阅读说明：本技术 高致死基因vATPase B及其防瓢虫应用 (High-lethal gene vATPase B and ladybug-proof application thereof ) 是由 潘慧鹏 吕晶 郭威 杨春晓 郭木娟 陈诗敏 邱宝利 刘卓琦 于 2019-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高致死基因vATPase B及其防瓢虫应用。本发明研究从茄二十八星瓢虫获得一种基因vATPase B,沉默该基因表达能够高效防治茄二十八星瓢虫,因而设计了对茄二十八星瓢虫具有高致死能力的靶标基因dsRNA,即dsvATPase B,对茄二十八星瓢虫具有高致死效应,灵敏性好、杀虫效率高、防治效果好,且使用操作方便,还具有环境友好等诸多优点,对于茄二十八星瓢虫的防治有很好的应用前景。(The invention discloses a high-lethality gene vATPase B and application thereof in preventing ladybug. The invention researches and obtains a gene vATPase B from the ladybug with twenty-eight stars, and silencing the gene expression can efficiently prevent and control the ladybug with twenty-eight stars, so that a target gene dsRNA with high lethal ability to the ladybug with twenty-eight stars, namely dsvATPase B, has high lethal effect to the ladybug with twenty-eight stars, and has the advantages of good sensitivity, high insecticidal efficiency, good prevention and control effect, convenient use and operation, environmental friendliness and the like, and has good application prospect for preventing and controlling the ladybug with twenty-eight stars.)

高致死基因vATPase B及其防瓢虫应用

技术领域

本发明属于虫害防控技术领域。更具体地，涉及一种高致死基因vATPase B 及其防瓢虫应用。

背景技术

茄二十八星瓢虫Henosepilachnavigintioctopunctata(Fabricius)属于鞘翅目瓢虫科，是一种重要的农业害虫，寄主植物十分广泛，主要为害茄子、马铃薯和番茄等茄科蔬菜。其幼虫和成虫均以叶片为食，喜群集于叶片背面，取食下表皮、叶肉，受害叶片通常形成不规则透明斑或穿孔，严重时造成植株萎蔫甚至整株死亡。茄二十八星瓢虫在我国的分布范围广泛，尤其是长江以南发生密度较大。近年来，由于气候变暖、贸易发展以及保护地蔬菜栽培面积的扩大，其食料一年四季不断，茄二十八星瓢虫的发生和为害愈加严重。2015年，我国启动了马铃薯主粮化战略，必将进一步扩大我国马铃薯的种植面积，茄二十八星瓢虫的防治刻不容缓。

目前，茄二十八星瓢虫的防治包括人工捕捉、引诱剂诱杀、化学农药。其中人工捕捉不仅效果差，还有十分繁重的劳力问题；而引诱剂诱杀的效果也不尽如人意，不彻底；因此更多还是依赖于化学农药，但是化学农药会引起环境污染和农产品质量安全等众多问题。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种在进化上保守，依赖于产生的短片段RNAs(siRNAs)，从而促进同源mRNA的降解或抑制其翻译的作用机制。RNAi提供了一个在昆虫中进行功能基因组学研究的重要工具，且为开发对环境友好的害虫治理方法奠定了基础。由于使用RNAi技术可以特异性抑制基因的表达，所以该技术已经广泛应用于靶向干扰害虫基因从而达到防治害虫的目的，但是目前国内外还没有对茄二十八星瓢虫基因功能的研究，未有杀虫活性的靶标基因报道。

本发明人团队前期研究显示(201710949193.9)，利用直接饲喂合适的外源 dsRNA的方式即可实现对瓢虫的毒性，因此从基因层面开发适用于防治茄二十八星瓢虫的外源dsRNA产品，使用方便、成本低，更由于基因的特异性，可实现精确、优异的防治效果，对环境友好，在茄二十八星瓢虫的防治方面具有很大的应用前景。然而，相关靶标基因的筛选，以及防治效果好、特异、稳定的dsRNA 的设计是最大的难题和关键问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有茄二十八星瓢虫防治技术的缺陷和不足，提供一种茄二十八星瓢虫的高致死基因，即vATPase B基因。并基于该基因开发了能够高效防治茄二十八星瓢虫的技术，即直接饲喂对茄二十八星瓢虫具有高致死能力的靶标基因dsRNA，利用dsvATPase B对茄二十八星瓢虫的致死效应达到防治目的。该方法操作方便、有效性和灵敏性好、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。

