阅读说明：本技术 一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因、其编码的gLysi2蛋白及其应用 (Procambarus clarkii i-type lysozyme gLysi2 gene, gLysi2 protein coded by same and application thereof ) 是由 兰江风 张英豪 李通 曹晓彤 殷成明 顾泽茂 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明首次发现了一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因,所述gLysi2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。本发明利用该基因编码制备了一种gLysi2蛋白,所述gLysi2蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明还提供了上述基因和蛋白在预防和治疗对虾白斑综合症领域的应用。本发明具有有效的抗病毒作用,对白斑综合症杆状病毒有极强的抑制和杀灭效果,能够有效解决白斑综合症的免疫和治疗问题。(the invention discovers a Procambrus clarkii type i lysozyme gLysi2 gene for the first time, wherein the nucleotide sequence of the gLysi2 gene is SEQ ID NO. 1. The gene coding is utilized to prepare a gLysi2 protein, and the amino acid sequence of the gLysi2 protein is SEQ ID NO. 2. The invention also provides the application of the gene and the protein in the field of preventing and treating the white spot syndrome of prawns. The invention has effective antivirus function, extremely strong inhibiting and killing effect on the white spot syndrome baculovirus, and can effectively solve the problems of immunity and treatment of the white spot syndrome.)

一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因、其编码的gLysi2蛋白 及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因、其编码的gLysi2蛋白及其应用。

背景技术

克氏原螯虾又称淡水小龙虾，形似虾而甲壳坚硬；成体长约5.6～11.9厘米。克氏原螯虾是淡水经济虾类，因肉味鲜美广受人们欢迎。因其杂食性、生长速度快、适应能力强而在当地生态环境中形成绝对的竞争优势。其摄食范围包括水草、藻类、水生昆虫、动物尸体等。近年来，克氏原螯虾在我国已经成为重要经济养殖品种，产量巨大。

对虾白斑综合症是由白斑综合症杆状病毒引发的一种综合性病症。白斑综合症杆状病毒主要对虾体的造血组织、***、前后肠的上皮、血细胞、鳃等系统进行感染破坏。此类病毒复合体的毒力较强，从出现症状到死亡只有3～5天的时间，甚至更短。此病的感染率较高，7天左右可使池中70℅以上的虾得病，甚至死亡。上述疾病对于虾类的养殖而言十分致命，一旦养殖的虾患病，则会造成大面积死亡，而目前对上述疾病没有较好的治疗手段，因此养殖户养殖的虾一旦发病，会造成巨大的经济损失。

溶菌酶是广泛存在于多细胞动物的一类抗菌肽，因其可以溶解细菌的细胞壁而得名。根据其结构和来源的不同，可以分为c型，g型，i型，植物型，细菌型和噬菌体型。其中i型溶菌酶在多种无脊椎动物中有报道，对其功能研究表明该类型溶菌酶可能有溶菌酶活性，异肽键酶活性，几丁质酶活性，和不依赖于酶活性的抗菌作用。这些功能决定了i型溶菌酶在抗菌和免疫方面起到作用。克氏原螯虾作为一种无脊椎动物，其体内也存在溶菌酶，用于机体免疫。而克氏原螯虾对环境的适应能力较强，对各种流行性的疾病均有一定的抵抗能力，特别是对虾白斑综合症，克氏原螯虾有较强免疫能力。鉴于此，如果能够对克氏原螯虾的免疫机理进行研究，将能解决对虾白斑综合症的免疫和治疗的问题。

目前对于克氏原螯虾溶菌酶的研究和报道极少。中国专利公开号为“CN101942473A”、发明名称为“克氏原螯虾i型溶菌酶基因及其编码的溶菌酶与应用”的发明专利公开了一种克氏原螯虾i型溶菌酶基因，并且利用上述基因制备了重组蛋白用于抑菌。然而上述基因及其重组蛋白主要是对大肠杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑制作用。在虾类等水产养殖行业的应用意义不大。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因、其编码的gLysi2蛋白及其应用，具有有效的抗病毒作用，对白斑综合症杆状病毒有极强的抑制和杀灭效果，能够有效解决对虾白斑综合症的免疫和治疗问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因，所述gLysi2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明还提供了上述克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因在抗对虾白斑综合症领域的应用。

本发明还提供了上述克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因编码的gLysi2蛋白，所述gLysi2蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明还提供了上述的gLysi2蛋白在对虾白斑综合症治疗领域的应用。

本发明还提供了上述的gLysi2蛋白构建的表达载体，所述表达载体为pGEX-4T-1-Lysi2。

本发明还提供了上述的pGEX-4T-1-Lysi2表达载体的构建方法，包括以下步骤：

①RNA提取及反转录：

选取克氏原螯虾，抽血解剖取组织样：血淋巴、心、肝、鳃、胃、肠，采用TRIzol法取总RNA，反转录合成cDNA；

②gLysi2全长编码区基因扩增：

设计用于序列扩增的专一性引物，以反转录得到的cDNA为模板作PCR扩增，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收试剂盒回收PCR产物；

