具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中涉及的pCAMBIA1300载体、猕猴桃品种‘金魁’、‘红阳’，以 及其他各种试剂均为市售。

以下实施例中使用的Psa为猕猴桃溃疡病菌，菌株JF8分离自安徽省岳西县主簿镇‘金丰’猕猴桃叶片，MLST研究证实该病菌为丁香假单胞猕猴桃致病变种的致病类 型3，为我国猕猴桃溃疡病的主要致病类型(He et al)，该菌株现保存于中国典型培 养物保藏中心(CCTCC AB2018305)。JF8菌株可参见Rong He^#,Pu Liu^#,Bing Jia, Shi-zhou Xue,Xiao-jie Wang,Jia-yong Hu,Yosef AI Shoffe,Giorgio M Balestra,Lorenzo Gallipoli,Angelo Mazzaglia,Li-wu Zhu^*.Genetic diversity of Pseudomonas syringaepv.actinidiae strains from different geographic regions inChina.Phytopathology.2019, 109：347-357。

实施例1感溃疡病基因AcBXL1的获得及序列分析

1、AcBXL1基因转录组和荧光定量分析

荧光定量实验处理：本试验材料取自抗病猕猴桃品种‘金魁’和感病猕猴桃品种‘红阳’组培苗。用无菌水作对照，用OD₆₀₀＝0.6的Psa菌液分别处理组培苗1h、6h、12 h、24h、48h、96h后放-80℃冰箱保存样品。

通过对抗病品种‘金魁’和感病品种‘红阳’的转录组分析，挑选出在‘金魁’ 中下调，‘红阳’中上调的基因AcBXL1。通过对‘金魁’和‘红阳’猕猴桃组培叶 片接种Psa菌液1h、6h、12h、24h、48h和96h后，分别对‘红阳’和‘金魁’的AcBXL1 基因的表达量用qRT-PCR技术分析(图1)。‘金魁’猕猴桃组培苗接种Psa后，与对 照相比，接种Psa后AcBXL1基因表达经历了先上调后下调的过程，在6h表达量达到最 大值，而后一直很低。与对照相比，96h后AcBXL1基因的表达量低于对照。‘红阳’ 猕猴桃组培苗接种Psa后，AcBXL1基因的表达量先下调后上调，在48h达到最大值， 最终96h表达量也高于对照。总体来说，AcBXL1基因在抗病品种‘金魁’品种中下调， 在感病品种‘红阳’中上调。这与转录组数据表达趋势一致。

2、基因AcBXL1全长cDNA序列的获得

使用RNA试剂盒提取‘金魁’猕猴桃叶片的RNA。根据基因组结合转录组数据 获取猕猴桃AcBXL1基因CDS完整序列，用Primer 5.0软件设计全长引物。cDNA为模 板，进行PCR扩增，优化后的反应体系如下：

注：I-5酶购自北京擎科生物科技有限公司。

PCR扩增程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸1min， 35次循环；72℃再延伸10min，4℃保存。

3、基因AcBXL1序列分析

猕猴桃AcBXL1基因CDS长2202bp(SEQ ID NO:2)，编码734个氨基酸(SEQ ID NO:1)。在Protparam网站分析AcBXL1基因理化性质，缬氨酸(11.6％，85个)在AcBXL1 蛋白中含量相对最多，色氨酸(1.5％，11个)在AcBXL1蛋白中含量相对最少，带正 电荷总残基数(Asp+Glu)共59个。该蛋白预测分子式为C₆₅₁₇H₁₀₈₃₄N₂₂₀₂O₂₇₄₉S₄₃₈，相 对分子量为177819.83Da，原子总数为22706，推测其理论半衰期为4.4h，蛋白为不稳 定蛋白。

实施例2感溃疡病基因AcBXL1的遗传转化

1、AcBXL1基因p1300载体的构建(用于基因的瞬时表达和转基因猕猴桃)

