阅读说明：本技术 一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法 (Method for separating and purifying cycloheximide from bacillus amyloliquefaciens fermentation liquor ) 是由 卢文玉 刘臻 张传波 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法,包括如下步骤：(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵液离心取上清；萃取,旋蒸,得黄色粘稠物；(2)将黄色粘稠物经大孔树脂层析,用甲醇水溶液洗脱,得到Fr.1-Fr.3组分；(3)将组分Fr.2和Fr.3合并后使用硅胶柱柱层析,用三氯甲烷：甲醇体系洗脱,共得到Fc.1-Fc.20；(4)将Fc.17-Fc.19合并浓缩分离,收集T1；(5)T1冷冻干燥,得到环已酰亚胺固体。本发明发现了解淀粉芽孢杆菌次级代谢产物中存在环已酰亚胺；并且使用大孔树脂对环已酰亚胺进行分离提纯,降低了成本,提高了效率；环已酰亚胺的提取率为65％以上,纯度为91％以上。(The invention discloses a method for separating and purifying cycloheximide from bacillus amyloliquefaciens fermentation liquor, which comprises the following steps: (1) centrifuging the bacillus amyloliquefaciens fermentation liquid to obtain a supernatant; extracting, and rotary steaming to obtain yellow viscous substance; (2) subjecting the yellow viscous substance to macroporous resin chromatography, eluting with methanol water solution to obtain Fr.1-Fr.3 component; (3) the components Fr.2 and Fr.3 are combined and subjected to column chromatography by using a silica gel column, and the mixture is subjected to column chromatography by using chloroform: eluting with methanol system to obtain Fc.1-Fc.20; (4) combining, concentrating and separating Fc.17-Fc.19, and collecting T1; (5) t1 Freeze drying gave a cycloheximide solid. The invention finds that the cyclic imide exists in the secondary metabolite of the bacillus amyloliquefaciens; and macroporous resin is used for separating and purifying the cycloheximide, so that the cost is reduced, and the efficiency is improved; the extraction rate of the cycloheximide is more than 65%, and the purity is more than 91%.)

一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法

技术领域

本发明涉及一种从细菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺的方法，具体地说涉及一种从解淀粉芽孢杆菌分离提纯环已酰亚胺的方法。

背景技术

海洋生物活性次级代谢产物是新药的重要来源之一，具有结构特异性高、种类繁多且生物活性较强等特点。此外，在化工、医药、食品等领域，海洋次级代谢产物也都具有广阔的应用前景。目前，已从海洋微生物中分离到多种活性物质，如生物碱类、环肽、大环内酯类、萜类、甾醇类、醌类、吩嗪类等化合物。这些代谢物为药物研究提供了重要的前体化合物。应用海洋来源的芽孢杆菌进行植物病害生物防治已早有报道。研究显示，解淀粉芽孢杆菌对尖孢镰刀菌、草莓蛇病菌等植物病原真菌均有很强的抑制作用。然而其主要活性物质分离鲜有报道。

环已酰亚胺结构简单，水溶性好，并且能抑制多种病原菌的生长，进而备受关注。现有研究多集中在环已酰亚胺及其结构类似物的合成与分离上。目前环已酰亚胺提取方法主要包括：萃取、Sephadex柱层析、硅胶柱层析、制备液相分离等四个步骤。现有分离方法存在诸多缺陷如，1)层析中所用的葡聚糖凝胶树脂LH-20原料成本高；2)产品收率低，过程损失达70％；3)产物纯度低，不超过80％。利用微生物生产抗生素类产品历史悠久，如青霉素的发酵生产，其可以极大的提高产量，建立相应的分离提纯方法可降低成本。然而，应用上述分离方法对发酵液中的环已酰亚胺进行分离提纯的研究较少，距工业化应用仍有较大差距。因此开展发酵液中高纯度环已酰亚胺提取分离研究，并建立相关分离工艺，具有巨大的应用价值。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法，包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵液离心取上清液；用等体积乙酸乙酯萃取，萃取重复2-3次，得乙酸乙酯萃取液；合并，44℃旋蒸，除去乙酸乙酯，得黄色粘稠物；

(2)将所述黄色粘稠物经型号D101大孔树脂层析，依次用体积浓度为50％，60％，70％的甲醇水溶液进行洗脱，每个梯度使用4倍柱体积洗脱剂，得到Fr.1、Fr.2、Fr.3组分；

(3)将200-300目柱层析用硅胶粉用乙酸乙酯浸泡24-28h，装填在硅胶柱中；将组分Fr.2和Fr.3合并后使用硅胶柱柱层析，依次用体积比为(50：1)，(20：1)，(15：1)，(10：1)的三氯甲烷：甲醇体系洗脱，每个梯度使用3倍柱体积洗脱剂，每个梯度依次收集5份洗脱剂，共得到20个组分，依次为Fc.1～Fc.20；

