阅读说明：本技术 一种从贝类***物中提取贝类dna的方法 (Method for extracting shellfish DNA from shellfish excrement ) 是由 董志国 张敏 茆双 段海宝 冯森磊 孙泽鹏 李雯倩 张冬冬 于 2019-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种从贝类排泄物中提取贝类DNA的方法,该提取方法为采集贝类排泄物置于筛绢网上,ddH<Sub>2</Sub>O缓慢冲洗,加入ddH<Sub>2</Sub>O,吹打成排泄物匀浆,离心取上清液；加入SDS、蛋白酶K,混匀后水浴；加入RNA酶,混匀后水浴,离心取上清液；加入冰冷饱和酚,混匀后水浴,离心取上清液；加入氯仿,混匀后水浴,离心取上清液；加入异丙醇沉淀DNA,混匀,离心,弃上清；加入乙醇漂洗沉淀DNA,混匀,离心,取沉淀干燥,即提取获得贝类DNA。本发明可应用于贝类DNA的无损伤提取,对贝类无刺激无损伤,操作简单,检测准确性高,宜于推广应用。(The invention discloses a method for extracting shellfish DNA from shellfish excrement, which comprises collecting shellfish excrement, placing on a bolting silk net, and adding ddH 2 Slowly flushing with O, adding ddH 2 Blowing and beating the mixture into a drainage homogenate, and centrifuging to obtain a supernatant; adding SDS and proteinase K, mixing uniformly and then carrying out water bath; adding RNA enzyme, mixing, water bathing, centrifuging, and collecting supernatant; adding ice-cold saturated phenol, mixing, water bathing, centrifuging, and collecting supernatant; adding chloroform, mixing, water bathing, centrifuging, and collecting supernatant; adding isopropanol to precipitate DNA, mixing, centrifuging, and removing supernatant; adding ethanol to rinse and precipitate DNA, mixing uniformly, centrifuging, taking precipitate, and drying to obtain shellfish DNA. The invention can be applied to the nondestructive extraction of shellfish DNA, has no stimulation and no damage to shellfish, has simple operation and high detection accuracy, and is suitable for popularization and application.)

一种从贝类***物中提取贝类DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种DNA提取方法，具体地说，涉及一种从贝类***物中提取贝类DNA的方法。

背景技术

贝类养殖业在供应优质蛋白质、提高渔民收入、改善近海环境等方面发挥了重要的作用。与此同时贝类养殖也面临着资源衰竭的问题，越来越多的学者通过分子生物学技术获取贝类DNA并研究其遗传信息，用分子辅助育种的方法达到改善贝类品质，选育贝类抗逆新品的目的，解决贝类资源枯竭的问题。但是，传统的取样方法多集中于伤害性取样或非伤害性取样，如直接解剖、用扩口器开壳、壳上钻孔等，破坏了贝类内部组织结构的完整性，对贝类造成较强的机械损伤甚至致死，不利于贝类后期保种、遗传育种及贝类资源的保护尤其是对濒危珍稀贝类。因此，如何无损伤提取贝类DNA已经成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种从***物中提取贝类DNA的方法，以实现对贝类的无损DNA提取，本发明是这样实现的：

一种从***物中贝类DNA无损伤提取方法，其具体步骤如下：

1、采集贝类***物及前处理：

(1)先将贝类饥饿处理2天，使体内杂质完全排出。投喂食适量的饵料，待排便后，使用虹吸法从池底部收集粪便。

(2)将采集的粪便移至200目筛绢网上，用ddH₂O小心缓慢地冲洗***物表面，以去除表面杂质。取约200mg粪便移至1.5mL离心管，加入约200μL ddH₂O，用吸管吹打成***物匀浆，800r/min离心3min，取上清液。

2、DNA提取：

(1)向上清液中加入400μL 10％SDS和10μLProteinase K，65℃水浴60min至完全消化，每隔10min混匀一次，后加入10μL20mg/mLRNase，37℃水浴10min，12000r/min离心3min，取上清液；

(2)加入等体积的冰冷饱和酚，上下颠倒混匀，室温静置5min，12000r/min离心12min，取上清液；加入等体积氯仿，上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上清液；加入等体积异丙醇，颠倒8次充分混匀，室温放置3min，12000r/min离心5min，弃上清液；

(3)加入1mL 70％的冰冷乙醇漂洗，12000r/min离心3min，弃上清液；重复漂洗一次，离心弃上清液；取沉淀室温干燥，加30μL TE Buffer溶解。

本发明中所述“贝类”是指包括青蛤、文蛤、扇贝、牡蛎等海洋贝类。

有益效果：本发明可应用于贝类DNA的无损伤提取，对贝类无刺激无损伤，操作简单，检测准确性高，宜于推广应用。

附图说明

图1为实施例1采用是本发明提供的方法提取DNA的电泳结果示意图；

图2为实施例2从青蛤粪便中所提取的青蛤DNA采用4对引物PCR扩增电泳检测结果示意图；

图3为实施例3不同浸泡时间和环境温度下青蛤粪便形态变化图；

图4为实施例4不同浸泡时间和环境温度下青蛤粪便DNA的电泳结果示意图；

表1为2对青蛤线粒体DNA引物及2对青蛤核基因组DNA引物。

具体实施方式

实施例1青蛤粪便DNA提取

1、样品采集及前处理

实验组：

(1)随机选取24个青蛤，饥饿处理2天，使青蛤体内杂质完全排出。投喂食适量的小球藻，待青蛤排便后，使用虹吸法从池底部收集青蛤粪便。

(2)将采集的粪便移至200目筛绢网上，用ddH₂O小心缓慢地冲洗粪便表面，以去除表面杂质。

(3)用吸管吸取约200mg粪便，移至离心管，加入约200μL ddH₂O，用吸管吹打成粪便匀浆，800r/min离心3min，取上清液。

获得6份青蛤粪便上清液样品。

阳性对照组：

(1)用已灭菌的解剖剪剪取约25mg青蛤足，在冰上用高速组织研磨器研磨至粉碎。

2、提取青蛤DNA

(1)加入400μL 10％SDS和10μL Proteinase K，65℃水浴60min至完全消化，每隔10min混匀一次，后加入10μL 20mg/mL RNase，37℃水浴10min，12000r/min离心3min，取上清液；

