阅读说明：本技术 一种水解酶基因strB及其编码的蛋白质和应用 (Hydrolase gene strB and protein coded by same and application ) 是由 李绮婷 陈少华 张文平 黄耀华 占卉 林子秋 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种水解酶基因strB及其编码的蛋白质和应用。所述水解酶基因strB全长为987bp,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码产物水解酶StrB含328个氨基酸,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。StrB能催化降解溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯键的农药。生产的酶制剂可用于蔬菜、水果、烟草和茶叶等农产品中的农药残留去除,提高农产品品质及增加附加值。水解酶基因strB可进一步用于构建转基因作物彻底解决农业生产中农药残留超标问题,生产无公害绿色农产品；也可用于修复酯类农药污染的土壤、水体等自然环境,具有广阔的应用前景。(The invention discloses a hydrolase gene strB, and a protein coded by the hydrolase gene strB and application of the hydrolase gene strB. The total length of the hydrolase gene StrB is 987bp, the nucleotide sequence is shown as SEQ ID No.1, the encoded product hydrolase StrB contains 328 amino acids, and the amino acid sequence is shown as SEQ ID No. 2.StrB can catalyze and degrade deltamethrin, fenpropathrin, lambda-cyhalothrin, kresoxim-methyl, pyraclostrobin, azoxystrobin and other pesticides containing ester bonds. The produced enzyme preparation can be used for removing pesticide residues in agricultural products such as vegetables, fruits, tobacco, tea leaves and the like, so that the quality of the agricultural products is improved and the additional value is increased. The hydrolase gene strB can be further used for constructing transgenic crops to thoroughly solve the problem of overproof pesticide residues in agricultural production and produce pollution-free green agricultural products; can also be used for restoring natural environments such as soil, water and the like polluted by ester pesticides, and has wide application prospect.)

一种水解酶基因strB及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及一种水解酶基因strB及其编码的蛋白质和应用，用于农作物中农药残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境。

背景技术

农药的使用是一把双刃剑。酯类农药(主要包括拟除虫菊酯类农药和等甲氧基丙烯酸酯类农药等)的大量、频繁使用已给生态环境和人类健康带来巨大威胁。大量研究表明，酯类农药大都具有蓄积毒性，长期接触即使低剂量也会引起慢性疾病。该类农药对家蚕、蜜蜂和鸟类等农业有益生物和鱼类等水生生物毒性较大，此外，酯类农药残留地表水对淡水生物多样性和生态系统有巨大的破坏作用。因此，酯类农药残留已经成为人类健康和生态环境一个新兴的全球威胁。

生物降解技术(Biodegradation)可用于去除环境及农产品中各类有机污染物，与传统化学、物理处理方法相比具有操作简便、经济实用、无二次污染等优点。因此，研究利用微生物降解菌剂或酶制剂产品治理农药残留污染已成为近年来研究的热点。目前许多发达国家和大公司企业都投入巨资以从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国BCI公司、美国工程服务生物修复公司已经将降解制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸易发展有限公司已成功生产“比亚”降解酶制剂可用于去除有机磷类农药残留。

降解酶比降解菌具有明显的优势，一是降解酶通常比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件；再者，降解酶的降解效果远胜于微生物本身，尤其是对低浓度农药。因此，降解酶降解效能高，能有效利用低浓度的农药，环境适合度高，环境风险性低是国际上残留农药处理技术研究的前沿和热点。但是，目前还鲜有针对酯类农药残留的生物降解制剂产品。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一个新的降解酯类农药的水解酶基因strB，该基因可用于农作物中农药残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境。

本发明的另一目的是提供该基因编码蛋白质。

本发明又一目的是提供该基因及其编码的蛋白质的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一个能降解含酯键农药的水解酶基因strB，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述水解酶基因strB是从一株能够降解含酯键农药的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株Bt-1中克隆得到。所述菌株已于2013年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号是CCTCC M 2013680。发明人通过质谱分析发现：菌株Bt-1可以使溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯键的农药的酯键发生断裂，使其失去农药毒性。

从菌株中克隆水解酶基因strB的具体方法为转座子标签法。菌株Bt-1能在基础培养基平板上利用高效氯氟氰菊酯等农药为唯一碳源生长，通过构建基因组文库后，利用降解过程中产生水解圈与否筛选降解基因，并利用PCR技术克隆目的基因片段，然后再进行功能验证。

用上面的策略筛选到一株在基础培养基加农药的平板上产生水解圈的目标菌株，进一步的降解实验表明该菌株不能降解高效氯氟氰菊酯等农药。设计引物，进行PCR，该基因是功能未知的水解酶基因，全长为987bp(编码328个氨基酸)，命名为strB。这是一个新的降解农药的水解酶基因。

一个能降解含酯键农药的水解酶StrB，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

含有如上所述水解酶基因strB的重组克隆载体pET-28b-strB，将如上所述的水解酶基因strB的核酸片段***pET-28b的BamHI和XhoI位点之间所得。

