阅读说明：本技术 一种纤维素外切酶人工合成基因及其蛋白和重组载体 (Cellulose exonuclease artificial synthetic gene and its protein and recombinant vector ) 是由 李洪波 胡兴 董海丽 洪樱 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种编码纤维素外切酶的人工合成基因,该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建重组载体并转化酵母,可实现该重组纤维素外切酶在甲醇诱导下的分泌表达,通过镍亲和纯化,可得到纯度高于95％活性重组纤维素外切酶蛋白,该活性蛋白具有水解纤维素并产生葡萄糖的能力。(The invention relates to an artificial synthetic gene for coding cellulose exonuclease, which at least contains a DNA sheet with one of the following nucleotide sequences: 1) the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 in the sequence table; 2) a nucleotide sequence which has more than 90 percent of homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1 and codes the protein with the same biological function. According to the gene sequence disclosed by the invention, a recombinant vector is further constructed and yeast is transformed, so that the secretory expression of the recombinant cellulose exonuclease under the induction of methanol can be realized, and the active recombinant cellulose exonuclease protein with the purity higher than 95% can be obtained through nickel affinity purification, and the active protein has the capacity of hydrolyzing cellulose and generating glucose.)

一种纤维素外切酶人工合成基因及其蛋白和重组载体

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种纤维素外切酶人工合成基因及其蛋白和重组载体。

背景技术

纤维素是自然界中最丰富的天然有机物，堪称为世界上总量最大的可再生资源。我国仅农作物秸秆年产量就高达6×10⁸～7×10⁸吨，但这些宝贵的纤维素资源并没有被有效地利用。纤维素只有被降解成小分子多糖或葡萄糖才能被利用。利用微生物产生的纤维素酶来分解纤维素是一种高效且环保的方法。纤维素酶属于糖苷水解酶类，专门催化水解纤维素链中β-1，4-糖苷键。

根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。非复合体纤维素酶由外切糖苷水解酶、外切糖苷水解酶和β-葡聚糖苷酶组成。外切葡聚糖酶，可以随机切割纤维素链产生不同长度的寡糖和新的末端；外切葡聚糖酶，作用于外切葡聚糖酶切割形成的多糖链的末端，产生葡萄糖和纤维二糖；β-葡萄糖苷酶，水解纤维二糖生成2分子的葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、植物、动物等众多生物体都能产生纤维素酶。可以通过利用生物体产生的纤维素酶添加到纤维素原料中来利用这些原料，因此如何大量生产纤维素酶就成了制约纤维素利用的主要瓶颈。

我国土地少且人口多，随着人们生活水平的提高，对肉、蛋白、奶等食物的需求不断提升，人畜争粮的矛盾十分突出。因此，要保持我国饲料、畜牧业的持续发展，必须解决好饲料问题。纤维素是自然界中十分丰富的资源，但纤维素酶的工业化生产受到酶效率低、热稳定性差以及成本较高等诸多因素的限制。随着生物技术的发展，利用基因工程手段开发高活性、高产量的纤维素酶资源越来越受到国内外学者的重视。目前，纤维素酶基因的克隆及表达已经取得了很大的进展，但是还有很大的空间值得人们去研究，开发出越来越多的高活性、高产量的纤维素酶。由于市售纤维素酶往往是众多酶的混合物，很难买到完全由纤维素酶类组成的酶制剂，因此利用基因工程手段逐一生产构成纤维素酶的单体酶成分，再将它们按适当比例混合，是生产纯纤维素酶的可行途径之一。在申请号为CN201811238622.2中，以pET32为表达载体利用BL21为表达菌株对纤维素外切酶进行了表达并纯化得到一定量活性好的重组蛋白，但利用上述载体表达的蛋白都是胞内蛋白，纯化时需要先破碎菌体，纯化步骤比较麻烦且回收率较低。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种纤维素外切酶重组基因及其制备蛋白的方法与应用。

1、本发明提供基因，为编码纤维素外切酶类蛋白的基因，为如下(1)-(2)中任意一种的DNA分子：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(2)与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有96％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有97％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有99％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，序列表中的SEQ ID No.1由1545个脱氧核苷酸组成，本序列包括纤维素外切酶基因的成熟蛋白全长读码框和6个组氨酸残基组成的表达标签和终止密码子，编码具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

