阅读说明：本技术 一种胶原蛋白肽-锌螯合物的制备方法 (Preparation method of collagen peptide-zinc chelate ) 是由 申铉日 于 2019-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种胶原蛋白肽-锌螯合物的制备方法,以新鲜贝类为原料,采用热提法获得变性后的贝类外套膜水溶性胶原蛋白,然后用蛋白酶对该水溶性胶原蛋白进行水解,制得胶原蛋白肽,将胶原蛋白肽与金属锌离子螯合,即制备胶原蛋白肽-锌螯合物。本发明方法以海洋生物的加工废弃物为原料,具有获取途径简便、成本低、鳌合率高,避免陆生动物胶原蛋白中可能出现的疯牛病及口蹄疫等风险的优点。同时,胶原蛋白肽和锌离子螯合后的肽-锌鳌合物与锌离子相比,具有毒副作用小,并能发挥胶原蛋白肽与锌离子协同作用的效果,可为消费者提供安全、功效良好的抗骨质疏松功能食品。(The invention discloses a preparation method of a collagen peptide-zinc chelate, which takes fresh shellfish as a raw material, obtains water-soluble collagen of a shellfish mantle after denaturation by adopting a heat extraction method, then hydrolyzes the water-soluble collagen by using protease to prepare collagen peptide, and chelates the collagen peptide with metal zinc ions to prepare the collagen peptide-zinc chelate. The method takes the processing waste of marine organisms as the raw material, and has the advantages of simple and convenient acquisition way, low cost, high chelating rate and capability of avoiding the risks of mad cow disease, foot and mouth disease and the like possibly occurring in the collagen of the terrestrial animals. Meanwhile, compared with zinc ions, the peptide-zinc chelate chelated by the collagen peptide and the zinc ions has small toxic and side effects, can exert the synergistic effect of the collagen peptide and the zinc ions, and can provide safe and well-effective anti-osteoporosis functional food for consumers.)

一种胶原蛋白肽-锌螯合物的制备方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一种胶原蛋白肽-锌螯合物的制备方法。

背景技术

骨稳态是由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收共同调节完成的。环境、年龄、遗传等因素会导致骨稳态失去平衡、骨微结构退化，继而引发骨质疏松症和骨关节炎等疾病。目前，治疗骨质疏松症多集中在使用***、降钙素、二膦酸盐等方法，这些药物长期服用会产生大量副作用。因此，寻找基于医食同源理论的能够长期服用、安全且有功效的食品及基料具有发现和引领21世纪主流功能型食品的战略意义。

胶原蛋白广泛的分布在人及动物的组织中，截至目前已发现的胶原类型至少有27种。胶原蛋白对炎症、肿瘤、骨质疏松症等具有潜在的治疗功效且被认为是安全的食物。有文献表明胶原蛋白肽的生物活性不仅与其分子量有关还与其胶原的来源和类型有关。研究表明包括牛、猪、鹅等在内的陆生动物的胶原蛋白肽对骨质疏松和骨关节炎有潜在的治疗作用。然而，近年来不断爆发的疯牛病、***、禽流感等疾病使得人们对陆生动物胶原产生了极大的忧虑，而水产动物胶原优质、安全、应用范围广，近年来备受关注。

锌是骨形成和骨生长中所必须的营养因子。近年来，越来越多的证据表明锌缺乏会抑制骨基质的矿化和延缓骨形成。虽然，可以服用无机锌来补充锌的缺乏，但是，无机锌具有稳定性和吸收效果差、且对人体毒性较强不适宜长期服用等特点。肽-锌螯合物不仅可以进一步提高胶原蛋白肽的功效，提高锌元素的吸收率、稳定性，还可达到发挥协同作用的目的。但常见的I型胶原蛋白为原料获得的胶原蛋白肽与锌螯合时螯合效果并不理想，胶原蛋白肽螯合锌的得率较低。因此，掌握一种胶原蛋白肽与锌结合的螯合物制品的制备技术，提高胶原蛋白肽螯合锌的生产效率，满足消费者需求是一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种胶原蛋白肽-锌螯合物的制备方法，用于制备类V型贝类胶原蛋白肽-锌螯合物，以促进骨形成。

