细菌视紫红质的可溶化表达载体及其表达方法

文档序号：1731600 发布日期：2019-12-20 浏览：20次 >En<

阅读说明：本技术 细菌视紫红质的可溶化表达载体及其表达方法 (Soluble expression vector of bacteriorhodopsin and expression method thereof ) 是由周敏马文龙卢颖洪于 2018-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种细菌视紫红质的可溶化表达载体及其表达方法。所述载体将除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA整合到pET28a质粒中得到pET28a-ΔspMBP载体；将截短的人类载脂蛋白cDNA整合到pET28a-ΔspMBP载体中得到pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；将细菌视紫红质合成基因整合到pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体中,得到细菌视紫红质的可溶化表达载体。本发明的细菌视紫红质的可溶化表达载体,实现了天然含量极少的细菌视紫红质的大量表达,达到全蛋白的40％左右,同时提高了细菌视紫红质的可溶性且表达的蛋白没有形成包涵体。(The invention discloses a soluble expression vector of bacteriorhodopsin and an expression method thereof. The vector integrates the maltose-binding protein cDNA of which the N-terminal signal peptide is removed into a pET28a plasmid to obtain a pET28 a-delta spMBP vector; integrating the truncated human apolipoprotein cDNA into pET28a- Δ spMBP vector to obtain pET28a- Δ spMBP-ApoAI-His vector; integrating the bacteriorhodopsin synthesis gene into a pET28 a-delta spMBP-ApoAI-His vector to obtain the bacteriorhodopsin soluble expression vector. The soluble expression vector of the bacteriorhodopsin realizes the mass expression of the bacteriorhodopsin with very little natural content, reaches about 40 percent of total protein, simultaneously improves the solubility of the bacteriorhodopsin and ensures that the expressed protein does not form an inclusion body.)

技术领域

本发明属于蛋白表达载体技术领域，涉及一种细菌视紫红质的可溶化表达载体及其表达方法。

背景技术

光敏蛋白是存在于细胞膜上的一类感光蛋白，当其受到光刺激时能够改变细胞膜内外的阴阳离子浓度从而改变膜电位，控制细胞信号和内外离子浓度等功能，现已作为光遗传学手段中的重要工具。细菌视紫红质是其中研究较早的一种蛋白，对于其结构与功能的联系的探究很有意义。但是从生物组织中提取的细菌视紫红质量非常少，若要达到一定的剂量用于研究成本很高。根据文献1(POMPEJUS M,et al.High‐yield production ofbacteriorhodopsin via expression of a synthetic gene in Escherichia coli[J].The FEBS Journal,1993,211(1‐2):27-35.)，在大肠杆菌中表达的细菌视紫红质以包涵体形式存在，其天然构象被破坏，而且表达量并不是特别高，后续探究仍很困难。因此使细菌视紫红质大量表达将为后续研究提供便利。文献2(Mizrachi D,et al.Making water-soluble integral membrane proteins in vivo using an amphipathic proteinfusion strategy[J].Nature communications,2015,6:6826.)提出了融合表达的策略来表达膜蛋白，但是其使用的OspA诱导蛋白对于膜蛋白的表达量的提高并不是特别明显。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细菌视紫红质的可溶化表达载体。该载体以pET28a质粒作为骨架，在细菌视紫红质N端连接了去除信号肽的麦芽糖结合蛋白作为诱导蛋白，在细菌视紫红质C端连接截短的人载脂蛋白A1包裹细菌视紫红质的脂溶性表面，在一定程度上提高细菌视紫红质的表达量，并增强了融合蛋白的水溶性。

实现本发明目的的技术方案如下：

细菌视紫红质的可溶化表达载体，所述的载体为pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His，其以pET28a质粒为骨架，依次整合除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，ΔspMBP连接细菌视紫红质N端基因序列，细菌视紫红质C端基因序列连接截短的人载脂蛋白cDNA即ApoAI*。