2、由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。

本发明提供一种纤维素外切酶蛋白，是如下(1)或(2)所述的蛋白：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由序列2衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由514个氨基酸残基组成，其中前508个氨基酸残基为成熟纤维素外切酶蛋白氨基酸序列，后6个氨基酸残基为组氨酸组成的表达标签，其编码基因的读码框包含1545个核苷酸。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

3、含有上述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

进一步，所述重组载体由空载体和***该空载体的目的基因组成，具体为将上述基因合成后直接***表达空载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。

进一步，所述重组载体具体为将上述基因***表达空载体pPICZαA的Xho I和XbaI双酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

4、本发明的第四个发明目的是提供一种制备纤维素外切酶蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZαA分别用Xho I和Xba I双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在18℃连接，得重组载体pPICZαA-纤维素外切酶；

S2：将所述重组载体pPICZαA-纤维素外切酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：将所述阳性克隆转接至含有1500μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有5ml BMGY培养液的50毫升离心管培养高抗性的转化子，28℃、250rpm培养至OD₆₀₀＝8左右，离心收集菌体并加入1ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl(质量分数1～1.5％)的甲醇，诱导结束后，离心取上清，取上清液10μl，SDS-PAGE检测目标蛋白的表达情况；

S4：将筛选得到的高水平分泌表达目标蛋白的转化子利用BMMY扩大诱导表达，用于大量分泌纤维素外切酶重组蛋白。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至7.5，以大于或等于15000g的转速离心30分钟，将获得的上清液加入到经pH 8Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH 7.5的含10mM Tris-HCl和20mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含10mM Tris-HCl和200mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于10mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

优选地，在步骤S5或S6之后之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥。

根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。

通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达纤维素外切酶的酵母转化子也属于本发明保护的范围。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒的应用也是本发明保护的范围。

进一步，所述应用为将纤维素分解在饲料、纺织、食品和/或生物能源领域中的应用。

本发明提供的技术方案具有以下优点：一是提供了一种新的可高效表达纤维素外切酶的基因，进一步根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组纤维素外切酶能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体pPICZαA-纤维素外切酶上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持纤维素外切酶的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得纤维素外切酶的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达纤维素外切酶的方法和快速高效纯化纤维素外切酶的方法，可以降低成本且实现大量生产；六是表达的重组蛋白可以利用镍亲合层析快速纯化，纯化的蛋白具有很强的水解纤维素产生葡萄糖的生物活性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的表达载体pPICZαA-纤维素外切酶构建示意图。

图2为本发明实施例中高Zeocin抗性纤维素外切酶的酵母转化子培养液上清的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中在扩大培养条件下，不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中不同浓度咪唑洗脱纯化得到的纤维素外切酶蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图5为重组蛋白冻干重溶后SDS-PAGE检测结果图。

图6为对比例酵母转化子上清液中的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图7为本发明实施例中重组纤维素外切酶蛋白的生物学活性的HPLC检测结果图。

图8为本发明实施例中重组纤维素外切酶蛋白的生物学活性检测的薄层层析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZαA均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1)YPD培养基

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到900mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100mL 20％灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.6-1.8％的琼脂可制得YPD固体培养基。

2)酵母生长培养基(BMGY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mI YNB，2mL 500×生物素，20mL 50％灭菌甘油；

2)酵母诱导培养基(BMMY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mL YNB，2mL500×生物素，10mL甲醇；

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的C-端带有6×His标签的纤维素外切酶基因，具体序列如序列表中的SEQ ID No.1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。优化后的DNA序列经NCBI比对，没有明显相似性。

甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。酵母是单细胞低等真核生物，酵母表达系统与昆虫表达系统、哺乳动物表达系统相比，兼具两者优点，同时酵母表达系统具有操作简单，成本低廉，可大规模进行发酵等特点，因此是比较理想的重组真核蛋白质生产制备工具。酵母表达产物长期广泛地应用于食品工业，不产生毒素，安全性好，已被认定为安全性生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验。但是也有不足，易产生不正确的蛋白糖基化，分泌效率低，对于30KD大小的蛋白不易表达。