根据pCAMBIA1300载体的功能，将目的基因插入到35S启动子之后，载体自带 EGFP标记基因，同时满足亚细胞定位和基因超表达的功能。根据p1300载体可供选 择的酶切位点(Xba I和BamH I)，利用诺唯赞提供的软件(CE Design V1.04)设计 出如下同源臂引物：

使用同源加酶切位点的引物对重新PCR扩增目的基因片段，片段纯化并测其浓度。扩增体系如下：

同时，对pCAMBIA1300空载大肠杆菌进行活化后摇菌提取质粒，检测浓度，按 照如下体系进行双酶切操作：

在水浴锅中37℃酶切1.0h，结束置于65℃、5min使酶失活。1.5％琼脂糖凝胶电 泳进行检测，纯化回收目的片段。

根据诺唯赞提供的软件(CE Design V1.04)计算其片段和载体片段的加入量。 连接体系如下：

将混合物置于PCR仪中37℃、30min连接，反应结束后转化到大肠杆菌感受态细 胞Trans1-T1，并进行重组子筛选和测序验证。对经测序验证正确的阳性重组子菌液 中吸取0.5μl在5ml LB(含Kan)液体培养基中37℃、200rpm过夜震荡培养，使用质 粒回收试剂盒提取大肠杆菌中的p1300-35S-JK-AcBXL1-GFP质粒。将重组质粒 p1300-35s-AcBXL1-GFP、转化到GV3101农杆菌中。

培养至48h左右，挑取单菌落置于YEB液体培养基(含Kan和Rif)中28℃、200rpm 摇摇菌检测，摇菌至OD₆₀₀＝0.6-0.8；对菌液进行检测，引物(1300-F： 5′-CGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGC-3′和1300-R： 5′-ATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAA-3′)，pCAMBIA1300空载片段大小 540bp。扩增检测程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸 3min，35次循环；72℃再延伸10min。检测体系如下：

2、猕猴桃的瞬时表达(基因功能验证)

取生长45天、长势良好、叶片大小相同的‘红阳’猕猴桃实生苗，一组注射Psa的 重悬液(OD₆₀₀＝0.6)，另一组注射p1300-35s-AcBXL1-GFP和Psa按1:1比例混合的重 悬液(OD₆₀₀＝0.6)；将处理后的猕猴桃实生苗放入25℃光照培养箱，每天观察猕猴 桃发病情况。2周后，用尼康D7500相机对猕猴桃叶片的发病情况进行拍照，并采用 稀释涂布平板法计算猕猴桃溃疡病发病程度。

通过瞬时注射猕猴桃实生苗的整片叶子，25℃培养箱正常培养2周，猕猴桃叶片Psa溃疡病的发病情况如图2所示；通过稀释涂板法，由显微镜观察Psa菌落个数来代 表猕猴桃溃疡病发病程度，计数结果如图3所示。注射过p1300-35s-AcBXL1-GFP与Psa 混合菌液的猕猴桃叶片，菌落总数是注射过Psa菌液叶片菌落总数的1.25倍。

3、农杆菌介导猕猴桃的遗传转化(p1300-35S-JK-AcBXL1-GFP转基因猕猴桃)

(1)预培养：将猕猴桃组培苗的叶柄切成1cm的小段，叶片切成0.5cm×1cm的 小叶盘，叶脉向下平铺到MS+3mg/L ZT+1mg/L NAA的培养基上预培养3-5d。

(2)侵染：将预培养的叶盘与叶柄放到农杆菌转化液里侵染20min；将侵染后 的材料放到无菌滤纸上吸取多余的菌液。

(3)暗培养：之后将材料接种到MS+50μM AS的培养基上28℃暗培养2d；(4) 筛选：将材料用无菌水冲洗3次，吸干水分后接种到MS+3mg/L ZT+1mg/L NAA+ 400mg/L Cef+150mg/L Kan的培养基上培养；筛选过程中，尽量不要更换培养基， 以避免污染。