本发明还提供上述细菌视紫红质的可溶化表达载体的构建方法，该方法首先PCR扩增pMBP-p质粒，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，将ΔspMBP整合到pET28a质粒中得到pET28a-ΔspMBP载体；PCR扩增pET28a-ApoAI质粒，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，将ApoAI*整合到pET28a-ΔspMBP载体中得到pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；PCR扩增密码子优化过的细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,bR)合成基因，将其整合到pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体中，得到细菌视紫红质的可溶化表达载体pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His，具体步骤如下：

步骤1，先将pMBP-p质粒进行PCR扩增，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP(SEQ.NO.(7))，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对ΔspMBP和pET28a质粒进行酶切，连接反应得到pET28a-ΔspMBP载体；

步骤2，将pET28a-ApoAI质粒进行PCR扩增，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*(SEQ.NO.(8))，用HindⅢ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对ApoAI*和pET28a-ΔspMBP质粒进行酶切，在ApoAI*末端无终止子的情况下，引入pET28a本身所带的His标签，连接反应得到pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；

步骤3，将密码子优化过的细菌视紫红质DNA(SEQ.NO.(9))进行PCR扩增，用NdeⅠ限制性核酸内切酶和HindⅢ限制性核酸内切酶对细菌视紫红质DNA和pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His质粒进行酶切，连接反应得到pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His载体。

所述的优化为将原有序列中的对于大肠杆菌K-12菌株而言的稀有密码子和不利于蛋白翻译的碱基替换成易于在宿主菌中翻译表达的碱基，即增强mRNA的稳定性、降低mRNA翻译成蛋白时中断的可能性。

进一地，本发明还提供上述细菌视紫红质的可溶化表达载体的表达方法，具体步骤如下：将细菌视紫红质的可溶化表达载体pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His转化到大肠杆菌Tuner(DE3)中，挑选阳性单克隆菌进行扩大培养和诱导表达，收集菌液，离心得到表达细菌视紫红质的菌体。

优选地，所述的诱导表达过程中，采用异丙基硫代半乳糖苷为诱导物，诱导时间为1h。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本发明的细菌视紫红质的可溶化表达载体，其融合表达的蛋白产量可观，达到全蛋白的40％左右。本发明提高了细菌视紫红质的可溶性且表达的蛋白没有形成包涵体，说明二硫键成功形成，对后续细菌视紫红质的结构学研究有重要意义。

附图说明

图1为细菌视紫红质DNA的PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为细菌视紫红质和pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-6His载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图。

图3为pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His载体示意图。

图4为pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His分别在BL21(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)、Tuner(DE3)中表达结果的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图。

图5为pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His在Tuner(DE3)中表达针对诱导物浓度优化的DotBlot图。

图6为pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His在Tuner(DE3)中表达针对诱导物浓度优化的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE图。

图7为pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His在Tuner(DE3)中表达针对诱导时间优化的DotBlot图。

图8为pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His在Tuner(DE3)中表达针对诱导时间优化的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE图。

图9为探究融合表达结构对细菌视紫红质表达量影响的Western Blot图。

图10为探究融合表达结构对细菌视紫红质表达量影响的Western Blot图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例中所用实验材料如下：

1.细胞来源

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)、Tuner(DE3)细胞购自武汉灵淼生物公司。

2.质粒来源

pMBP-p质粒购自武汉灵淼生物公司；pET28a、pET28a-ApoAI质粒购自MERK公司。

3.引物来源

合成引物均来自上海生工生物有限公司。

4.主要试剂

胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、Tris-baes均购自Sigma公司；限制性核酸内切酶购自Thermo Fisher公司；rTaq酶、T4连接酶购自Takara公司。质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。兔源Anti-His mAb购自CST公司，兔抗HRP标记二抗购自Jackson公司；显影液及定影液购自Tanon公司。

实施例1：细菌视紫红质的可溶化表达载体的构建方法

1.细菌视紫红质的PCR扩增。

按照表1构建PCR扩增反应体系：

表1细菌视紫红质PCR反应体系配制表

PCR结果如图1所示，lane1为DL5000DNAmarker，lane3、4为细菌视紫红质PCR产物。

2.pET28a-ΔspMBP的构建方法：

a)根据从武汉淼灵生物所购得的pMBP-p质粒，以pMBP-p质粒为模板，经PCR反应，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA。PCR反应体系配置如表2所示。