将本发明根据纤维素外切酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的SEQID No.1DNA序列、优化前的纤维素外切酶的天然DNA和另几种仅仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，得到重组载体，然后利用Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌X-33中，转化后分别用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证，将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线分别接种至终浓度为1500μg/mLZeocin抗生素的YPD平板，分别筛选得高抗性的毕赤酵母转化子。将筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有5ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝8左右，离心收集菌体并加入1ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，离心取上清，取上清液10μl用于SDS-PAGE检测，分析目标蛋白的表达情况，结果观察到目标蛋白的大量表达。同时测定上清液酶活，将10μl上清液加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品20μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值，结果表明，SDS-PAGE检测到了高水平表达目标蛋白的转化子其上清液中同样存在很高的酶活。说明利用本发明提供的序列和方法可以筛选到的转化子可以高水平地分泌表达目标蛋白。

实施例2

本实施例提供一种制备纤维素外切酶蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：构建表达载体及转化：将实施例1的基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列即SEQ ID No.1中的DNA连接至毕赤酵母诱导型分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-纤维素外切酶，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA-纤维素外切酶构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：

(1)用Xho I和Xba I双酶切含合成的纤维素外切酶基因的人工合成质粒，获得目的片断，反应体系如下(所用外切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用Xho I和Xba I双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用外切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确***到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

S2：重组质粒的转化：将所述重组载体pPICZαA-纤维素外切酶用Sac I单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证。

S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1500μg/mL Zeocin的YPD平板，将筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝8左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清液10μl用于SDS-PAGE检测，筛选得到了4株高水平分泌表达重组茯苓纤维素外切酶蛋白的转化子。同时，将10μl上清液加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。根据目标蛋白条带的浓度和吸光值的大小确定最高水平表达纤维素外切酶的转化子，结果表明，4株高水平分泌表达重组茯苓纤维素外切酶的转化子同样检测到了很高的吸光值即这4株转化子的上清液具有很强的酶活。

S4：将高水平分泌表达纤维素外切酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃-30℃继续诱导培养，用于大量分泌纤维素外切酶重组蛋白，并补加甲醇使其质量分数保持在1～1.5％。

进一步，将所述高表达纤维素外切酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD600为10～15，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌纤维素外切酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导3-4天。

BMGY扩大生长培养后，一般以生长培养基1/10-1/5体积的诱导培养基BMMY来诱导培养。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至7.5，以大于或等于15000g的转速离心30分钟，将获得的上清液加入到经pH 7.5Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH 7.5的含10mM Tris-HCl和20mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱。

需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用BMMY培养基小量表达，经SDS-PAGE分析，从高抗性(抗性水平为1200μg/mL Zeocin)转化子中筛选得到了4株稳定且高水平分泌表达纤维素外切酶的酵母转化子，而从抗性水平低于500μg/mL Zeocin YPD平板的转化子分泌表达目标蛋白的能力明显低于高抗性的转化子且酶活检测具有同样的结果，部分高Zeocin抗性转化子分泌目标蛋白的SDS-PAGE结果如图2所示。

同样需要说明的是，用SDS-PAGE检测不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。经培养1～4天，通过继续补加甲醇，培养得到的分泌蛋白的总量更高，具体各上清液总蛋白浓度结果如下表1所示。

表1总蛋白含量

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					总蛋白浓度(mg/L)	240	380	420	440

取培养1～4天的发酵液上清，经SDS-PAGE，在70kDa左右有明显目的蛋白表达，SDS-PAGE胶的灰度扫描结果显示，目标蛋白的比例在第三天左右时最高，目的蛋白占上清液总蛋白的比例结果如下表2所示。

表2不同诱导时间得到的目的蛋白占上清液蛋白的百分比含量结果

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					百分比含量(％)	6	8	9	6

经计算，目的蛋白含量结果如下表3所示，在甲醇诱导24h后即可以检测到纤维素外切酶的分泌，其表达水平约为15mg/L；随着诱导时间的延长，目标蛋白的表达水平在诱导的1～3天内呈不断增加的趋势；其中，在诱导的第2天，纤维素外切酶的增加最为迅速；诱导3天后目标蛋白表达水平达到最高值为38mg/L。但甲醇诱导到第4天时目标蛋白的表达水平开始下降。

表3目标蛋白总量

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					纤维素外切酶(mg/L)	15	30	38	26