(5)继代培养：一个月后，将长出的幼苗切出，继续在MS+3mg/L 6-BA+1mg/L NAA+400mg/L Cef+100mg/L Kan的培养基上继代培养。愈伤则继续培养。

(6)诱导生根：将长至3-4cm的猕猴桃幼苗切出，放置在1/2MS+0.7mg/L IBA +50mg/L Kan的培养基上做生根培养。

为确认AcBXL1基因在猕猴桃植株中是否超表达，取同一品种转基因猕猴桃与对照猕猴桃的叶片提取总RNA，进行qRT-PCR扩增，检测AcBXL1基因的相对表达量， 荧光定量PCR结果显示，超表达猕猴桃植株中AcBXL1基因的相对表达量显著高于对 照，是对照植株的60倍(图4)。说明此转基因猕猴桃AcBXL1基因确实超表达。

分别用野生型猕猴桃叶片与转基因猕猴桃叶片接种等量、OD₆₀₀＝0.2的Psa菌液，放25℃培养箱一周后观察发病情况，如图5所示，转基因猕猴桃叶片发病面积明显大 于野生型猕猴桃叶片。说明AcBXL1基因可加速猕猴桃感病。

实施例3 AcBXL1基因启动子活性分析

1、P1391Z启动子载体的构建

首先使用诺唯赞公司的CE Design V1.04软件对测序正确的AcBXL1基启动子序列设计酶切引物(表1)。用克隆出正确序列的AcBXL1基因启动子菌液划板、挑单、摇 AcBXL1启动子菌液，以AcBXL1启动子菌液为模板，用KOD酶进行高保真PCR扩增， PCR反应结束后在PCR管中中加入10μL 6×Loading Buffer吸打混匀，用于后续电泳检 测和并切胶回收。

表1启动子载体构建所需引物

用Takara公司的快切酶quickcut-BamHI和quickcut-EcoRI对pCambia 1391Z载体的 酶切位点BamHI和EcoRI进行双酶切，电泳检测得到目条带后，胶回收线性化载体pCambia 1391Z。

重组反应使用HieffPlus One Step Cloning Kit酶，将插入片段AcBXL1启动 子与线性化载体pCambia 1391Z进行重组反应，反应结束后，将重组产物转化到大肠杆菌里，对得到的单菌落用PCR鉴定、送去测序。AcBXL1基因启动子序列如SEQ ID NO:5所示。

2、AcBXL1基因启动子活性烟草瞬时表达(瞬转)

用温室培养的本氏烟草进行p1391-AcBXL1-GUS启动子活性的瞬时表达，使用前两天对烟草控水处理。活化p1391-GUS阴性对照、p1391-AcBXL1-GUS菌液、p1391-35s-GUS阳性对照，在超净台挑取单克隆，置于30mL YEB+Kan+Rif的锥形瓶 中，将锥形瓶放入28℃培养箱过夜震荡培养。用GUS侵染液重悬菌液，5500rmp离心 8min，重复2-3次，调至OD₆₀₀＝0.6。为了复苏菌液，需要将p1391-AcBXL1-GUS侵染 液放28℃培养箱震荡培养1-2h。选择烟草叶片大小、生长状况一致、叶面平整的叶片， 从叶背面注射p1391-AcBXL1-GUS侵染液，注满整片叶子。试验完成后把烟草植株避 光处理两天，而后进行染色处理。

使用培养6-7周后的本氏烟草叶片进行瞬时表达，将带有GUS表达序列的AcBXL1启动子菌液注射到本氏烟草叶片中，以pC1391z-GUS载体为阴性对照，插入35S启动 子的pC139z1-GUS载体为阳性对照，在37℃培养箱暗培养48h后浸泡在GUS染色中。 2天后，用75％的酒精脱色6h，再用90％的酒精脱色48h,直到完全脱去叶片的叶绿素。 图6结果显示，阴性对照pC139z1-GUS经GUS染色液染色后没有蓝色， pC139z1-35s-GUS阳性对照呈现深蓝色，pC1391z-AcBXL1-GUS基因启动子呈蓝色， 说明AcBXL1基因启动子在叶片中具有活性。