本发明所采用的技术方案是，一种胶原蛋白肽-锌螯合物的制备方法，以新鲜贝类为原料，采用热提法获得变性后的贝类外套膜水溶性胶原蛋白，然后用蛋白酶对该水溶性胶原蛋白进行水解，制得胶原蛋白肽，将胶原蛋白肽与金属锌离子螯合，即制备胶原蛋白肽-锌螯合物。

本发明特点还在于，

具体按以下步骤实施：

步骤1，将新鲜贝类外套膜，用蒸馏水清洗除杂后，加工成小块原料；

步骤2，去除步骤1加工后原料中的杂蛋白，得到胶原蛋白，并采用热提法制备变性胶原蛋白；

步骤3，采用胃蛋白酶或胰蛋白酶酶解步骤2得到的变性胶原蛋白，得到胶原蛋白肽；

步骤4，将步骤3得到的胶原蛋白肽与锌盐溶液螯合反应，分离、干燥，即得到胶原蛋白肽-锌螯合物。

步骤1中新鲜贝类外套膜加工环境温度为2～4℃。

步骤2中去除杂蛋白，具体为：将0.08～0.12mol/L的NaOH溶液加入到步骤1得到的原料中，在温度为2～4℃的环境中，搅拌处理24～48h，然后离心，除去上清液，反复加入蒸馏水清洗原料，使得原料呈现中性，即得到胶原蛋白。

原料与NaOH溶液的质量比为1:8～10。

步骤2中热提法制备变性胶原蛋白，具体为：将获得的胶原蛋白用蒸馏水浸泡，在90～100℃水浴温度条件下进行提取，抽滤除去不溶物，冷冻干燥，即得到变性胶原蛋白。

胶原蛋白与蒸馏水的质量比为1:8～10。

步骤3具体为：将变性胶原蛋白以5～15mg/mL溶解于蒸馏水中，调节pH至2～3或7.5～8.5，分别添加胶原蛋白质量1～2％的胃蛋白酶或胰蛋白酶，置于摇床中酶解4～6h，然后热处理灭酶活，冷冻干燥后得到酶解后的胶原蛋白肽。

步骤4具体为：取胶原蛋白肽溶于蒸馏水中，调节pH至5.5～6.5，将胶原蛋白肽溶液和锌盐溶液混合，搅拌溶解后于45～60℃的水浴振荡条件下螯合35～45min，然后在反应液中添加无水乙醇于25～30℃环境中静置45～60min，离心分离沉淀物，并用无水乙醇反复清洗沉淀物，收集沉淀物于40～50℃温度下干燥，即得胶原蛋白肽-锌螯合物。

胶原蛋白肽溶液的浓度为100～200mg/mL，锌盐溶液浓度为80～120mg/mL，锌盐溶液与胶原蛋白肽溶液体积比为1:5～6，添加无水乙醇后溶液中乙醇质量浓度为75～85％。

本发明的有益效果是，本发明方法以海洋生物的加工废弃物为原料，具有获取途径简便、成本低、鳌合率高，避免陆生动物胶原蛋白中可能出现的疯牛病及***等风险的优点。同时，胶原蛋白肽和锌离子螯合后的肽-锌鳌合物具有毒副作用小、易吸收、不易残留，并能发挥胶原蛋白肽与锌离子协同作用的效果，可为消费者提供安全、效果好的功能食品。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的肽-锌螯合物和胶原蛋白肽的傅里叶红外光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供了一种胶原蛋白肽-锌螯合物的制备方法，采用热提法获得变性后的水溶性胶原蛋白，随后用蛋白酶对该水溶性胶原蛋白进行水解，制得胶原蛋白肽，再与金属锌离子螯合制备胶原蛋白肽-锌螯合物。具体按以下步骤实施：

步骤1：原料的处理

选取新鲜珍珠贝外套膜，用蒸馏水清洗除杂后，在2～4℃的温度下切成2cm×2cm大小的块，即制得原料。

步骤2：去除杂蛋白(除去胶原蛋白以外的蛋白质)

将0.08～0.12mol/L的NaOH溶液加入到步骤1得到的原料中，原料与NaOH溶液的质量比为1:8～10，在温度为2～4℃的环境中，搅拌处理24～48h，以8000～12000rpm的转速离心，除去上清液，随后反复加入蒸馏水清洗原料5次及以上，使得原料接近中性，得到珍珠贝外套膜胶原蛋白。