③pGEX-4T-1-Lysi2表达载体的构建：

将pGEX-4T-1载体和胶回收后的gLysi2 PCR产物分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，电泳检测并分别胶回收纯化，然后用T4 DNA连接酶将其于恒温水浴锅中连接反应，连接产物转化到大肠杆菌DH5α，进行培养，挑取单菌落以primer-Lysi2引物作PCR鉴定，阳性克隆按1％比例扩大培养，扩增后提取质粒。

进一步，所述步骤②中，用于序列扩增的专一性引物的上游引物为Pc-Lysi2-EcoRI：5‘(TACTCA GAATTCCTGGTGGTCTTTTCTGCGGC)3’；

用于序列扩增的专一性引物的下游引物为Pc-Lysi2-Not I：5‘(TACTCA GCGGCCGCGCCGCAGAAAAGACCACCAGTTAT)3’。

进一步，所述步骤③后还需要进行GST-gLysi2融合蛋白的诱导表达：将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导表达过夜，收集菌体；用PBS重悬菌体，4℃，超声波破碎6min，超声破碎后菌液4℃，10000r/min离心20min，分离上清和沉淀；取各10μL，进行SDS-PAGE电泳分析。

进一步，所述GST-gLysi2融合蛋白的诱导表达后，还需进行融合蛋白的纯化，收集诱导后菌体超声破碎的沉淀，变复性透析纯化，进行12％的SDS-PAGE电泳。

进一步，所述融合蛋白的纯化方法具体包括以下步骤：

①沉淀使用20mL buffer A(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH 8.0)充分悬起，混匀，4℃离心10000rpm 20min，去除上清，重复操作一次；

②对步骤①的沉淀使用20mLbuffer B(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M脲，pH8.0)充分悬起，混匀，4℃离心10000rpm 20min，去除上清，重复操作一次；

③对步骤②的沉淀使用20mL buffer C(0.1M Tris-HCl，10mM DTT，8M脲，pH8.0)充分悬起，混匀，置于37℃恒温摇床上以200rpm快速震荡1h，4℃离心10000rpm 10min，保留上清，去除沉淀；

④将步骤③得到的上清装入透析袋中，置于50倍体积透析液(0.1M Tris-HCl，5mMEDTA，5mM Cysteins，pH8.0)中，4℃下透析16h以上；

⑤将步骤④的透析后产物在4℃条件下冷冻离心10000rpm 10min，保留上清，去除沉淀，得到纯化产物。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明主要是发现在克氏原螯虾体内存在一种i型溶菌酶gLysi2具有有效的抗病毒作用，特别是对WSSV病毒，有极强的抑制作用，通过实验表明，通过注射gLysi2蛋白能明显抑制WSSV在虾体内的复制水平。

附图说明

图1是本发明实施例提供的gLysi2的重组蛋白的SDS-PAGE分析图；

图2是本发明实施例分为3组实验后的WSSV复制情况对照图；

图3是本发明实施例提供的gLysi2的对克氏原螯虾存活的影响图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供了一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因，所述gLysi2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

上述克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因在抗对虾白斑综合症领域能够有极为广泛的应用。

可以利用上述克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因编码，制备一种gLysi2蛋白，所述gLysi2蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2。其SDS-PAGE分析图见图1。

上述的gLysi2蛋白在对虾白斑综合症治疗领域的具有极为广泛的应用。直接注射上述蛋白给虾类，即可让虾类获得对对虾白斑综合症的免疫能力。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述gLysi2蛋白构建的表达载体，所述表达载体为pGEX-4T-1-Lysi2。

本发明的另一目的在于提供一种所述表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：

①RNA提取及反转录：

选取三只克氏原螯虾，抽血解剖取组织样:血淋巴、心、肝、鳃、胃、肠，采用TRIzol法取总RNA。检测RNA纯度及浓度，经琼脂糖凝胶电泳检测通过Bio-Rad凝胶成像仪分析总RNA质量；根据反转录说明书操作步骤反转录合成cDNA。

②Lysi2全长编码区基因扩增：

设计用于序列扩增的专一性引物。

所述的用于序列扩增的专一性引物的上游引物为Pc-Lysi2-EcoR I：5‘(TACTCAGAATTCCTGGTGGTCTTTTCTGCGGC)3’；

所述的用于序列扩增的专一性引物的下游引物为Pc-Lysi2-Not I：5‘(TACTCA GCGGCCGCGCCGCAGAAAAGACCACCAGTTAT)3’。

以反转录得到的cDNA为模板作PCR扩增；建立25μL PCR反应体系，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，54℃退火30s，72℃延伸35s，35次循环后72℃延伸8min；扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收试剂盒回收PCR产物。

③pGEX-4T-1-Lysi2表达载体的构建：

将pGEX-4T-1载体和胶回收后的gLysi2 PCR产物分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，电泳检测并分别胶回收纯化，然后用T4 DNA连接酶将其于恒温水浴锅16℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌DH5α，37℃培养2h，在含100μg/mL的氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上生长，挑取单菌落以primer-Lysi2引物作PCR鉴定，阳性克隆按1％比例扩大培养，扩增后提取质粒，最后送公司测序验证。