3、Psa病菌诱导后启动子烟草叶片的瞬时表达

将Psa菌液与AcBXL1启动子菌液1:1混合后对本氏烟草叶片进行瞬时表达，以pC1391z-GUS载体为阴性对照，插入35S启动子的pC139z1-GUS载体为阳性对照，暗 培养48h后浸泡在GUS染色中。图7结果显示，经Psa病菌介导的pC1391z-AcBXL1-GUS 基因启动子染色后呈蓝色，且颜色比pC1391z-AcBXL1-GUS基因启动子颜色更深。

4、AcBXL1基因启动子猕猴桃果实的瞬时表达

将OD₆₀₀＝0.6的p1391-AcBXL1-GUS的重悬液用注射器注射到猕猴桃果实中，在 37℃培养箱暗培养2天后，将猕猴桃果实浸泡在GUS染色液中染色。2天后，先用75％ 的酒精脱色6h，再用90％的酒精脱色2天。结果见图8，阴性对照pC139z1-GUS经GUS 染色液染色后没有蓝色，pC139z1-35s-GUS阳性对照呈现深蓝色， pC1391z-AcBXL1-GUS基因启动子呈蓝色，说明AcBXL1基因启动子在猕猴桃果实中具 有活性。

5、农杆菌介导番茄的遗传转化(启动子稳转番茄)

野生型番茄(Lycopersicon esculentum nudicaulis)种子放在37℃培养箱用无菌水 浸泡8h后拿出待用。在无菌超净台进行以下所有操作：将种子放入无菌组培瓶中， 用5ml移液枪吸取75％的酒精,浸泡3-5min，给番茄种子表面消毒；将番茄种子移入新 的无菌组培瓶中，用无菌水冲洗番茄种子3-5次，洗去番茄种子表面的酒精；再用15％ 次氯酸钠浸泡番茄种子5-10min，无菌水冲洗3-5次，洗去种子表面的次氯酸钠溶液； 最后把番茄种子放在灭菌的滤纸上，直到吸干种子表面的多余的水分。把种子移入 1/2MS培养基中，用黑布盖上，暗培养3-5天后放在组培室正常培养。1-2周后，番茄 成苗。

待番茄成苗后，将番茄组培苗的叶子和茎切成1cm×1cm的叶盘并且去除生长 点，放到MS+1mg.L^-1ZT+1mg.L^-1IAA的培养基上，用黑布盖住，暗培养2-3d。2 天后，拿出叶盘，将预培养过的叶片和茎放到番茄侵染液里侵染4-5min，转移到无 菌的滤纸上，吸干多余的农杆菌，放到MS+1mg.L^-1ZT+1mg.L^-1IAA的培养基上 进行共生培养，用黑布盖住暗培养2天。2天后用无菌水冲洗，洗去番茄叶片和茎上 残留的农杆菌，放在无菌滤纸上，吸去多余的水分后转移到到MS+1mg.L^-1ZT+1 mg.L^-1IAA+500mg.L^-1Cef+3mg.L^-1Hyg的培养基上进行筛选培养，每隔20天换一 次培养基，直至长出愈伤组织和芽。最后转移到MS+0.1mg.L^-1IAA+250mg.L^-1Cef +3mg.L^-1Hyg的番茄生根培养基中生长。长出根后移栽到营养土中。

将p1391-AcBXL1-GUS通过农杆菌介导法转基因番茄，得到番茄的转基因的阳性植株。通过对整株植物的GUS染色，图9结果显示，AcBXL1基因启动子在根茎叶中均 表达，在叶片中表达量较低，而在茎和根中表达量较高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但 在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易 见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明 要求保护的范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 猕猴桃溃疡病感病基因AcBXL1及其应用

<130> KHP211119315.4

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2202

<212> DNA

<213> 猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)