(4)将Fc.17、Fc.18和Fc.19合并浓缩，通过高效制备液相进行分离，检测器为视差检测器，收集RT＝14min的组分为T1；

(5)将T1在-75℃～-81℃冷冻，再用冷冻干燥机冷冻干燥，得到环已酰亚胺固体。

优选地，解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensLWYZ003，保藏编号：CGMCC NO.18345，还可以选用其它的解淀粉芽孢杆菌。

本发明的优点：

本发明发现了解淀粉芽孢杆菌次级代谢产物中存在环已酰亚胺；并且使用大孔树脂代替葡聚糖凝胶对环已酰亚胺进行分离提纯，降低了生产成本，提高了生产效率；环已酰亚胺的提取率为65％以上，纯度为91％以上。

附图说明

图1为环已酰亚胺的质谱，分子式为C₁₅H₂₃NO₄(高分辨质谱m/z 280.1565,[M﹣H]^－)

图2为环已酰亚胺的红外光谱，在红外图谱中，3420cm^-1处的吸收峰显示该物质带有羟基，1688cm^-1处有很强的吸收峰显示该物质有环乙酮中的碳氧双键存在，1467cm^-1,2353cm^-1and 3212cm^-1出的吸收峰显示该物种有亚氨基。

图3为环已酰亚胺核磁氢谱。

图4为环已酰亚胺核磁碳谱。

图5为分离物质对藤黄生长抑制作用的电镜图片。图5A，空白对照；图5B，环已酰亚胺对藤黄微球菌抑制作用。

具体实施方式

本发明是以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LWYZ003为例，以其为优选，也可以选用其它的解淀粉芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LWYZ003于2019年7月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.18345。

实施例1

一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法，包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌LWYZ003，保藏编号：CGMCC NO.18345)发酵液5000rpm离心30min取上清液；用等体积乙酸乙酯萃取，萃取重复3次，得乙酸乙酯萃取液；合并，44℃旋蒸，除去乙酸乙酯，得黄色粘稠物；

(2)将所述黄色粘稠物经型号D101大孔树脂层析，依次用体积浓度为50％，60％，70％的甲醇水溶液进行洗脱，每个梯度使用4倍柱体积洗脱剂，得到Fr.1、Fr.2、Fr.3组分；

(3)将200-300目柱层析用硅胶粉用乙酸乙酯浸泡24h，装填在硅胶柱中；将组分Fr.2和Fr.3合并后使用硅胶柱柱层析，依次用体积比为(50：1)，(20：1)，(15：1)，(10：1)的三氯甲烷：甲醇体系洗脱，每个梯度使用3倍柱体积洗脱剂，每个梯度依次收集5份洗脱剂，共得到20个组分，依次为Fc.1～Fc.20；

(4)将Fc.17、Fc.18和Fc.19合并浓缩，通过高效制备液相进行分离，(色谱柱(YMC-Pack ODS-A250 mm×25mm，s-5μm,12nm)甲醇：水＝1：2，流速8ml/min，210nm，柱温24℃)，检测器为视差检测器，收集RT＝14min的组分为T1；

(5)将T1在-80℃冷冻，再用冷冻干燥机冷冻干燥，得到一种白色粉末，分子式为C₁₅H₂₃NO₄(高分辨质谱m/z 280.1565,[M﹣H]^－)。在红外图谱中，3420cm^-1处的吸收峰显示该物质带有羟基，1688cm^-1处有很强的吸收峰显示该物质有环乙酮中的碳氧双键存在，1467cm^-1,2353cm^-1and 3212cm^-1出的吸收峰显示该物种有亚氨基。C₁₅H₂₃NO₄不饱和度计算为5。根据¹H-NMR和DEPT推算物质结构，该物质中有两个甲基(δ_H 0.87,1.19)，5个亚甲基(δ_H1.33,1.65,2.27,2.50,2.61)，5个次甲基(δ_H 1.50,1.96,2.09,3.85,4.34)，一个羟基(δ_H1.80)，一个亚氨基(δ_H 10.57)。根据¹³C-NMR推算物质结构，该物质有15个碳信号，其中3个羰基δ_C(173.25,173.40,213.60)。同时结合物质的不饱和度，推断该物质分子中有2个多元环。综合上述信息，并对照参考文献得知，该物质是环已酰亚胺。(见图1-4)

确认了结构(I).并且测定了它的抑菌活性以及其对藤黄微球菌生长抑制作用的电镜图片(图5)。

结构式用式I所示：

大孔树脂对环已酰亚胺的吸附率为90％以上，环已酰亚胺的提取率为65％，纯度为91％。

实验证明，步骤(1)的萃取重复次数也可以是2次，大孔树脂的型号也可以采用与型号D101性质相似的，柱层析用硅胶粉用乙酸乙酯浸泡28h，将T1在-75℃或-81℃冷冻，其它同本实施例，可以制备得到环已酰亚胺固体。