步骤3：制备热变性后的胶原蛋白

将步骤2获得的珍珠贝外套膜胶原蛋白用蒸馏水浸泡，料液质量比为1:8～10。在90～100℃水浴温度条件下进行提取。最后抽滤除去不溶物，冷冻干燥后获得热水提取胶原蛋白。

步骤4：采用胃蛋白酶或胰蛋白酶酶解胶原蛋白获得胶原蛋白肽

将步骤3得到的热水提取胶原蛋白以5～15mg/mL的浓度溶解于蒸馏水中，用盐酸调节pH至2～3或7.5～8.5，添加胶原蛋白质量的1～2％的胃蛋白酶或胰蛋白酶。置于摇床中酶解4～6h。热处理灭酶活参数为，95℃下灭酶活10min，然后自然冷却至室温后冷冻，冷冻干燥后得到酶解后的珍珠贝外套膜胶原蛋白肽。

步骤5：胶原蛋白肽-锌螯合反应

取步骤4制得的胶原蛋白肽溶于蒸馏水中，制成胶原蛋白肽浓度为100～200mg/mL的胶原蛋白肽溶液，用盐酸调节pH至5.5～6.5。将锌盐溶于蒸馏水配成浓度80～120mg/mL的溶液。按锌盐溶液与胶原蛋白肽溶液的体积比为1:5～6比例混合，搅拌溶解后于45～60℃的水浴振荡90～120r/min条件下螯合35～45min。

步骤6：肽-锌螯合物的制备

将步骤5获得的混合溶液中添加无水乙醇，使得溶液中乙醇质量浓度达到75-85％，于25～30℃环境中静置45～60min，于8000～12000rpm下离心分离沉淀物，随后用无水乙醇反复清洗沉淀，离心5次及以上。收集沉淀物于40～50℃温度下干燥得肽-锌螯合物。

本发明方法以海洋生物的加工废弃物为原料，具有获取途径简便、成本低、鳌合率高，避免陆生动物胶原蛋白中可能出现的疯牛病及***等风险的优点。同时，胶原蛋白肽和锌离子螯合后的肽-锌鳌合物具有毒副作用小、易吸收、不易残留，并能发挥胶原蛋白肽与锌离子协同作用的效果，制备得到的类V型贝类胶原蛋白肽-锌螯合物，对促进骨的形成具有良好的效果。可为消费者提供安全、效果好的功能食品。

实施例1：

选取新鲜珍珠贝外套膜100g，用蒸馏水清洗除杂后，在2～4℃的温度下切成2cm×2cm大小的块，制得原料。用0.1mol/L的NaOH溶液加入到制备好的珍珠贝外套膜中，原料与NaOH溶液的质量比为1:10，在温度为4℃的环境中，搅拌处理24h，随后，以10000rpm的转速离心，除去上清液，随后反复加入蒸馏水清洗原料5次，使得原料为中性，将预处理后的珍珠贝外套膜用蒸馏水浸泡，原料与蒸馏水的质量比为1:10，在温度为90℃的环境中进行水浴提取，最后抽滤除去不溶物，滤液经冷冻干燥后获得热水提取胶原蛋白。将制得的胶原蛋白以10mg/mL溶解于蒸馏水中，调节pH至7.5，添加胶原蛋白质量1.5％的胰蛋白酶，置于摇床中酶解5小时，随后于95℃下灭酶10min，冷冻干燥后得到酶解后的胶原蛋白肽1.82g。

取制备好的胶原蛋白肽500mg溶于5mL蒸馏水中，制成胶原蛋白肽溶液，调节pH至6，将硫酸锌溶于蒸馏水配成浓度100mg/mL的溶液，将盐溶液与胶原蛋白肽溶液比例为1:5.5比例搅拌混合，在温度为45℃水浴振荡90r/min条件下螯合反应45min，随后在混合液中添加无水乙醇，使得溶液中乙醇终浓度达到80％，于30℃环境中静置45min，于10000rpm下离心10min取沉淀物，后用无水乙醇反复清洗沉淀，离心5次。收集沉淀物于50℃温度下干燥得肽-锌螯合物，最终获得螯合物0.122g。