<400> 1

atggaagaaa aggtccaaca actagtgaac aacgccaagg gcatttccag actaggcgtg 60

cccgcgtacg agtggtggtc cgaggccctt cacggggtct cgaacaccgg gccaggtgta 120

cacttcaacg ccacggtccc tggtgctact agtttccctg ccgtgattct gtcagcggct 180

agttttaatt cgtcactgtg gtacgagatg ggccgggtgg tgtcgaccga ggctcgagcc 240

atgtacaatg tgggcttggc cgggctcacg ttttggagcc cgaatgtgaa tgtatttcgg 300

gacccgagat ggggcagggg tcaggagacc cctggtgagg acccactggt ggtttctaaa 360

tatgctgtga attatgttag aggcttgcag gaggtgggcc aagaggggaa ttttagtaac 420

gactctaatg acaagcttaa ggtttcaagt tgttgtaagc attatactgc ttatgatgtg 480

gataattgga aaggggttga tcgatttcat tttgacgcaa aggtaagttt acaggacctg 540

gaagatacat atcagccacc attcaagagc tgtgtggagg agggacatgt cagtagtgtg 600

atgtgctcat ataacagggt caatggtatc cctacttgtg ctgacccaaa ccttctcaaa 660

gggattatca gagaccaatg gaatttagat ggatatattg tgtctgactg tgactctgtg 720

gaggtttact acaactccat acattacacc gctacacctg aggatgcagt agcccttgca 780

cttaaagcag gtttaaacat gaattgtggg gcttatctag ggaagtacac acaaaatgca 840

gttaaatcaa ataaagtgga agagtccatt gtagaccagg ccttgatcta caactacata 900

gtcctaatga ggcttggctt ctttgatggt gaccccacca ccctcccctt cggccaactc 960

ggaccgtccg atgtgtgcac cgacgatcac caagcgttgt ctctcgaagc cgcgaagcag 1020

ggcatagttt tgctagaaaa cagaggatcc ctccccctat ccccaaacac caccaaaaat 1080

atagccctca taggacccaa tgccaatgtc acacaagtta tgataagcaa ctatgcgggc 1140

gtaccatgcc ggtacaccac acctttacaa gggctacaaa aatatgtccc aacagtgaca 1200

tatgaggtgg ggtgtgccaa tgtgggatgt ggggatgaga gaggaatcgg gccggcggtc 1260

aaggcggcgg ccacggccga cgccgtggtg gtggtggttg ggctggatca gtccattgag 1320

agggagggat tggatagggt gaacttgaca ttgccagggt ttcaagagag gcttgtgatg 1380

gaagtggcta atgcaacaaa tggaaatgtg attgttgtga taatgtcagc tggtccaatt 1440

gatgtgtcct ttgccaaaaa taatagcaag attggggcaa ttttgtgggt ggggtaccct 1500

ggccaggcag gaggggatgc cattgctcag gtcatatttg gggactataa tccaggtgga 1560

agatcacctt ttacctggta cccacagaag tatgtagatg agctgccaat gacagacatg 1620

accatgagag ctaatgccac tcgaaactat ccggggcgaa cctaccggtt ctacacaggc 1680

gaaccgatat ataaatttgg acacgggcta agttattcga cattttcgaa attcataata 1740

tcagctcaat ccactatact tatacacgca ttgcctcaaa attacacaaa taatattgtt 1800

caaacccaaa tcaatggtca atatgttgac atttctacga ttgactgtca gaatttgcag 1860

ctcgagctgg ttgtaggggt gtggaatggt ggtccgatgg atggggccca tgtagtgatg 1920

gtgttttgga agccggctag ttcatatgtg gtggtaggga tgccgaattt ggagctggtg 1980

gggtttgaga gggtgggggt gcagagaggg aagatggaga cggtgacggt gaagttggat 2040

gtgtgtaaga ggctaagtgt ggtggatgaa gatgggaaga ggaaggtggt cactgggcag 2100

catacccttt tggttgggtc ttctaatgag aggcaagtga aacactatgt caatattagt 2160

gtggctaaaa gtgagggtgt agtaggtaaa ttacccatgt aa 2202

<210> 2

<211> 733

<212> PRT

<213> 猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)