取培养1～4天的发酵液上清，10μl上清液加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品20μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。所得的吸光值变化如表4所示。从结果可以看出，在培养到第3天之后，酶活力达最大值。

表4吸光值变化结果

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					400nm测定吸光值	0.45	0.83	1.08	0.74

S6：用含10mM Tris-HCl和50、100、200及400mM咪唑的缓冲液依次洗脱所述镍亲合层析柱，洗脱液中蛋白的SDS-PAGE结果如图4所示，从结果可以看出，200mM咪唑的缓冲液洗脱可以得到很纯的目标蛋白。将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于10mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩，经计算每100ml培养基发酵液中可以纯化到3mg的目标蛋白，其纯化结果如表5所示。

表5各步骤蛋白纯化结果

在申请号为CN201811238622.2中，以pET 32为表达载体，BL21为表达菌株(后以大肠杆菌表达系统表示)，在IPTG的诱导下，以超声波破碎后，可溶性的目标蛋白经镍亲合层析进行纯化，每100ml培养基仅能纯化到1.1mg的目标蛋白。而本发明的SEQ ID No.1以pPICZαA为表达载体，X33为表达菌株，经发酵每100ml发本酵液可以纯化到的目标蛋白为3mg，且最终目标蛋白的回收率可达79％且纯度都在95％以上，其回收率和纯度均高于大肠杆菌表达系统。相较于大肠杆菌表达系统，以pPICZαA为表达载体，X33为表达菌株在摇瓶发酵条件下都实现了重组外切酶的高水平分泌表达和高效纯化。

优选地，在步骤S5或S6之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥，即得到冻干粉蛋白。冻干粉溶解于生理盐水中，4℃、15000g的转速离心20分钟，取上清液进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，检测到了目标蛋白且目标蛋白具有很高纯度，且说明该蛋白处理的方法不会使蛋白大量变性蛋白仍呈可溶解状态。

对比例

发明人利用转录组技术对茯苓的纤维素外切酶基因的表达谱进行分析发现了几个高丰度的纤维素分解的酶基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因天然序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；同样，也合成了另几种仅仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，其中的一种仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工序列如序列表中SEQ ID NO.4所示(以该序列为代表)。将上述纤维素外切酶基因序列用Xho I和Xba I双酶切，并连接到同样经Xho I和Xba I双酶切的pPICZαA表达载体。重组载体pPICZαA-纤维素外切酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆。将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有1200μg/mLZeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有5ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝8左右，离心收集菌体并加入1ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清10μl并加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品20μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。结果显示仅本发明提供的序列能实现目标蛋白的大量表达且具有很高的酶活。同时，以SDS-PAGE检测上清蛋白中目标蛋白的表达情况，SDS-PAGE的检测结果如图6所示，未在目标位置检测到目标蛋白条带。结果说明，只有本发明提供的根据纤维素外切酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列表SEQ ID NO.1所示的序列转化到毕赤酵母中才能实现目标蛋白的高水平分泌表达。

实施例3

本实施例对纯化的纤维素外切酶的酶活力进行检测，具体步骤和结果如下：

本发明采用葡萄糖己糖激酶(HK)法测定纤维素外切酶水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)产生葡萄糖的能力，己糖激酶在有ATP存在下催化葡萄糖(D-Glucose)使其磷酸化生成葡萄糖-6磷酸(G-6-P)，G-6-P和辅酶NAD在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下生成NADH和6-磷酸葡萄糖酸，可通过分光光度法测定NADH在340nm波长下的吸光度变化，定量检测样品中葡萄糖的浓度，具体步骤和结果如下：将2μl浓度为1mg/mL的纯化的纤维素外切酶加入到98μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。所得的标准曲线方程为：Y＝0.0094X+0.0022，相关系数R²＝0.9985，标准品的检测结果表如表6示。

表6标准品的检测结果

标准品浓度(ng/mL)	0	4	8	12	16	20	24
								OD<sub>340</sub>	0	0.040	0.079	0.118	0.156	0.185	0.230

(2)根据(1)的方法，分别利用pH 3，pH3.5，pH4，pH4.5，pH5的磷酸盐缓冲液，对酶活力进行了检测。在不同pH值下，相对活力(设定酶活力最高时pH下的酶活力为100％，其它情况下的相对酶活力是测得该pH条件下产生的葡萄糖总量与酶活力最高pH条件下产生的葡萄糖总量的比值)如表7所示，从图中可以看出，该酶的最适pH为4左右。表7为相对酶活力的检测结果。