实施例2(对比实施例)：

取市售的罗非鱼胶原蛋白肽500mg溶于5mL蒸馏水中，制成胶原蛋白肽溶液，调节pH至6，将硫酸锌溶于蒸馏水配成浓度100mg/mL的溶液，将硫酸锌溶液与胶原蛋白肽溶液的体积比为1:5.5比例混合，搅拌溶解，在温度为45℃条件下螯合反应45min，随后在混合液中添加无水乙醇，使得溶液中乙醇终浓度达到80％，于30℃环境中静置45min，于10000rpm下离心10min取沉淀物，后用无水乙醇反复清洗沉淀，离心5次。收集沉淀物于50℃温度下干燥得肽-锌螯合物，最终获得螯合物0.093g。

实施例3：

选取新鲜珍珠贝外套膜100g，用蒸馏水清洗除杂后，在2～4℃的温度下切成2cm×2cm大小的块，制得原料。用0.08mol/L的NaOH溶液加入到制备好的珍珠贝外套膜中，原料与NaOH溶液的质量比为1:8，在温度为2℃的环境中，搅拌处理48h，随后，以12000rpm的转速离心，除去上清液，随后反复加入蒸馏水清洗原料7次，使得原料为中性，将预处理后的珍珠贝外套膜用蒸馏水浸泡，原料与蒸馏水的质量比为1:8，在温度为100℃的环境中进行水浴提取，最后抽滤除去不溶物，冷冻干燥后获得胶原蛋白。将制得的胶原蛋白以15mg/mL溶解于蒸馏水中，调节pH至7.0，添加胶原蛋白质量2％的胃蛋白酶，置于摇床中酶解6小时，随后于90℃下灭酶10min，冷冻干燥后得到酶解后的胶原蛋白肽1.79g。

取制备好的珍珠贝外套膜胶原蛋白肽750mg溶于5mL蒸馏水中，制成胶原蛋白肽溶液，调节pH至6.5，将硫酸锌溶于蒸馏水配成浓度200mg/mL的溶液，将盐溶液与胶原蛋白肽溶液体积比例为1:6混合，搅拌溶解，在温度为60℃水浴振荡120r/min条件下螯合反应35min，随后在混合液中添加无水乙醇，使得溶液中乙醇终浓度达到85％，于25℃环境中静置60min，于12000rpm下离心10min取沉淀物，后用无水乙醇反复清洗沉淀，离心6次。收集沉淀物于40℃温度下干燥得肽-锌螯合物，最终获得螯合物0.191g。

实施例4

选取新鲜珍珠贝外套膜100g，用蒸馏水清洗除杂后，在2～4℃的温度下切成2cm×2cm大小的块，制得原料。用0.12mol/L的NaOH溶液加入到制备好的珍珠贝外套膜中，原料与NaOH溶液的质量比为1:9，在温度为3℃的环境中，搅拌处理36h，随后，以8000rpm的转速离心，除去上清液，随后反复加入蒸馏水清洗原料6次，使得原料为中性，将预处理后的珍珠贝外套膜用蒸馏水浸泡，原料与蒸馏水的质量比为1:9，在温度为95℃的环境中进行水浴提取，最后抽滤除去不溶物，滤液经冷冻干燥后获得热水提取胶原蛋白。将制得的胶原蛋白以5mg/mL溶解于蒸馏水中，调节pH至5，添加胶原蛋白质量1％的胰蛋白酶，置于摇床中酶解4小时，随后于90℃下灭酶10min，冷冻干燥后得到酶解后的胶原蛋白肽1.32g。

取制备好的胶原蛋白肽1000mg溶于5mL蒸馏水中，制成胶原蛋白肽溶液，调节pH至5.5，将硫酸锌溶于蒸馏水配成浓度80mg/mL的溶液，将盐溶液与胶原蛋白肽溶液体积比例为1:5混合，搅拌溶解，在温度为55℃水浴振荡100r/min条件下螯合反应40min，随后在混合液中添加无水乙醇，使得溶液中乙醇终浓度达到75％，于27℃环境中静置50min，于8000rpm下离心10min取沉淀物，后用无水乙醇反复清洗沉淀，离心7次。收集沉淀物于45℃温度下干燥得肽-锌螯合物，最终获得螯合物0.201g。