本发明的目的是提供一种茄二十八星瓢虫vATPase B基因及其防治茄二十八星瓢虫的应用。

本发明另一目的是提供一种可用于防治茄二十八星瓢虫的vATPase B基因的dsRNA及其应用。

本发明再一目的是提供一种防治茄二十八星瓢虫的方法及试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明基于茄二十八星瓢虫的转录组文库，筛选得到一个高致死基因——vATPase B基因，并开发了饲喂vATPase B基因的dsRNA(dsvATPase B) 防治茄二十八星瓢虫的技术。本发明把茄子叶片分别浸泡在试剂盒合成的 dsvATPase B和dsGFP的溶液中，取出晾干后饲喂茄二十八星瓢虫的1龄幼虫2 天，而后以未用dsRNA处理的茄子叶片饲喂，观察记录茄二十八星瓢虫的死亡率和发育状态；另外，用菌液表达dsvATPase B的方法测定了其对茄二十八星瓢虫1龄、3龄以及成虫的致死能力，进而全面的评价外源dsvATPase B对茄二十八星瓢虫的杀虫活性。最后，利用荧光定量PCR(qPCR)的方法检测分析了 vATPase B基因在取食了dsvATPase B和dsGFP茄二十八星瓢虫中的表达量变化。结果显示，直接饲喂外源dsvATPase B可显著抑制茄二十八星瓢虫vATPase B基因表达，直接饲喂外源dsvATPaseB对茄二十八星瓢虫具有很高的致死效应。因此，以下主题及应用均应在本发明保护范围之内：

一种茄二十八星瓢虫vATPase B基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。

所述vATPase B基因在防治茄二十八星瓢虫或制备防治茄二十八星瓢虫的产品中的应用。

所述vATPase B基因在抑制茄二十八星瓢虫生长或制备抑制茄二十八星瓢虫生长的产品中的应用。

所述vATPase B基因在促进茄二十八星瓢虫死亡或制备促进茄二十八星瓢虫死亡的产品中的应用。

所述vATPase B基因的抑制剂在防治茄二十八星瓢虫或制备防治茄二十八星瓢虫的产品中的应用。

一种可用于防治茄二十八星瓢虫的dsRNA，该dsRNA沉默靶基因为上述 vATPase B基因。优选地，所述dsRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

一种防治茄二十八星瓢虫的试剂盒，含有vATPase B基因抑制剂。优选地，所述抑制剂为上述dsRNA。

具体地，利用vATPase B基因防治茄二十八星瓢虫的途径之一，即一种防治茄二十八星瓢虫的方法，直接饲喂外源dsRNA，使得dsvATPase B进入茄二十八星瓢虫体内，该dsRNA可沉默/抑制茄二十八星瓢虫的vATPase B基因表达，抑制茄二十八星瓢虫生长、促进茄二十八星瓢虫死亡，从而达到防治茄二十八星瓢虫的目的。

本发明具有以下有益效果：

本发明筛选得到一种茄二十八星瓢虫的高致死基因vATPase B基因，并开发了其高效沉默dsRNA，开发了能够高效防治茄二十八星瓢虫的技术，即直接饲喂对茄二十八星瓢虫具有高致死能力的靶标基因dsRNA，利用dsvATPase B对茄二十八星瓢虫的致死效应达到防治目的。该方法操作方便、有效性和灵敏性好、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。

附图说明

图1为试剂盒合成的dsGFP和dsvATPase B电泳图。

图2为菌液表达的dsGFP和dsvATPase B电泳图。

图3为取食dsGFP和dsvATPase B后茄二十八星瓢虫存活率的变化；利用实验开始后10天的幼虫死亡率数据，用Cox回归程序建立存活曲线。不同字母 (如a、b)表示对照曲线与处理曲线有显著性差异。

图4为从饲喂dsRNA开始的第6天，dsGFP对照组(A)和dsvATPase B 处理组(B)的表型变化。

图5为沉默vATPase B基因表达对茄二十八星瓢虫生长发育的影响；饲喂dsvATPase B后与对照组相比，处理组茄二十八星瓢虫幼虫的发育受到显著的抑制。

图6为取食菌液表达的dsvATPase B对茄二十八星瓢虫存活率的影响(图A： 1龄幼虫的存活率；图B：3龄幼虫的存活率；图C：成虫的存活率)。利用12 天的幼虫死亡率数据，用Cox回归程序建立存活曲线。不同字母(如a、b)表示对照曲线与处理曲线有显著性差异。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

