1	99±2	88±3	3±1
					实施例5	90±2	91±4	80±2	67±4
对比例1	99±4	103±3	97±3	114±3
					对比例2	93±3	122±2	100±4	112±2

由表1和图1的结果可知，实施例1～5对应的铜绿假单胞菌种群在七天内均崩溃，而对比例1～2对应的组未崩溃，且生长状况良好，说明本发明制剂可有抑制甚至杀灭铜绿假单胞菌，即加快生物膜的去除。

应用例2

实施例1～5、对比例1～2的化学生物制剂充分溶解于去离子水中，使用0.22μm滤膜过滤后装于密闭容器，待用。无菌环境下，在激光共聚焦显微镜专用培养皿中接种起始OD₆₀₀＝0.05的铜绿假单胞菌与2mL LB培养基，接种时先向培养基中投加100μL微生物制剂，间隔3小时再投加50μL活性氧自由基清除剂，然后在36℃恒温培养箱培养12小时。每组实施例或对比例设置3个生物学平行。用激光共聚焦显微镜观察铜绿假单胞菌野生型菌株和ΔLasR菌株的占比及生物膜形态。铜绿假单胞菌野生型菌株为mCherry标记(在激光共聚焦显微镜下为红色)，ΔLasR菌株为GFP标记(在激光共聚焦显微镜下为绿色)。

本应用例的铜绿假单胞菌野生型菌株采用中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为CGMCC 1.2421的铜绿假单胞菌，ΔLasR菌株为通过同源重组或CRISPR基因敲除获得的突变型菌株，荧光标记菌株通过质粒导入获得。

结果发现，实施例1～5对应的铜绿假单胞菌种群生物膜厚度在30～40μm，而对比例1～2对应的组生物膜厚度为60～80μm，说明本发明制剂可有效减少铜绿假单胞菌生物膜的形成。

应用例3

实施例1～5、对比例1～2的化学生物制剂充分溶解于去离子水中，使用0.22μm滤膜过滤后装于密闭容器，待用。在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μL LB培养基，接种10μL过夜培养的铜绿假单胞菌，每孔再加入5μL微生物制剂，间隔3小时再投加2.5μL活性氧自由基清除剂，36℃静置孵育24h。再将培养基小心吸出，每孔加入200μL无菌PBS缓冲液清洗板孔3次。每孔加入100μL甲醇固定15min，再小心吸出至甲醇完全风干。每孔加入200μL1％结晶紫溶液，室温下染色30min，吸出染料并用蒸馏水冲洗剩余染料，待干燥后加入200μL 95％乙醇溶解，酶标仪检测570nm波长的吸光度。每组实施例或对比例设置3个生物学平行，结果如图2所示。

本应用例的铜绿假单胞菌野生型菌株采用中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为CGMCC 1.2421的铜绿假单胞菌，ΔLasR菌株和ΔLasI菌株为通过同源重组或CRISPR基因敲除获得的突变型菌株。

结果发现，通过结晶紫染色法检测生物膜，实施例1～5对应的铜绿假单胞菌种群OD₅₇₀为1～2，而对比例1～2对应的OD₅₇₀为4～5，说明本发明制剂可有效减少铜绿假单胞菌生物膜的形成。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。