<400> 2

Met Glu Glu Lys Val Gln Gln Leu Val Asn Asn Ala Lys Gly Ile Ser

1 5 10 15

Arg Leu Gly Val Pro Ala Tyr Glu Trp Trp Ser Glu Ala Leu His Gly

20 25 30

Val Ser Asn Thr Gly Pro Gly Val His Phe Asn Ala Thr Val Pro Gly

35 40 45

Ala Thr Ser Phe Pro Ala Val Ile Leu Ser Ala Ala Ser Phe Asn Ser

50 55 60

Ser Leu Trp Tyr Glu Met Gly Arg Val Val Ser Thr Glu Ala Arg Ala

65 70 75 80

Met Tyr Asn Val Gly Leu Ala Gly Leu Thr Phe Trp Ser Pro Asn Val

85 90 95

Asn Val Phe Arg Asp Pro Arg Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly

100 105 110

Glu Asp Pro Leu Val Val Ser Lys Tyr Ala Val Asn Tyr Val Arg Gly

115 120 125

Leu Gln Glu Val Gly Gln Glu Gly Asn Phe Ser Asn Asp Ser Asn Asp

130 135 140

Lys Leu Lys Val Ser Ser Cys Cys Lys His Tyr Thr Ala Tyr Asp Val

145 150 155 160

Asp Asn Trp Lys Gly Val Asp Arg Phe His Phe Asp Ala Lys Val Ser

165 170 175

Leu Gln Asp Leu Glu Asp Thr Tyr Gln Pro Pro Phe Lys Ser Cys Val

180 185 190

Glu Glu Gly His Val Ser Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Arg Val Asn