表7不同pH值下相对酶活

pH	3	3.5	4	4.5	5
						相对酶活(％)	75	88	100	90	78

(3)根据(1)的方法，分别利用pH4的磷酸盐缓冲液，对不同温度下的酶活进行了检测。酶活检测的结果如表8所示，从图中可以看出，该酶的最适温度为40℃左右。表8为不同温度下相对酶活检测结果(设定酶活最高时的温度下的相对酶活为100％，其它情况下的相对酶活是测得该温度条件下产生的葡萄糖总量与酶活力最高的温度下产生的葡萄糖总量的比值)。

表8不同温度下相对酶活

温度(℃)	30	35	40	45	50
						相对酶活(％)	77	89	100	92	81

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的茯苓纤维素外切酶是一种能分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的、最适pH为4左右、最适温度为40℃左右的重组茯苓纤维素外切酶重组蛋白。

实施例4

本发明利用高效液相色谱检测羧甲基纤维素钠(CMC-Na)被外切酶水解产生少量葡萄糖的能力来确定酶活。具体方法如下：将纯化的重组纤维素外切酶(1mg/ml)200μg加到等量pH4的含1％的CMC-Na溶液中，40℃下反应8小时；反应结束后，将样品用0.22μm微孔滤膜过滤至样品瓶，供液相色谱分析。液相的方法如下：色谱柱：Aglient氨基柱，250×4.6mm，5μm；流动相：乙腈：水＝70：30(体积比)，流速：1.0mL/min，进样量：10uL，柱温：35℃，检测器：示差折光检测器。HPLC结果如图7所示，其中上图为CMC-Na在不加该重组纤维素外切酶的情况下未检测到葡萄糖峰，下图为CMC-Na加入本发明制备的纤维素外切酶反应8小时后，检测到了明显的葡萄糖峰，该峰的保留时间为5.538分钟，葡萄糖浓度约为180ng/μL，说明该外切酶的确具有水解纤维素产生葡萄糖的能力。

实施例5

将本发明纯化的纤维素外切酶(1mg/ml)100μg和CN201811238622.2中利用大肠杆菌表达系统表达的该等量纤维素外切酶分别加到等量pH 4的含1％的羧甲基纤维素钠溶液中，40℃下反应1小时；反应结束后，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。经计算，本发明纯化的纤维素外切酶作用下产生的葡萄糖的浓度约为260ng/μL，而大肠杆菌表达的重组酶作用下产生的葡萄糖的浓度为95ng/μL。由此表明，本发明以pPICZαA为表达载体，X33为表达菌株表达的纤维素外切酶的活力是以pET 32为表达载体，BL21为表达菌株表达的相同纤维素外切酶活力的约2.7倍。

此外，将终浓度为1mg/ml纯化的大肠杆菌表达的和毕赤酵母表达的重组茯苓纤维素外切酶分别溶于pH4.0的20mM的柠檬酸盐缓冲溶液中，加入等量的经研磨成浆状的10mg/ml滤纸到以上酶溶液中，40℃下反应1小时。取硅胶G板于100℃烘箱活化后冷却至室温，用毛细管分别取未加入酶的滤纸液上清、大肠杆菌表达系统表达的重组外切酶与滤纸的反应液和酵母表达系统表达的重组外切酶与滤纸的反应液各2μL，点样至薄层硅胶板，点样位置为从硅胶板下端1.5cm，两侧2cm，每个样品点相距1cm。将展层剂(乙酸乙酯∶乙酸∶水＝2∶1∶1)于层析缸中平衡，数分钟后，将硅胶板放入。当展层剂移至距上端2cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂(25％硫酸)，于100℃显色20min后从烘箱取出。显色结果如图8所示，从图可以看出，在未加入重组外切酶(条带1)的情况下，没有检测到葡萄糖的显色斑点；在加入有20μg的葡萄糖标准品的位置(条带2)有显著的显色斑点；在加入大肠杆菌表达的重组外切酶样品中，经显色，在葡萄糖标准品的位置也出现了较弱的显色斑点，说明大肠杆菌表达的重组外切酶有将滤纸水解产生葡萄糖的能力(条带3)，但斑点的显色较弱，说明产生的葡萄糖量较少；在加入毕赤酵母表达的重组外切酶样品中，经显色，在葡萄糖标准品的位置也出现了明显的显色斑点，说明酵母表达的重组外切酶有较强的水解滤纸产生葡萄糖的能力(条带4)，其葡萄糖的产生量显著高于大肠杆菌的表达产物。可见本发明提供的方法较对比发明专利是更为高效并产生了活力更强的纤维素外切酶。