下述实施例中所用茄二十八星瓢虫，于华南农业大学昆虫学系饲养。饲养茄二十八星瓢虫的茄子为万盛元帅圆茄苗，将瓢虫放与含滤纸的培养皿中，滤纸用棉球保湿，放入人工气候箱中(温度25±1℃，湿度70％-80％，光周期L：D＝14： 10)进行繁殖。

RNA提取利用TRIzol提取法(Invitrogen,USA)，反转录试剂(PrimeScript^TM RTreagent Kit with gDNA Eraser)购自TAKARA生物技术有限公司，dsRNA合成试剂盒(MEGAscript^TM T7)购自Thermo Fisher Scientific，PCR反应体系所用试剂盒(EX Taq^TM)购自TAKARA生物技术有限公司，DNA纯化回收试剂盒 (Universal DNA Purification Kit)购自天根生化科技(北京)有限公司。

实施例1基因vATPase B试剂盒合成dsRNA的获得

我们根据茄二十八星瓢虫的基因组构建其转录组文库，再基于构建的转录组文库，研究筛选与茄二十八星瓢虫生长发育相关基因，筛选得到vATPase B基因片段，如SEQID NO.1所示。然后合成dsRNA。

1、茄二十八星瓢虫总RNA提取及第一链cDNA的合成。

取茄二十八星瓢虫的2龄幼虫10只置于2ml离心管中，利用TRIzol法提取茄二十八星瓢虫的总RNA，利用反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser,TAKARA)依照说明书步骤进行反转录，合成cDNA第一链。

2、引物设计

从茄二十八星瓢虫的转录组文库中得到vATPase B的基因序列，设计 vATPase B基因的dsRNA引物P1(表1)，由广州擎科生物科技有限公司合成。绿色荧光蛋白基因(GFP)从实验室保存的含有GFP的质粒上扩增获得，GFP 基因的dsRNA引物P2(表1)。

表1：dsRNA合成及qPCR引物

PCR扩增的反应体系为10×EX Taq Buffer 5μL、TaKaRa EX Taq 0.25μL、 dNTPMixture 4μL、上游引物(10μmoL·L-1)1μL、下游引物(10μmoL·L-1) 1μL、cDNA/GFP质粒1μL，dd H2O补齐至50μL。

PCR扩增的反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸1min，供30个循环；72℃延伸5min。将扩增产物置于4℃保存。程序反应完成后，利用琼脂糖凝胶电泳法对扩增结果进行检测。

以上述合成的cDNA作为模版，利用P1引物进行PCR扩增反应，得到大小为473bp的PCR扩增产物，经测序并删去T7启动子序列后，得到大小为433bp 的核苷酸序列即为目的基因vATPase B，如SEQ ID NO.2所示。

以载有GFP的质粒为模版，用P2引物进行扩增，得到大小为507bp的PCR 产物。

3、vATPase B基因和GFP基因的dsRNAs制备

用DNA纯化回收试剂盒(Universal DNA Purification Kit,TIANGEN)回收纯化上述2得到的两种PCR产物，作为体外转录dsRNA的模版，dsRNA的体外转录体系为10×Reaction Buffer 5μL、(ATP、GTP、CTP、UTP)溶液各5μL、 Enzyme mix 5μL、模版20μL，ddH₂O补足至50μL。37℃放置4h。反应结束后加入2.5μL的TURBO DNase去除残留的模版DNA和单链RNA，然后纯化 dsRNA，最后用50μL ddH₂O溶解dsRNA，分别得到dsvATPase B和dsGFP。

茄二十八星瓢虫的vATPaseBdsRNA测序结果如下：

茄二十八星瓢虫的vATPaseBdsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1，其反义链的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1的反向互补序列。

GFP dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2，其反义链的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.2 的反向互补序列。