进一步，pGEX-4T-1-Lysi2表达载体的构建后，还需进行：

GST-gLysi2融合蛋白的诱导表达：将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆菌落，于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导表达过夜，收集菌体；用PBS重悬菌体，4℃，超声波破碎6min，超声破碎后菌液4℃，10000r/min离心20min，分离上清和沉淀；取各10μL，进行SDS-PAGE电泳分析。

进一步，pGEX-4T-1-Lysi2表达载体的构建后，还需进行融合蛋白的纯化：

诱导GST-gLysi2融合蛋白的表达，收集诱导后菌体超声破碎的沉淀，变复性透析纯化，进行12％的SDS-PAGE电泳。

进一步，融合蛋白的纯化的方法具体包括：

①沉淀使用20mL buffer A(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH 8.0)充分悬起，混匀，4℃离心10000rpm 20min，去除上清，重复操作一次；

②对步骤①的沉淀使用20mLbuffer B(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M脲，pH8.0)充分悬起，混匀，4℃离心10000rpm 20min，去除上清，重复操作一次；

③对步骤②的沉淀使用20mL buffer C(0.1M Tris-HCl，10mM DTT，8M脲，pH8.0)充分悬起，混匀，置于37℃恒温摇床上以200rpm快速震荡1h，4℃离心10000rpm 10min，保留上清，去除沉淀；

④将步骤③得到的上清装入透析袋中，置于50倍体积透析液(0.1M Tris-HCl，5mMEDTA，5mM Cysteins，pH8.0)中，4℃下透析16h以上；

⑤将步骤④的透析后产物在4℃条件下冷冻离心10000rpm 10min，保留上清，去除沉淀，得到纯化产物。

动物实验：

取本发明实施例制备的gLysi2蛋白，标签蛋白。标签蛋白采用GST：谷胱甘肽巯基转移酶，是真核细胞天然存在的大小约25-26kDa的蛋白，GST能够快速折叠稳定并且具有良好的溶解性，因而可以提高融合蛋白的可溶性和提高融合蛋白的表达量。在本发明实施例中gLysi2蛋白携带有GST作标签，故使用GST作为标签蛋白作为实验组别的对照。

取三组养殖的克氏原螯虾，分别对前两组组克氏原螯虾注射gLysi2蛋白和标签蛋白，第三组克氏原螯虾不注射任何药物。

在注射蛋白1h后，3组同时注射WSSV。WSSV感染24h后提取总蛋白，检测WSSV的复制情况。β-Actin作为对照，结果显示，与对照组相比，注射gLysi2蛋白能明显抑制WSSV在虾体内的复制水平。

如图3所示，两组克氏原螯虾在分别注射gLysi2和GST蛋白后1h注射WSSV每隔24h观察并统计克氏原螯虾剩余的存活数量所做的存活率折线图。折线图中分别为gLysi2组与GST-Tag组，统计两组1-7d克氏原螯虾存活数量对比图显示出在gLysi2组的克氏原螯虾的存活数量是高于GST-Tag组的，进一步验证了gLysi2具有抗对虾白斑综合症病毒能力的同时也验证了gLysi2能够提高克氏原螯虾在感染WSSV后的存活率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种克氏原螯虾i型溶菌酶gLysi2基因及其编码的gLysi2蛋白

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 352

<212> DNA

<213> 克氏原螯虾(gLysi2)

<400> 1

aggtggtctt ttctgcggcc ccttccgcat gattcgggaa tactggattg acgctggtag 60

acccattatc aaaggcgacg ataagacgtc ccgagacgcg tttaaaaact gtgcccttga 120

cctgcactgt tctgccacgg ccgtccagaa ctacttcaag agatacgctt ttaatggccg 180

catttcccca gactgtaacg gagatggaga ggtcgactgt gttgacttgg ctcgcataca 240

caagctgggg ctcaacggct gcaaacgcgc gtccttcacc gaaacaaatt tctacaagag 300

atttgcttcc tgttggaagg tggtcacgga ggcaaaaagg ttctagtcaa ta 352

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Gly Leu Phe Cys Gly Pro Phe Arg Met Ile Arg Glu Tyr Trp Ile

1 5 10 15

Asp Ala Gly Arg Pro Ile Ile Lys Gly Asp Asp Lys Thr Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Phe Lys Asn Cys Ala Leu Asp Leu His Cys Ser Ala Thr Ala Val

35 40 45

Gln Asn Tyr Phe Lys Arg Tyr Ala Phe Asn Gly Arg Ile Ser Pro Asp

50 55 60

Cys Asn Gly Asp Gly Glu Val Asp Cys Val Asp Leu Ala Arg Ile His

65 70 75 80

Lys Leu Gly Leu Asn Gly Cys Lys Arg Ala Ser Phe Thr Glu Thr Asn

85 90 95

Phe Tyr Lys Arg Phe Ala Ser Cys Trp Lys Val Val Thr Glu Ala Lys

100 105 110

Arg Phe