含有如上所述能降解含酯键农药的水解酶基因strB的重组表达载体pET-28b-His-strB，所述的重组表达载体优选将所述的水解酶基因strB的核苷酸片段***pET-28b的BamHI和XhoI位点之间所得。

含有如上所述能降解含酯键农药的水解酶基因strB的基因工程菌。

所述的基因工程菌优选以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株。

如上所述水解酶基因strB在降解农作物、农产品、土壤、水体中含酯键农药的应用。

如上所述水解酶基因strB在构建降解含酯键农药的转基因作物中的应用。

如上所述水解酶StrB在去除农作物、农产品、土壤、水体中含酯键农药残留的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用转座子标签法成功从一株苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株Bt-1中克隆出降解含酯键农药的水解酶基因strB。在GenBank比对结果表明该基因为一个新的降解农药的水解酶基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为987bp，编码328个氨基酸。

本发明提供的水解酶StrB能催化降解溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯键的农药。生产的酶制剂可用于蔬菜、水果、茶叶、棉花、烟草等农产品中的农药残留去除，提高农产品品质及增加附加值。

水解酶基因strB可进一步用于构建转基因作物彻底解决农业生产中农药残留超标问题，生产无公害绿色农产品；也可用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境，解决环境污染问题，保护生态环境和人类健康。

附图说明

图1.E.coli BL21(DE3)/pET-28b-strB表达体系小量表达

图2.StrB蛋白的纯化电泳结果图

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例中使用的微生物来源如下：

大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和大肠杆菌高表达载体pET-28b由华南农业大学广东省微生物信号与作物病害防控实验室保存。

能够降解含酯键农药的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株Bt-1已于2013年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号是CCTCC M 2013680；保藏地址为中国武汉，武汉大学。

实施例1

水解酶基因strB的克隆

S1.基因组文库的构建

通过构建基因组文库，提取苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株Bt-1的基因组，并进行酶切，利用降解过程中产生水解圈与否筛选降解基因。通过这种方法获得含有降解功能的目标株。

S2.PCR系列扩增

设计引物，利用PCR技术进行扩增，直至获得降解基因的完整序列。通过BlastX比对初步确定基因功能。

S3.水解酶基因strB的克隆及功能验证

将扩增获得的目的基因序列用DNAStar的Seqman软件进行序列拼接，使用FramePlot 3.0beta在线软件和CLONE软件分析DNA序列的开放阅读框(ORFs)。使用BLAST在线搜索分析目的蛋白氨基酸序列，并与蛋白数据库中的已知氨基酸序列进行比对。将目的蛋白的氨基酸序列通过在线网络资源SMART及其他网络资源进行蛋白质结构域的分析，从而对目的基因进行功能预测并作图，判断整个降解相关基因的完整序列。通过直接在大肠杆菌E.coli DH5α中表达降解基因进行功能验证。获得的水解酶基因strB的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2

水解酶基因strB在E.coli BL21(DE3)中的高效表达(见图1和图2)

S1.水解酶基因E.coli BL21(DE3)的PCR扩增

以正向引物strB-F：5'-TAGCCCGGATCCGATGTGTACTAGTTTGACATTAGAG-3'(SEQ IDNO.3)和反向引物strB-R：5'-TCCGTCTCGAGGTTCTCATAAAATATTTTTTGTTTTCGT-3'(SEQ IDNO.4)为引物，使用PCR方法从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株Bt-1的总DNA中扩增出水解酶基因strB片段。

PCR扩增体系：

PCR扩增程序：

95℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min 30s，进行34个循环后，于72℃延伸5min，最后16℃保存。

S2.PCR产物使用BamH I和Xho I双酶切

酶切体系：

置于37℃水浴中反应2h以上。

酶切产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

S3.pET-28b-His-strB使用BamHI和XhoI双酶切，具体操作同S2所述操作。

S4.转化和表达：将S2中回收片段和S3中酶切好的pET-28b-His-strB进行酶连。

连接体系：

酶连好的水解酶基因strB的pET-28b-His-strB重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)获得重组表达菌。

S5.验证阳性转化子表达产物对高效氯氟氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解功能。

阳性转化子在LB培养基中培养至OD₆₀₀ 0.5时，加IPTG至浓度0.5mM，18℃低温诱导过夜。在50mL基础培养基(g·L^-1)((NH₄)₂SO₄,2；MgSO₄,0.2；CaCl₂,0.01；FeSO₄,0.005；MnCl₂,0.002；K₂HPO₄,10.5；KH₂PO₄,4.5)中加入50mg/L高效氯氟氰菊酯，0.2g/L接种量接入阳性转化子培养液，30℃振荡培养5d。对照为含空载体的大肠杆菌DH5α。