因此，根据以上结果，根据本发明所提供的如SEQ ID NO：1所示的基因序列构建的重组载体，进一步所表达出的新的纤维素外切酶是一种能分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的新颖重组纤维素外切酶。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种纤维素外切酶人工合成基因及其蛋白和重组载体

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcaagctg gtactcagac cgctgagaac catccacagt tgtcctctca aaagtgtact 60

gccggtggat cttgtacttc tgcttccact tcggttgtcc tggactctaa ttggagatgg 120

gttcacacca cttccggtta caccaactgc tacactggta acacttggga cgcctccatc 180

tgttctgacc cagttacttg tgctcagaac tgcgctttgg atggtgctga ttacgccggt 240

acttacggaa ttactacttc tggtgacgcc ctgaccttga agttcgttac tggttctaac 300

gtcggattca gagtctacct gatggaagat gagactaact accagctgtt caagctgatg 360

aatcaagagt tcaccttcga cgtggacgtt tccaacttgc catgtggttt gaacggtgcc 420

gtttacttcg ttcaaatgga ccaagatggt ggttcctcta agttcccaaa caacaaggct 480

ggtgccaagt tcggaactgg ttactgtgat tcccaatgtc cacaggacat caagttcatc 540

aacggtgagg ccaacatcgt taactggacc gcttctgcag gtgatgctaa ctctggaact 600

ggttccttcg gtacttgttg ccaagagatg gatatctggg aagccaactc tatctccgct 660

gcctacactc cacatccatg taccgttact gagcagacca gatgttctgg ttctgattgt 720

ggacaaggtt ccgacagata caacggtatt tgcgacccag acggttgcga cttcaactcc 780

tttagaatgg gaaacaccga gttctacggt aagggattga ctgttgacac ttctcagaag 840

ttcaccatcg tcacacagtt catttccgac gatggcactg ctgacggtaa cttggctgag 900

atcagaagat tctacgtcca gaacggtaag gtcatcccaa actctgttgt tcagatcact 960

ggtatcgacc cagtcaactc tatcaccgag gatttctgta cacagcaaaa gaccgtgttc 1020

ggcgacaaca acaacttcgc tgcaaaaggt ggtctgcagc aaatgggaga agctgtcaag 1080

aacggtatgg ttctggcttt gtctctgtgg gatgactacg ctgcacaaat gttgtggctg 1140

gactctgact acccaactac cgctgatcca tctaagccag gagttgccag aggcacttgt 1200

ccaaccactt caggtgttcc atcgcaggtt gaaggtcaag aaggatcttc ctctgttatc 1260

tactccaaca ttaagttcgg cgacctgaac tccactttca ccggtacttt gactaaccca 1320

tcctctccag cttctccacc agttacatct tcaccatctc aaccatctca gtccactcag 1380

ccttctcagc ctgctcaacc ttcacaacca gctggaactg ctgctcaatg ggcccagtgt 1440

ggaggtatgg gttttactgg tccaaccgtt tgtgcttctc cattcacttg tcacgtcttg 1500

aacccttact actcccaatg ctaccatcac caccaccatc attaa 1545

<210> 2

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Gln Ala Gly Thr Gln Thr Ala Glu Asn His Pro Gln Leu Ser Ser

1 5 10 15

Gln Lys Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Thr Ser Ala Ser Thr Ser Val

20 25 30

Val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr Thr

35 40 45

Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Ser Ile Cys Ser Asp Pro

50 55 60

Val Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asp Ala Leu Thr Leu Lys Phe Val

85 90 95

Thr Gly Ser Asn Val Gly Phe Arg Val Tyr Leu Met Glu Asp Glu Thr

100 105 110

Asn Tyr Gln Leu Phe Lys Leu Met Asn Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val