表2 MBP-cDNA的PCR反应体系配制表

b)回收除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA，用NcoⅠ和NdeⅠ双酶切回收产物和pET28a载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA和pET28a载体片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。

c)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。

d)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

e)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NcoⅠ和NdeⅠ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到pET28a-ΔspMBP载体。

3.pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His构建方法：

a)根据购自MERK的pET28a-ApoAI质粒，根据pET28a-ΔspMBP质粒的多克隆位点特点，在ApoAI*的上游设计引入HindⅢ限制性核酸内切酶位点，详细序列见SEQ.NO.(3)；下游设计引入NotⅠ限制性核酸内切酶位点，详细序列见SEQ.NO.(4)。在ApoAI*末端无终止子的情况下，可引入pET28a本身所带的His标签。以原有pET28a-ApoAI载体为模板，经PCR反应，得到截短的人类载脂蛋白ApoAI*(Δ1-43)的cDNA。

b)回收截短人类载脂蛋白ApoAI*(Δ1-43)的cDNA，用HindⅢ和NotⅠ双酶切回收产物和pET28a-ΔspMBP载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的截短人类载脂蛋白ApoAI*(Δ1-43)的cDNA和pET28a-ΔspMBP载体片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。

c)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。

e)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用HindⅢ和NotⅠ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体。

4.pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His载体的构建

a)回收1中PCR得到的bR的cDNA，用NdeⅠ和HindⅢ双酶切回收产物和pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的细菌视紫红质DNA(bR)的cDNA和pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。

b)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。

c)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

d)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NdeⅠ和HindⅢ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到的pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His载体，其中ΔspMBP-bR-ApoAI*-His段核苷酸序列如序列表SEQ NO.(10)。构建得到的pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His质粒图谱如图3所示。

实施例2：细菌视紫红质在BL21(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)、Tuner(DE3)四种不同菌种中表达探究。

将鉴定正确的pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His质粒分别转入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)、Tuner(DE3)中，得到稳定转化的单菌落；分别接种单菌落到5mL含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在200转/分钟、37℃下培养过夜，得到过夜菌。在200转/分钟、37℃下培养过夜，得到过夜菌4000转/分钟离心15分钟收集菌体。将菌体重悬于PBS缓冲液中，后经过4000转/分钟离心15分钟，弃去上清，即得到包含ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His的菌体。取部分菌体向其中加入含SDS的样品缓冲液95℃处理7分钟，将四个样品跑SDS-PAGE，如图4所示，可以看出Tuner(DE3)中目标条带较明显。

实施例3：探究诱导物浓度对表达量的影响。

将含有pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His质粒Tuner(DE3)接种单菌落到5mL含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在200转/分钟、37℃下培养过夜，得到过夜菌。将过夜菌接种到TB培养基中，接种比例为1:250，在230转/分钟，37℃下培养至OD₆₀₀达到分别加入终浓度为1mM、2mM、3mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，37℃培养3h，测量OD₆₀₀后取样，保证各个样品取出的发酵液中总菌量一致。4000转/分钟离心15分钟收集菌体。将菌体重悬于PBS缓冲液中，后经过4000转/分钟离心15分钟，弃去上清，即得到不同IPTG浓度诱导下的包含ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His的菌体。将上述十份样品用同样体积PBS缓冲液重悬，使用含SDS的2X样品缓冲液95℃热处理7min。取5μL处理后的样品做Anti-His的Dot Blot，结果如图5，可以看出，IPTG浓度从1mM到20mM，目的蛋白数量逐渐增加，而超过20mM后，目的蛋白数量变化不大。将上述变性后的样品进行SDS-PAGE检测，如图6，结论同Dot Blot。