从上述实施例中可以看出采用本发明制备的胶原蛋白肽螯合锌的锌螯合率高于其它实施例。

采用本发明方法制成的珍珠贝外套膜胶原蛋白肽的氨基酸组成：

取实施例1制得的胶原蛋白肽10mg和6moL/L浓度的盐酸溶液2mL混合，置于温度为110℃的条件下水解24h。经氨基酸分析仪分析，结果如表1所示。

表1 胶原蛋白肽的氨基酸组成

从表中可以看出，所有氨基酸中含量最多的氨基酸是甘氨酸，约占总氨基数量的30％，脯氨酸和羟脯氨酸的总含量大约占氨基酸总数的20％，具有胶原蛋白特有的性质。此外，与I型胶原蛋白相比，酸性氨基酸、色氨酸和亮氨酸含量较高，有利于跟锌离子螯合。

采用傅里叶红外光谱(FTIR)法分析实施例1制得的肽-锌螯合物和胶原蛋白肽的图谱，见图1。胶原蛋白肽在1655cm^-1处具有由于羰基伸缩振动和氨基弯曲振动所引起的特征吸收峰。而螯合锌离子以后该峰值移到了较低的1639cm^-1频率处，这些结果表明肽中的羰基螯合了锌离子。此外，两个较为明显的振动频率也发生了改变，在胶原蛋白肽中羧基峰值从1404cm^-1移动到了1384cm^-1，同时羟基基团的峰值从3408cm^-1(胶原蛋白肽)处移到了较高频率3446cm^-1(肽-锌螯合物)。这些结果表明锌螯合胶原蛋白肽主要是通过肽键中的羰基氧、羧基氧和羟基氧与锌离子螯合。

为了进一步验证本发明肽-锌螯合物的促进骨形成的作用，进行了体外细胞试验，试验方法及结果如下：

1、MC3T3-E1细胞培养

来源于小鼠颅骨的前成骨细胞MC3T3-E1用含有10％的FBS和1％的青霉素和链霉素的α-MEM培养基在37℃、5％的二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养。当细胞融合度达到90％时用0.25％的胰酶消化后按照1:3的比例进行传代。

2、试验方法及结果

(1)剂量设置与分组：将细胞分为4个组，每组3-5个平行组，分别为胶原蛋白肽组(50μg/mL)、肽-锌螯合组(50μg/mL)、锌离子组(1μM/L)、空白对照组。

(2)成骨细胞增殖试验

用α-MEM培养基将细胞浓度调整至1.5x 10⁴个/mL，按每孔100μL接种于96孔板中，培养24h后弃去原培养液，按上述方案分组加入不同的生长完全培养基继续培养2d，随后每孔添加20μL(5mg/mL)的MTT培养4h，弃去培养基，添加150μL的DMSO充分溶解蓝色甲赞结晶，在490nm下测得吸光度值。

细胞的增殖率(％)＝样品组OD_490nm值/空白对照组OD_490nm值×100

试验结果：各组药物对细胞增殖性的影响结果如表2。

表2 各组药物对细胞增殖性的影响结果

P<0.05，与空白对照组相比

前期实验结果表明不同剂量的锌离子对成骨细胞的增殖的促进作用不同，其中1μM/L条件下效果最佳，且浓度继续升高后促进作用反而降低，因此本发明选择1uM/L浓度的锌离子作对比。与空白对照组相比胶原蛋白肽处理细胞后不能显著促进细胞的增殖性,而肽-锌螯合组和锌离子组均可以显著促进细胞的增殖(P<0.05)。而肽-锌螯合组对细胞的增殖性明显优于锌离子组。

(3)成骨细胞ALP活性的影响

将细胞密度调整为2×10⁴个/mL，按每孔1mL接种于24孔板，24h后按上述方案分组加入不同的分化培养基(含有10mM的β-甘油磷酸钠和50μg/mL的抗坏血酸)培养，期间每隔2d用含有样品的分化培养基换液，培养7d后弃培养液。后用冷却的PBS溶液清洗两次后每孔加入200μL细胞裂解液(1％TritonX-100)，于4℃下裂解30min，其后于12000g/min下离心5min(4℃)，取上清，用p-NPP法测定ALP含量，用BCA试剂盒测蛋白含量。碱性磷酸酶的活性用每克蛋白所释放的酶的活力来表示。

试验结果：各组药物对细胞增殖性的影响结果如表3。

表3 各组试样对促进细胞ALP活性的影响

P<0.05，与空白对照组相比

ALP是成骨细胞分化的标志性产物。分析表3结果得知：与空白对照组相比，胶原蛋白肽组及锌离子组均不能显著的促进细胞ALP分化，但肽-锌螯合组可显著地促进细胞ALP的活性。