195 200 205

Gly Ile Pro Thr Cys Ala Asp Pro Asn Leu Leu Lys Gly Ile Ile Arg

210 215 220

Asp Gln Trp Asn Leu Asp Gly Tyr Ile Val Ser Asp Cys Asp Ser Val

225 230 235 240

Glu Val Tyr Tyr Asn Ser Ile His Tyr Thr Ala Thr Pro Glu Asp Ala

245 250 255

Val Ala Leu Ala Leu Lys Ala Gly Leu Asn Met Asn Cys Gly Ala Tyr

260 265 270

Leu Gly Lys Tyr Thr Gln Asn Ala Val Lys Ser Asn Lys Val Glu Glu

275 280 285

Ser Ile Val Asp Gln Ala Leu Ile Tyr Asn Tyr Ile Val Leu Met Arg

290 295 300

Leu Gly Phe Phe Asp Gly Asp Pro Thr Thr Leu Pro Phe Gly Gln Leu

305 310 315 320

Gly Pro Ser Asp Val Cys Thr Asp Asp His Gln Ala Leu Ser Leu Glu

325 330 335

Ala Ala Lys Gln Gly Ile Val Leu Leu Glu Asn Arg Gly Ser Leu Pro

340 345 350

Leu Ser Pro Asn Thr Thr Lys Asn Ile Ala Leu Ile Gly Pro Asn Ala

355 360 365

Asn Val Thr Gln Val Met Ile Ser Asn Tyr Ala Gly Val Pro Cys Arg

370 375 380

Tyr Thr Thr Pro Leu Gln Gly Leu Gln Lys Tyr Val Pro Thr Val Thr

385 390 395 400

Tyr Glu Val Gly Cys Ala Asn Val Gly Cys Gly Asp Glu Arg Gly Ile

405 410 415

Gly Pro Ala Val Lys Ala Ala Ala Thr Ala Asp Ala Val Val Val Val

420 425 430

Val Gly Leu Asp Gln Ser Ile Glu Arg Glu Gly Leu Asp Arg Val Asn

435 440 445

Leu Thr Leu Pro Gly Phe Gln Glu Arg Leu Val Met Glu Val Ala Asn

450 455 460

Ala Thr Asn Gly Asn Val Ile Val Val Ile Met Ser Ala Gly Pro Ile

465 470 475 480

Asp Val Ser Phe Ala Lys Asn Asn Ser Lys Ile Gly Ala Ile Leu Trp

485 490 495

Val Gly Tyr Pro Gly Gln Ala Gly Gly Asp Ala Ile Ala Gln Val Ile

500 505 510

Phe Gly Asp Tyr Asn Pro Gly Gly Arg Ser Pro Phe Thr Trp Tyr Pro

515 520 525

Gln Lys Tyr Val Asp Glu Leu Pro Met Thr Asp Met Thr Met Arg Ala

530 535 540

Asn Ala Thr Arg Asn Tyr Pro Gly Arg Thr Tyr Arg Phe Tyr Thr Gly

545 550 555 560

Glu Pro Ile Tyr Lys Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Ser Thr Phe Ser

565 570 575

Lys Phe Ile Ile Ser Ala Gln Ser Thr Ile Leu Ile His Ala Leu Pro

580 585 590

Gln Asn Tyr Thr Asn Asn Ile Val Gln Thr Gln Ile Asn Gly Gln Tyr

595 600 605

Val Asp Ile Ser Thr Ile Asp Cys Gln Asn Leu Gln Leu Glu Leu Val

610 615 620

Val Gly Val Trp Asn Gly Gly Pro Met Asp Gly Ala His Val Val Met

625 630 635 640

Val Phe Trp Lys Pro Ala Ser Ser Tyr Val Val Val Gly Met Pro Asn

645 650 655

Leu Glu Leu Val Gly Phe Glu Arg Val Gly Val Gln Arg Gly Lys Met

660 665 670

Glu Thr Val Thr Val Lys Leu Asp Val Cys Lys Arg Leu Ser Val Val

675 680 685

Asp Glu Asp Gly Lys Arg Lys Val Val Thr Gly Gln His Thr Leu Leu

690 695 700

Val Gly Ser Ser Asn Glu Arg Gln Val Lys His Tyr Val Asn Ile Ser

705 710 715 720

Val Ala Lys Ser Glu Gly Val Val Gly Lys Leu Pro Met

725 730

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaagaaa aggtccaaca 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catgggtaat ttacctacta caccc 25

<210> 5

<211> 2135

<212> DNA

<213> 猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)

<400> 5

tgccctttag ttgttggacc ttttcttcca aggtcaggcg cgacactagg tccttggccc 60

ggtccaaata cgacaaagtg gtgttgcaaa ataggtagcc tctcgtgttt ggatcatttt 120

tgttacaagc aaattggtga gtggtttgtg ggattgttag gaaaaatgag aaaaaaacag 180

gtaaaagaag gtgtttcatg gaattttatt atttttttat ctttggtaat tttgggtatt 240

gctctctttt tttagctctc aatctggttt tatactacca tgaaatatga gcagaaattc 300

aaaaagtttc tttcaactta ttccttgcac actaaaacag gatgttactt tttttcccac 360

ttgctaaatt gacaaggtta aagttgcaaa gataaagaat tgatcatctc aagcaaggtt 420

tggagagaga gagagagaga gagagagaga gttttgggca agggtatctt tgaagagatt 480

gcaaagatag aacacacatg ccaaggaaca catgccacca aaggcaaggc attgttctct 540

taagaaaaaa gctatcaatt tctgaagaaa ttataggcaa gtttgggcta agttcttttt 600

gagtttcttg ctattttcat tattggattt tttgtcttta gtcaatgttg tttgatcaaa 660

aatttatatt ttattatttt ttttgacgag atatttgaat tttaatagat ttcaattaaa 720

tacttgaact ttgaatttcg tcatcaatta aaccccttaa ctcaaattca attacaaatt 780

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