使用丙酮超声提取高效氯氟氰菊酯，并使用石油醚萃取培养液，重复萃取3次，滤液并入烧瓶中，50℃恒温浓缩，将浓缩液全部转入5mL刻度试管中，并用3mL甲醇分3次洗涤圆底烧瓶，定容至5mL，取2mL经0.45μm微孔滤膜有机膜注射式过滤器过滤，滤液收集于进样瓶中，使用高效液相色谱仪(HPLC)测定其残留量，检测条件如下：C₁₈反相色谱柱(250nm×4.60mm,5μm)，流速为1mL/min，柱温为25℃，流动相为乙腈﹕水＝90﹕10(v﹕v)，扫描波长为190～400nm，进样量为10μL。结果显示：基因工程菌对50mg/L高效氯氟氰菊酯5d的降解率达到83.7％。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种水解酶基因strB及其编码的蛋白质和应用

<130> 0

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atgtgtacta gtttgacatt agagacaaaa aacggtcagc atctttttgc aagaacgatg 60

gacttcacat tagatttgaa tcaagaagta atagtcattc ctcgacatta tcagtggaat 120

aatataactg gtgaaatcat taatacgaaa catgctacgg tcggaatggg aattaatcat 180

caaggaagga tcattatggc ggacggagta aatgaagcgg gtatgacatg tgcgacactc 240

tattttccag gattcgctac ttatagtcaa agcgtaggtg acaataaaac gaatttggct 300

ccatttgatt ttgtgacttg gagtctgaca caattcaact ctgtcaaaga gttaaaggaa 360

tctgtagata gccttacctt tttggatata ccattaccgg atttaggact tacgccacca 420

ctacattgga ttttagcgga taaatgggga gattgcattg tactggagcc gacaaatgaa 480

ggattaaaaa tgtatgacaa cccactagga gtgatgacga atagtccgga gtttaattgg 540

catttacaaa atttaagaca atatataggc cttaaatcgc agccattcgc gccaacagag 600

tggagtaact tatcattaag tgcttttggt cagggatcgg gctcaatggg acttccagga 660

gatttcaccc cgccatcaag gtttgtacgg gcagcatatg gcaaacaaaa cattcaaggt 720

atagatagcg aagaagaggg agtaacggcc ctttttcata ttttatcaaa ttgtgaggtt 780

cctaaaggcg gagtaataac agaagaaggg gcattagata atactatata tacaagcgta 840

atgtgtatgg agtccggaac atattattat catacctacg attgtagaca aattatagct 900

attcatttat ttcatgaaaa tttagataca gatgagatta aagcttatcc gttccaacga 960

aaacaaaaaa tattttatga gaactaa 987

<210> 2

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Met Cys Thr Ser Leu Thr Leu Glu Thr Lys Asn Gly Gln His Leu Phe

1 5 10 15

Ala Arg Thr Met Asp Phe Thr Leu Asp Leu Asn Gln Glu Val Ile Val

20 25 30

Ile Pro Arg His Tyr Gln Trp Asn Asn Ile Thr Gly Glu Ile Ile Asn

35 40 45

Thr Lys His Ala Thr Val Gly Met Gly Ile Asn His Gln Gly Arg Ile

50 55 60

Ile Met Ala Asp Gly Val Asn Glu Ala Gly Met Thr Cys Ala Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Phe Pro Gly Phe Ala Thr Tyr Ser Gln Ser Val Gly Asp Asn Lys

85 90 95

Thr Asn Leu Ala Pro Phe Asp Phe Val Thr Trp Ser Leu Thr Gln Phe

100 105 110

Asn Ser Val Lys Glu Leu Lys Glu Ser Val Asp Ser Leu Thr Phe Leu

115 120 125

Asp Ile Pro Leu Pro Asp Leu Gly Leu Thr Pro Pro Leu His Trp Ile

130 135 140

Leu Ala Asp Lys Trp Gly Asp Cys Ile Val Leu Glu Pro Thr Asn Glu

145 150 155 160

Gly Leu Lys Met Tyr Asp Asn Pro Leu Gly Val Met Thr Asn Ser Pro

165 170 175

Glu Phe Asn Trp His Leu Gln Asn Leu Arg Gln Tyr Ile Gly Leu Lys

180 185 190

Ser Gln Pro Phe Ala Pro Thr Glu Trp Ser Asn Leu Ser Leu Ser Ala

195 200 205

Phe Gly Gln Gly Ser Gly Ser Met Gly Leu Pro Gly Asp Phe Thr Pro

210 215 220

Pro Ser Arg Phe Val Arg Ala Ala Tyr Gly Lys Gln Asn Ile Gln Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ser Glu Glu Glu Gly Val Thr Ala Leu Phe His Ile Leu Ser

245 250 255

Asn Cys Glu Val Pro Lys Gly Gly Val Ile Thr Glu Glu Gly Ala Leu

260 265 270

Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Ser Val Met Cys Met Glu Ser Gly Thr Tyr

275 280 285

Tyr Tyr His Thr Tyr Asp Cys Arg Gln Ile Ile Ala Ile His Leu Phe

290 295 300

His Glu Asn Leu Asp Thr Asp Glu Ile Lys Ala Tyr Pro Phe Gln Arg

305 310 315 320

Lys Gln Lys Ile Phe Tyr Glu Asn

325

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 3

tagcccggat ccgatgtgta ctagtttgac attagag 37

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 4

tccgtctcga ggttctcata aaatattttt tgttttcgt 39