实施例2基因vATPase B菌液表达dsRNA的获得

1、dsvATPase B与L4440表达载体的构建

在L4440的序列上选择两个酶切位点，分别为BamHI(GGATCC)和SacI (GAGCTC)。根据L4440的序列信息(此序列信息已经公开)，在dsvATPase B的引物P1和dsGFP的引物P2上分别加上与两个酶切位点相关的同源臂，设计与dsvATPase B构建表达载体相关的引物P3，与dsGFP构建表达载体相关的引物P4(表1)。以实施例2中的cDNA为模板，PCR扩增的反应体系及扩增程序如实施例2中所示，得到构建载体的dsvATPase B和dsGFP的目的片段，用DNA纯化回收试剂盒(Universal DNA Purification Kit,TIANGEN)回收上述得到的两种PCR产物。根据两个酶切位点的序列利用QuickCut^TM SacI和 QuickCut^TM BamHI将L4440载体线性化，酶切的反应体系详见说明书，酶切反应完成后，用DNA纯化回收试剂盒(Universal DNAPurification Kit,TIANGEN) 回收线性化的L4440载体。

利用广州擎科生物科技有限公司的Trelief^TMSoSoo Cloning Kit Ver.2试剂盒分别将dsGFP和dsvATPase B与线性化的L4440载体在50℃反应20min，进行重组。随后将含有dsvATPase B和dsGFP的重组表达载体导入到HT115感受态细胞中，置于冰上放置30min，随后37℃热激1min；在冰上静置3min，然后加入不含氨苄的LB液体培养基700μL，在37℃，210rpm的条件下培养1h，之后用含有氨苄和四环素的LB平板过夜培养。挑取单菌落放置在4ml含有氨苄 (100μg/mL)和四环素(10μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，210rpm培养 12h，然后取50μL转移到5mL含有氨苄(100μg/mL)和四环素(10μg/mL) 的LB液体培养基中，37℃，210rpm培养3h，使菌液的OD值在0.5-0.8之间，加入1mM的IPTG，37℃，120rpm培养5h，诱导dsRNA。

将含有dsGFP和dsvATPase B的两种菌液，在4℃，5000rpm的条件下收集菌丝，利用TRIzol提取法(Invitrogen,USA)提取RNA，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，验证是否成功诱导dsRNA，如图1所示。

实施例3 dsRNA在抑制茄二十八星瓢虫生长发育中的应用

1、茄二十八星瓢虫寄主植物和人工孵育器的准备

饲喂茄二十八星瓢虫的茄子品种为万盛元帅圆茄苗，人工孵育器为放有滤纸和加湿棉球的90mm培养皿。

2、试剂盒合成的dsvATPase B在抑制茄二十八星瓢虫生长发育中的应用

茄二十八星瓢虫dsvATPase B喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中放入10只茄二十八星瓢虫的1龄幼虫。分别用试剂盒合成的浓度50ng/μL、100 ng/μL、250ng/μL和500ng/μL的dsvATPase B溶液浸泡直径12mm的圆形茄子叶盘1min，风干1h后饲喂幼虫，每隔24h更换一次叶盘，连续饲喂dsvATPase B浸泡的叶盘两天后，用正常茄子叶片饲喂幼虫。

茄二十八星瓢虫dsGFP喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中放入10 只茄二十八星瓢虫的1龄幼虫。用试剂盒合成的浓度500ng/uL的dsGFP溶液浸泡直径12mm的圆形茄子叶盘1min，风干1h后饲喂幼虫，每隔24h更换一次叶盘，连续饲喂dsGFP浸泡的叶盘两天后，用未经处理的茄子叶片饲喂幼虫。

每组设置5个重复，每隔24h统计每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡数目，并更换新的叶片，培养皿置于人工气候箱(温度25±1℃，湿度70％-80％，光周期L：D＝14：10)。统计各组每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡个数，计算对照组和不同浓度dsRNA处理下茄二十八星瓢虫的存活率变化，使用Excel 2010对茄二十八星瓢虫的存活率进行统计，利用SPSS 19.0软件采用Cox回归分析的方法作图(如图2)。

由结果可知，连续饲喂茄二十八星瓢虫1龄幼虫dsRNA两天后，茄二十八星瓢虫1龄幼虫的存活率随着时间的增加而呈现下降的趋势，处理组的饲喂浓度分别是10ng/μL、50ng/μL、250ng/μL和500ng/μL，对照组的饲喂浓度为500 ng/μL。不同浓度的处理组与对照组之间均存在显著差异(χ2＝101.448,df＝4,P< 0.0001)。当处理组饲喂浓度为10ng/μL(P<0.0001,Exp(B)＝6.540)时与浓度为50ng/μL(P<0.0001,Exp(B)＝15.496)、250ng/μL(P<0.0001,Exp(B)＝ 18.179)和500ng/μL(P<0.0001,Exp(B)＝19.436)的各组之间差异显著，其它浓度的处理组之间不存在显著差异。从统计的结果中可以得到以下结论，当处理组的浓度分别为500ng/μL，250ng/μL，50ng/μL和10ng/μL时与对照组相比死亡率分别增加19.436倍，18.179倍，15.496倍和6.540倍。