实施例4：探究诱导表达时间对表达量的影响。

将含有pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His质粒Tuner(DE3)接种单菌落到5mL含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在200转/分钟、37℃下培养过夜，得到过夜菌。将过夜菌接种到TB培养基中，接种比例为1:250，在230转/分钟，37℃下培养至OD₆₀₀达到加入终浓度为20mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，37℃培养，每隔1h取出部分发酵液，到5h为止，保证每次取出的发酵液中总菌量一致。4000转/分钟离心15分钟收集菌体。将菌体重悬于PBS缓冲液中，后经过4000转/分钟离心15分钟，弃去上清，即得到六份包含ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His的不同诱导时间的菌体(0h、1h、2h、3h、4h、5h)。将六份样品用同样体积PBS缓冲液重悬，使用含SDS的2X样品缓冲液95℃热处理7min。取5μL处理后的样品做Anti-His的Dot Blot，结果如图7，可以看出，从1h到5h，目的蛋白数量逐渐减少。将上述变性后的样品进行SDS-PAGE检测，如图8，结论同Dot Blot。

实施例5：探究融合表达载体对表达量和可溶性的影响。

1.关于表达量的半定量比较

将ΔspMBP-bR-ApoA1*-6His(MBA)、bR-6His(BR)、bR-ApoA1*-6His(BA)、ΔspMBP-bR-6His(MB)四种不同的结构的表达基因分别***到pET-28a+质粒中，验证正确后转入Tuner(DE3)细胞中进行表达，表达条件按照上文中最优表达量的条件进行。而后测其OD₆₀₀数值，据此将四种发酵液稀释到同样浓度。进行SDS-PAGE分离蛋白。

由图9的Western blot结果可以看出MBA表达量最高，与考马斯亮蓝的结果相吻合。有ΔspMBP协助表达的细菌视紫红质表达量居其次，单独的细菌视紫红质也有少量表达，而ApoAI*融合表达的细菌视紫红质却未看到表达。

由以上对照实验可以证明，ΔspMBP和ApoAI*共同作用对于细菌视紫红质的表达量有显著提升。

2.关于可溶化程度的半定量比较

取等量bR-6His(BR)样品和ΔspMBP-bR-ApoA1*-6His(MBA)样品使用PBS(磷酸盐缓冲液)重新悬浮后进行超声破碎，而后离心分离上清与沉淀，分别加与PBS溶液等体积的2x loading buffer(+β-巯基乙醇)在95℃环境下热变性5分钟。做Western Blot半定量验证，由图10可以看出，BR样品的上清中观察不到明显条带，而在其沉淀中有浅浅的一条带；而MBA样品中可以看出在上清中的目标蛋白占据整个样品中的目标蛋白的60％左右，可见，融合表达结构对于细菌视紫红质的可溶化程度有着显著的提高。

序列表

<110> 南京理工大学

<120> 细菌视紫红质的可溶化表达载体及其表达方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catgccatgg gccatcatca tcatcatcat catcatcatc acagcagcgg atccaaattc 60

gagaaagata ccgg 74

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatcatatgg ctgccgcgcg gcaccagaga accactgcca gatccctgca gattagtctg 60

cgcgtctttc 70

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcaagctta tgaagctcct tgacaactgg gacagcg 37

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atttgcggcc gcctgggtat tcagcttttt agtatattc 39

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaattccat atgctggaac tgctgcc 27

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcgctggtc gccgcatcgc tggtcgccgc 30