115 120 125

Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Val Tyr Phe Val

130 135 140

Gln Met Asp Gln Asp Gly Gly Ser Ser Lys Phe Pro Asn Asn Lys Ala

145 150 155 160

Gly Ala Lys Phe Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Gln Asp

165 170 175

Ile Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile Val Asn Trp Thr Ala Ser

180 185 190

Ala Gly Asp Ala Asn Ser Gly Thr Gly Ser Phe Gly Thr Cys Cys Gln

195 200 205

Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Ala Ala Tyr Thr Pro

210 215 220

His Pro Cys Thr Val Thr Glu Gln Thr Arg Cys Ser Gly Ser Asp Cys

225 230 235 240

Gly Gln Gly Ser Asp Arg Tyr Asn Gly Ile Cys Asp Pro Asp Gly Cys

245 250 255

Asp Phe Asn Ser Phe Arg Met Gly Asn Thr Glu Phe Tyr Gly Lys Gly

260 265 270

Leu Thr Val Asp Thr Ser Gln Lys Phe Thr Ile Val Thr Gln Phe Ile

275 280 285

Ser Asp Asp Gly Thr Ala Asp Gly Asn Leu Ala Glu Ile Arg Arg Phe

290 295 300

Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Val Val Gln Ile Thr

305 310 315 320

Gly Ile Asp Pro Val Asn Ser Ile Thr Glu Asp Phe Cys Thr Gln Gln

325 330 335

Lys Thr Val Phe Gly Asp Asn Asn Asn Phe Ala Ala Lys Gly Gly Leu

340 345 350

Gln Gln Met Gly Glu Ala Val Lys Asn Gly Met Val Leu Ala Leu Ser

355 360 365

Leu Trp Asp Asp Tyr Ala Ala Gln Met Leu Trp Leu Asp Ser Asp Tyr

370 375 380

Pro Thr Thr Ala Asp Pro Ser Lys Pro Gly Val Ala Arg Gly Thr Cys

385 390 395 400

Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ser Gln Val Glu Gly Gln Glu Gly Ser

405 410 415

Ser Ser Val Ile Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Gly Asp Leu Asn Ser Thr

420 425 430

Phe Thr Gly Thr Leu Thr Asn Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Pro Val

435 440 445

Thr Ser Ser Pro Ser Gln Pro Ser Gln Ser Thr Gln Pro Ser Gln Pro

450 455 460

Ala Gln Pro Ser Gln Pro Ala Gly Thr Ala Ala Gln Trp Ala Gln Cys

465 470 475 480

Gly Gly Met Gly Phe Thr Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Pro Phe Thr

485 490 495

Cys His Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Tyr His His His His

500 505 510

His His

<210> 3

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagcaggcag gtacacagac cgcagaaaat catccgcagc tgagcagcca gaaatgtacc 60