(2)加入等体积的冰冷饱和酚，上下颠倒混匀，室温静置5min，12000r/min离心12min，取上清液；加入等体积氯仿，上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上清液；加入等体积异丙醇，颠倒8次充分混匀，室温放置3min，12000r/min离心5min，弃上清液；

(3)加入1mL 70％的冰冷乙醇漂洗，12000r/min离心3min，弃上清液；重复漂洗一次，离心弃上清液；取沉淀室温干燥，加30μL TE Buffer溶解。

3、电泳检测

将步骤2中所提取的DNA样品进行电泳检测，缓冲溶液1×TAE，功率50W，25min；1％琼脂糖，上样量6μL，电泳检测结果如图1所示，其中M：DNA Marker；N：阴性对照(ddH₂O)；F：阳性对照(青蛤足DNA)；1-6：采用本发明方法从青蛤粪便中所提取的青蛤DNA。

由图1可见，本发明所提取的DNA模板条带均清晰，2、4、5、6条带亮度高，与阳性对照(足DNA)相似，证明了本发明方法提取青蛤DNA的可靠性。

实施例2青蛤线粒体DNA和核基因组DNA扩增检测试验

分别采用表1中2对青蛤线粒体DNA引物及2对青蛤核基因组DNA引物，分别对实施例1提取到的DNA进行PCR产物扩增。

反应体系：模板DNA 1.0μL，上下游各0.3μL，2×TaqPCRMaster Mix 7.5μL，ddH₂O5.9μL。

反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。

缓冲溶液1×TAE，功率50W，15min；1.5％琼脂糖，上样量6μL，4对引物电泳检测结果如图2所示，其中a：CsCOXⅠ；b：Cs16S；c：Cs18S；d：Cspds；M：DNA Marker；N：阴性对照(ddH₂O)；F：阳性对照(青蛤足DNA)；1-6：采用本发明方法从青蛤粪便中所提取的青蛤DNA。

图2检测结果表明，青蛤粪便与足提取扩增结果一致，验证了本发明方法的有效性和可靠性。

实施例3浸泡时间和环境温度对青蛤粪便形态的影响

1、采集青蛤粪便

青蛤排出粪便时，立即收集粪便，粪便样品浸泡于干净的实验用海水中，分别储存于28℃、15℃、4℃环境中。

2、观察粪便形态

分别于0、5、10、15、20和25d吸取少量粪便置于干净的载玻片上，体视镜观察粪便形态并拍照，形态变化结果如图3所示，其中a：28℃组；b：15℃组；c：4℃组。

图3结果表明，粪便形态随浸泡时间和环境温度的影响。新鲜粪便颗粒(0d)为黄绿色圆柱形。在28℃组(图3a)，5d时粪便外源部位出现轻微断裂现象，丝状菌大量生长，逐渐形成菌胶团，较多细菌附着于菌胶团上；在10d和15d时，疏松的粪便颗粒出现明显的断裂，局部结构发生明显的分解；20d时，粪便颗粒断裂部位增多，颗粒物变得更为松散；25d时，完全转化成松散的絮体。在15℃组(图3b)，10d粪便形态没有发生明显断裂，粪便外源部位出现轻微分解现象，逐渐形成菌胶团；从15d到20d，粪便颗粒断裂部位增多，25d出现明显断裂现象。4℃组(图3c)10d内都未出现明显断裂，15d略有疏松，20d和25d粪便外边缘出现轻微断裂现象。

实施例4浸泡时间和环境温度对青蛤粪便DNA提取质量的影响

1、采集青蛤粪便

青蛤排出粪便时，立即收集粪便，粪便样品浸泡于干净的实验用海水中，分别储存于28℃、15℃、4℃环境中。

2、提取青蛤DNA

分别于0、5、10、15、20和25d取约200mg粪便样本进行提取，并以青蛤足DNA为阳性对照，ddH₂O为阴性对照，DNA提取采用实施例1相同的提取方法提取青蛤粪便DNA及青蛤足DNA。

3、电泳检测

将步骤2中所提取的DNA样品进行电泳检测，缓冲溶液1×TAE，功率50W，25min；1％琼脂糖，上样量6μL，电泳检测结果如图4所示，其中a：28℃组；b：15℃组；c：4℃组；M：DNAMarker；N：阴性对照(ddH₂O)；F：阳性对照(青蛤足DNA)；1-12：采用本发明方法从青蛤粪便中所提取的青蛤DNA。

图4检测结果表明，粪便样品在不同环境温度和浸泡时间下，所提取的DNA质量存在显著差异。28℃环境下，粪便样品浸泡5d后开始出现不同程度的降解，但仍有部分样品能够提取较高质量的DNA，而浸泡15、20d的粪便样品提取的DNA质量较差，降解现象较严重(图4a)。15℃环境下，粪便10d后仍能提取出质量较好的DNA，从15d后开始出现不同程度的降解(图4b)。4℃环境下，粪便样品浸泡15d内均能够获得较高质量的DNA(图4c)。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员，可对上述实施例的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。