<210> 7

<211> 1032

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

atgggcaaat tcgagaaaga taccggaatt aaagtcaccg ttgagcatcc ggataaactg 60

gaagagaaat tcccacaggt tgcggcaact ggcgatggcc ctgacattat cttctgggca 120

cacgaccgct ttggtggcta cgctcaatct ggcctgttgg ctgaaatcac cccggacaaa 180

gcgttccagg acaagctgta tccgtttacc tgggatgccg tacgttacaa cggcaagctg 240

attgcttacc cgatcgctgt tgaagcgtta tcgctgattt ataacaaaga tctgctgccg 300

aacccgccaa aaacctggga agagatcccg gcgctggata aagaactgaa agcgaaaggt 360

aagagcgcgc tgatgttcaa cctgcaagaa ccgtacttca cctggccgct gattgctgct 420

gacgggggtt atgcgttcaa gtatgaaaac ggcaagtacg acattaaaga cgtgggcgtg 480

gataacgctg gcgcgaaagc gggtctgacc ttcctggttg acctgattaa aaacaaacac 540

atgaatgcag acaccgatta ctccatcgca gaagctgcct ttaataaagg cgaaacagcg 600

atgaccatca acggcccgtg ggcatggtcc aacatcgaca ccagcaaagt gaattatggt 660

gtaacggtac tgccgacctt caagggtcaa ccatccaaac cgttcgttgg cgtgctgagc 720

gcaggtatta acgccgccag tccgaacaaa gagctggcaa aagagttcct cgaaaactat 780

ctgctgactg atgaaggtct ggaagcggtt aataaagaca aaccgctggg tgccgtagcg 840

ctgaagtctt acgaggaaga gttggcgaaa gatccacgta ttgccgccac tatggaaaac 900

gcccagaaag gtgaaatcat gccgaacatc ccgcagatgt ccgctttctg gtatgccgtg 960

cgtactgcgg tgatcaacgc cgccagcggt cgtcagactg tcgatgaagc cctgaaagac 1020

gcgcagacta at 1032

<210> 8

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaagctcc ttgacaactg ggacagcgtg acctctacct tcagtaaact tcgcgaacaa 60

ctgggccccg tgacgcagga attctgggac aacctggaaa aagaaaccga gggactgcgt 120

caggaaatgt ccaaagattt agaagaggtg aaggccaagg ttcagccata tctcgatgac 180

tttcagaaaa aatggcagga agagatggaa ttatatcgtc aaaaggtgga accgctgcgt 240

gcggaactgc aagagggggc acgccaaaaa ctccatgagc tccaagagaa gctcagccca 300

ttaggcgaag aaatgcgcga tcgcgcccgt gcacatgttg atgcactccg gactcatttg 360

gcgccgtatt cggatgaact tcgccagcgt ttggccgcac gtctcgaggc gctgaaagaa 420

aacgggggtg cccgcttggc tgagtaccac gcgaaagcga cagaacacct gagcaccttg 480

agcgaaaaag cgaaaccggc gctggaagat ctacgccagg gcttattgcc tgttcttgag 540

agctttaaag tcagttttct gtcagctctg gaagaatata ctaaaaagct gaatacccag 600

gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactga 636

<210> 9

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgctggaac tgctgccgac cgcggtggaa ggtgtgagcc aggcgcagat taccggtcgt 60

accggtcgtc cggaatggat ctggctggcg ctgggtaccg cgctgatggg cctgggtacc 120

ctgtattttc tggtgaaagg tatgggcgtg agcgatccgg atgcgaaaaa attttatgcg 180

atcaccaccc tggtgccggc gatcgcgttt accatgtatc tgagcatgct gctgggttat 240

ggcctgacca tggtgccgtt tggcggcgaa cagaacccga tttattgggc gcgctatgcg 300

gattggctgt ttaccacccc gctgctgctg ctggatctgg cgctgctggt ggatgcggat 360

cagggcacca tcctggcgct ggtgggcgcg gatggcatca tgatcggtac cggcctggtg 420

ggcgcgctga ccaaagtgta tagctatcgt tttgtgtggt gggcgattag caccgcggcg 480

atgctgtata ttctgtatgt gctgtttttt ggttttacca gcaaagcgga aagcatgcgt 540

ccggaagtgg cgagcacctt taaagtgctg cgtaacgtga ccgtggtgct gtggagcgcg 600

tatccggtgg tgtggctgat tggtagcgaa ggcgcgggta ttgtgccgct gaatatcgaa 660

accctgctgt ttatggtgct ggatgtgagc gcgaaagtgg gttttggcct gattctgctg 720

cgtagccgtg cgatttttgg tgaagcggaa gcgccggaac cgagcgcggg tgatggcgcg 780

gcggcgacca gcgattaa 798

<210> 10

<211> 2520

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10