gcaggcggta gctgtaccag cgcaagcacc agcgttgttc tggatagcaa ttggcgttgg 120

gttcatacca ccagtggtta taccaattgt tataccggta atacctggga tgcaagcatt 180

tgtagcgatc cggttacctg tgcgcagaat tgtgcactgg atggtgcaga ttatgcaggc 240

acctatggta ttaccacctc aggtgatgca ctgaccctga aatttgttac cggtagcaat 300

gttggtagcc gtgtttatct gatggaagat gaaaccaatt accagctgtt caaactgatg 360

aatcaagagt ttaccttcga tgtggatgtt agcaatctgc cgtgtggtct gaatggtgcc 420

gtttattttg ttcagatgga tcaggatggt ggcagcagca aatttccgaa taacaaagcc 480

ggtgcaaaat ttggtacagg ttattgtgat agccagtgtc cgcaggatat caaatttatc 540

aatggcgaag ccaacattgt taattggacc gcaagtgccg gtgatgcaaa tagcggcacc 600

ggtagctttg gcacctgttg tcaagaaatg gatatttggg aagccaatag cattagcgca 660

gcatatacac cgcatccgtg taccgttacc gaacagaccc gttgtagcgg tagcgattgt 720

ggtcagggta gcgatcgtta taatggtatt tgtgatccgg atggctgtga tttcaatagc 780

tttcgtatgg gcaacaccga gttttatggt aaaggtctga ccgttgatac ctcgcagaaa 840

tttaccattg tgacccagtt tattagtgat gatggcaccg cagatggtaa tctggcagaa 900

attcgtcgtt tttatgtgca gaatggtaaa gtgattccga atagcgtggt tcagattacc 960

ggcattgatc cggtgaatag tattaccgaa gatttttgta cccagcagaa aaccgtgttt 1020

ggcgataata acaattttgc agcaaaaggt ggtctgcagc agatgggtga agcagttaaa 1080

aatggtatgg ttctggcact gagcctgtgg gatgattatg ccgcacagat gctgtggctg 1140

gatagcgatt atccgaccac agcagatccg agcaaaccgg gtgttgcacg tggtacatgt 1200

ccgacaacca gcggtgttcc gagccaggtt gaaggtcaag aaggtagcag cagcgttatc 1260

tatagcaaca tcaaatttgg cgatctgaac agcaccttta ccggtacact gaccaatccg 1320

agcagtccgg caagccctcc ggtgaccagc agtccgagtc agccgagcca gagcacccag 1380

ccgtcacagc ctgcacagcc gagtcaaccg gcaggtacgg cagcacagtg ggcacagtgc 1440

ggtggtatgg gttttaccgg tccgaccgtt tgtgcaagcc cgtttacctg tcatgttctg 1500

aatccgtatt acagccagtg ctat 1524

<210> 4

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caacaggccg gcacgcagac cgctgagaac caccctcagc tgtcatccca aaagtgtact 60

gctggtggta gctgcacctc cgcctccacc agtgttgtgc tcgactccaa ctggcgttgg 120

gtccacacca cttccggtta cactaactgc tacactggaa acacgtggga tgcctccatc 180

tgctctgacc cagttacctg tgcccagaac tgtgccctcg atggcgctga ctatgccggc 240

acttacggta tcaccaccag tggcgacgct cttactctca agtttgtgac gggctccaac 300

gtcggctctc gtgtctacct catggaggac gagaccaact accagctgtt caagctcatg 360

aaccaggagt tcactttcga cgtcgacgtc tccaacctcc cctgcggtct taacggtgct 420

gtttacttcg tccagatgga tcaggacggt ggtagctcca agttccccaa caacaaggct 480

ggagccaagt tcggtaccgg ttactgtgac tctcagtgcc ctcaggacat caagttcatc 540

aacggagagg ccaacatcgt caactggact gcctctgctg gagatgctaa ctccggtact 600

ggttctttcg gtacttgctg ccaggagatg gacatctggg aggccaactc catctccgct 660

gcctacaccc ctcacccttg cacggtcact gagcagaccc gctgctctgg ctctgactgt 720

ggacagggca gcgaccgcta caacggtatc tgcgaccccg atggctgtga cttcaactcc 780

ttccgcatgg gtaacaccga gttctacggc aagggcctta ccgttgacac tagccagaag 840

ttcaccatcg tcacccagtt catctctgac gacggcactg ctgacggaaa cctcgccgaa 900

attcgtcgct tctacgtcca aaacggcaag gttatcccta acagcgttgt tcagatcact 960

ggcatcgacc ctgtcaactc catcactgag gacttctgca ctcaacaaaa gaccgtgttc 1020

ggcgacaaca acaacttcgc cgctaagggt ggcctccagc agatgggtga ggctgtcaag 1080

aacggaatgg tcctcgctct ttcgctctgg gacgactacg ccgctcagat gctctggctc 1140

gactccgact accccaccac cgctgacccg tccaagcccg gtgttgctcg tggtacctgc 1200

cccaccacct ccggtgtccc cagccaagtc gagggtcagg aaggcagctc gtccgtcatc 1260

tactcgaaca tcaagttcgg tgacctcaac tcgactttca ccggcaccct caccaacccc 1320

agcagcccag ctagcccacc cgtcaccagc tctccctcgc agccatccca gtctactcag 1380

ccttctcagc ccgctcaacc ctcccagccg gctggtaccg ctgctcagtg ggctcagtgt 1440

ggtggtatgg gcttcaccgg cccaaccgtc tgcgcaagtc ccttcacttg ccacgtcctc 1500

aacccctact actctcagtg ctac 1524