用显微镜观察饲喂dsvATPase B和dsGFP两天后，茄二十八星瓢虫表型特征的变化。发现从饲喂dsvATPase B开始的第6天，dsGFP对照组的茄二十八星瓢虫正常进入3龄阶段，但处理组中的幼虫无法正常蜕皮进入3龄阶段而死亡，表型特征表现为全身的枝刺弯曲并呈现黑化的状态如图3所示，说明取食 dsvATPase B能够在茄二十八星瓢虫的体内引发强烈的RNAi效应，导致瓢虫死亡。其中，在处理组的浓度为10ng/μL时，引起较低的死亡率(在第10天死亡率为50％)，在此浓度下观察到饲喂dsvATPase B影响茄二十八星瓢虫的生长发育如图5所示，从饲喂dsRNA开始的第3天、6天、9天对照组分别进入2龄、 3龄、4龄，而处理组的茄二十八星瓢虫，在第3天进入2龄后，一直处于2龄状态，直至死亡(如图4所示)。

3、菌液表达的dsvATPase B在对茄二十八星瓢虫致死中的应用

茄二十八星瓢虫dsvATPase B喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中分别放入10只1龄幼虫、10只3龄幼虫、5只成虫，一共设置3组实验，每组设置5个重复。用表达dsvATPase B的菌液浸泡直径12mm的圆形茄子叶盘1min，室温风干1h后饲喂幼虫。处理组中的1龄幼虫每个培养皿中放置2片叶盘；3 龄幼虫的每个培养皿中放置5片叶盘；成虫的每个培养皿中放置5片叶盘。每隔 24h更换一次叶盘，连续饲喂dsvATPase B菌液浸泡的叶盘两天后，用正常茄子叶片饲喂。

茄二十八星瓢虫dsGFP喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中放入10 只1龄幼虫、10只3龄幼虫、5只成虫，一共设置3组对照，每组设置5个重复。用表达dsGFP的菌液浸泡直径12mm的圆形茄子叶片1min，室温风干1h后饲喂幼虫。对照组中的1龄幼虫每个培养皿中放置2片叶盘；3龄幼虫的每个培养皿中放置5片叶盘；成虫的每个培养皿中放置5片叶盘。每隔24h更换一次叶盘，连续饲喂dsGFP菌液浸泡的叶盘两天后，用正常茄子叶片饲喂。

每隔24h统计每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡数目，并更换新的叶片，培养皿置于人工气候箱(温度25±1℃，湿度70％-80％，光周期L：D＝14：10)。统计各组每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡个数，计算对照和不同处理组茄二十八星瓢虫存活率的变化，使用Excel 2010对茄二十八星瓢虫的存活率进行统计，利用SPSS 19.0软件采用Cox回归分析作图(如图5)。

根据统计的结果可知(如图6)，连续取食茄二十八星瓢虫菌液表达的 dsvATPaseB两天后，1龄幼虫(P<0.0001,Exp(B)＝13.068)，3龄幼虫(P<0.0001, Exp(B)＝15.258)和成虫(P＝0.021,Exp(B)＝6.001)的存活率和对照组相比均存在显著性的差异，处理组的1龄幼虫，3龄幼虫和成虫与对照组相比死亡率分别增加了13.068倍，15.258倍和6.001倍。

实施例4 dsvATPase B抑制茄二十八星瓢虫体内vATPase B基因的表达

根据vATPase B基因的序列，设计vATPase B基因的qPCR引物P5，内参基因GAPDH的qPCR引物P6(表1)。

分别在开始取食dsRNA后的第2天和第4天，收集用10ng/μL dsvATPase B 和dsGFP处理的茄二十八星瓢虫1龄幼虫，每个处理收集3个生物学重复。提取收集的茄二十八星瓢虫的RNA，反转录成cDNA，稀释10倍作为qPCR的模版。以P5和P6作为引物进行qPCR分析。

qPCR体系为(15μL)包含5.25μL的ddH2O，7.5μL的2×SYBR Green MasterMix(BIO-RAD Inc,Hercules,CA)，4μM引物和1.0μL的cDNA第一链模版。qPCR的反应仪器Bio-RadC1000 Real-Time PCR system(BIO-RAD,USA)。反应条件为95℃5min；95℃10s，60℃30s，39个循环，每个样本3个技术重复，反应在96孔板(BIO-RAD,USA)中进行。最终的结果计算采用2^-ΔΔCt法 (Ct表示循环数)进行计算。应用单因素方差分析进行数据统计。

以取食dsGFP为对照，分别统计取食dsvATPase B 2天和4天后，茄二十八星瓢虫体内vATPase B基因的相对表达量变化(如图6)。从图6中可以看出取食dsvATPase B的茄二十八星瓢虫体内vATPase B基因的表达量，与饲喂dsGFP 的茄二十八星瓢虫体内vATPase B基因的表达量相比，呈现明显的下降趋势。并且在第2天，处理组与对照组相比，vATPase B基因的表达量下降了9.8倍(F_1,4＝1727.253,P<0.0001)；在第4天，处理组和对照组相比，vATPase B基因的表达量下降了13.1倍(F_1,4＝9762.102,P<0.0001)，进一步说明通过饲喂dsvATPase B能够在茄二十八星瓢虫体内引起强烈的RNAi效应，导致体内vATPase B基因的表达量明显降低，进而导致茄二十八星瓢虫发育受到抑制或死亡。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 高致死基因vATPase B及其防瓢虫应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 433

<212> DNA

<213> vATPase B基因片段

<400> 1

cctgatttga cgggctacat cactgaaggc caaatctata ttgacagaca gctccacaac 60

agacaaattt accccccaat caacgtatta ccgtctctgt ctcgtttgat gaagtctgcc 120

attggtgaag gaatgacaag aaaagaccac tctgatgtct ccaatcagct gtatgcttgt 180

tatgctattg gtaaagatgt gcaagctatg aaagctgttg ttggtgaaga agctcttact 240

ccagatgatt tgctctacct ggaattctta acgaaatttg aaaagaactt catcactcag 300

ggtaattatg aaaaccgtac tgtctttgag tcactggata ttggttggca actactccgc 360

atcttcccta aggaaatgtt gaaacgtatt cctgcagcca ccctcgcaga attttaccca 420

agagattcac gcc 433

<210> 2

<211> 467

<212> DNA

<213> GFP基因片段

<400> 2

cttgaagttg accttgatgc cattcttttg cttgtcggcc atgatgtaca cattgtggga 60

gttatagttg tattccagct tgtggccgag aatgtttcca tcctccttaa agtcaatgcc 120

cttcagctcg attctattca ccagggtgtc accttcgaac ttgacttcag cgcgggtctt 180

gtagttcccg tcatctttga aaaagatggt tctctcctgc acatagccct cgggcatggc 240

gctcttgaaa aagtcatgct gcttcatatg gtctgggtat ctggaaaagc actgcacgcc 300

ataggtgaag gtagtgacca gtgttggcca tggcacaggg agctttccag tggtgcagat 360

gaatttcagg gtgagctttc cgtatgtggc atcaccttca ccctctccgc tgacagaaaa 420

tttgtgccca ttcacatcgc catccagttc cacgagaatt gggacca 467

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> P1-F

<400> 3

taatacgact cactataggg cctgatttga cgggctacat 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> P1-R

<400> 4

taatacgact cactataggg ggcgtgaatc tcttgggtaa 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> P2-F

<400> 5

taatacgact cactatagga agttcagcgt gtccggcgag 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> P2-R

<400> 6

taatacgact cactataggt tcacgttgat gccgttcttc 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> P3-F

<400> 7

ctgatatcat cgatgaattc cctgatttga cgggctacat 40

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> P3-R

<400> 8

cgaattcctg cagcccgggg gcgtgaatct cttgggtaa 39

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> P4-F

<400> 9

ctgatatcat cgatgaattc aagttcagcg tgtccggcga g 41

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> P4-R

<400> 10

cgaattcctg cagcccgggt tcacgttgat gccgttcttc 40

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> P5-F

<400> 11

agcatccttc gctcgtttag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> P5-R

<400> 12

ttcgacaacc tgccattagg 20

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<212> DNA

<213> P6-F

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