阅读说明：本技术 恶臭假单胞菌kt2440蛋白同源表达载体的构建及表达、纯化方法 (Construction, expression and purification method of pseudomonas putida KT2440 protein homologous expression vector ) 是由 崔格特 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种恶臭假单胞菌KT2440蛋白同源表达载体的构建及表达、纯化方法,首先构建含10×His标签的表达载体,将目的蛋白基因插入该表达载体中,再将含有目的蛋白的表达载体转入恶臭假单胞菌KT2440中诱导表达。表达出目的蛋白后,通过亲和层析纯化的方法获得纯目的蛋白,蛋白酶切除10×His标签,获得纯目的蛋白。本发明提出的蛋白表达载体,使得恶臭假单胞菌KT2440中无法通过异源表达的蛋白得到纯化。(The invention discloses a construction, expression and purification method of a pseudomonas putida KT2440 protein homologous expression vector, which comprises the steps of firstly constructing an expression vector containing a 10 × His tag, inserting a target protein gene into the expression vector, and then transferring the expression vector containing the target protein into pseudomonas putida KT2440 for induced expression. After the target protein is expressed, the pure target protein is obtained by an affinity chromatography purification method, and the protease cuts off the 10 × His label to obtain the pure target protein. The protein expression vector provided by the invention can purify proteins which cannot be expressed by heterologous expression in pseudomonas putida KT 2440.)

恶臭假单胞菌KT2440蛋白同源表达载体的构建及表达、纯化 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及恶臭假单胞菌KT2440蛋白同源表达载体的构建及表达、纯化方法。

背景技术

恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)是重要的模式环境微生物菌株，其基因组在2002年被解析，也是第一个被美国***重组DNA委员会认定对环境安全的革兰氏阴性菌株，恶臭假单胞菌KT2440具有广泛的代谢多样性和对不同环境的强适应性。自被分离发现以来，恶臭假单胞菌KT2440作为模式菌株经常被用于通用的基础代谢途径的研究，除此之外，恶臭假单胞菌KT2440及其衍生菌株还被广泛地应用于各种生物技术应用中。表达和纯化蛋白是研究细菌代谢机理和基因功能的重要过程。目前使用的恶臭假单胞菌KT2440蛋白表达纯化方法为异源表达法，通过特定载体在大肠杆菌中表达目的蛋白，但使用该方法时常会出现蛋白不能正确折叠而形成包涵体沉淀，造成后续蛋白难纯化的问题。

根据目前常用的实验技术，若异源表达的过程中出现包涵体现象，即目的蛋白不可溶或可溶性极差，则需要花费大量精力和时间优化蛋白诱导条件，或更换表达载体和融合标签。如果仍不能解决包涵体问题，则需要进行一系列复杂的操作将蛋白变性和复性，此过程同样需要花费大量时间和精力，而且难以保证最终得到的目的蛋白具有正常的结构和活性。同源表达较之异源表达，可有效避免目的蛋白在分泌过程中形成包涵体的问题，然而目前并没有揭示直接在恶臭假单胞菌KT2440中同源表达蛋白并纯化的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种恶臭假单胞菌KT2440蛋白同源表达载体的构建及表达、纯化方法，在恶臭假单胞菌KT2440中原位表达蛋白，避免了蛋白表达过程中出现包涵体，既而进行优化蛋白诱导条件或是将其变性再复性等一系列花费大量时间的操作，方便快捷，蛋白表达纯化效果好。

本发明的技术方案是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种恶臭假单胞菌KT2440蛋白同源表达载体的构建方法，包括如下步骤：

S1、合成编码10×His及Thrombin蛋白酶识别位点的序列，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，并构建表达载体pVLT33-10×His；

S2、扩增目的蛋白X的基因x，将基因x连接到表达载体pVLT33-10×His上，得到表达载体pVLT33-10×His-x。

在以上技术方案的基础上，步骤S1中，在构建所述表达载体pVLT33-10×His过程中，在编码10×His及Thrombin蛋白酶识别位点的序列上带上翻译起始密码子序列ATG。

在以上技术方案的基础上，所述表达载体pVLT33-10×His的完整核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在以上技术方案的基础上，所述表达载体pVLT33-10×His中在编码10×His及Thrombin蛋白酶识别位点的序列的下游有多克隆位点，用于***目的基因，根据目的基因碱基数目***到合适酶切位点之间，使得目的蛋白能够表达。

另一方面，本发明提供了一种恶臭假单胞菌KT2440蛋白的表达方法，包括：将采用上述方法制备的表达载体pVLT33-10×His-x转入恶臭假单胞菌KT2440中诱导表达，得到融合蛋白10×His-X。

再者，本发明还提供了一种恶臭假单胞菌KT2440蛋白的纯化方法，包括：将得到的融合蛋白10×His-X利用Ni离子亲和层析柱进行纯化，然后用凝血酶切除10×His标签，得到纯目的蛋白X。

本发明的恶臭假单胞菌KT2440蛋白同源表达载体的构建及表达、纯化方法相对于现有技术具有以下有益效果：

1.通过在超表达载体上将目的蛋白与10×His标签的融合表达来实现在恶臭假单胞菌KT2440中同源表达和纯化，提高蛋白表达效率，解决目前蛋白在异源表达中形成包涵体后难以纯化的难题；

2.10×His标签下游的多克隆位点可用于***各种目的蛋白基因，根据目的基因碱基数目***到合适酶切位点之间，使得目的蛋白与10×His标签能够融合表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1表达载体pVLT33-10×His的图谱；

图2为实施例2表达载体pVLT33-10×His-PP_0914的图谱；

图3为实施例2纯化目的蛋白PP_0914的SDS-PAGE检测图，1泳道为全细胞裂解液，2泳道为过亲和层析柱后洗脱的杂蛋白，3和4泳道为用250mM咪唑洗脱下来的PP_0914蛋白，M泳道为蛋白质Marker。

图4为对比例在大肠杆菌BL21(DE3)中纯化目的蛋白PP_0914的SDS-PAGE检测图，1泳道为全细胞裂解液，2泳道为用250mM咪唑从亲和层析柱上洗脱下来的PP_0914蛋白，M泳道为蛋白质Marker。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实验用的恶臭假单胞菌KT2440和大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)购买于北京全式金公司，生长于常规的LB培养基，选择生长所用的抗生素浓度为：50μg/mL Kan。实验所用的原始质粒pVLT33购买于生物技术公司，常见于市面。载体的克隆和蛋白的表达纯化步骤见分子克隆实验指南。

实施例1、整合载体的构建

S1、表达载体pVLT33-10×His的构建

利用引物对P1/P2，以商业化超表达载体pVLT33为模板，PCR反向扩增整个pVLT33质粒；得到PCR产物后用Takara公司的T4 DNA连接酶将产物自连；测序验证，确定10×His及Thrombin蛋白酶识别位点的序列完全正确，最终得到表达载体pVLT33-10×His。如图1所示的表达载体pVLT33-10×His中，tac promoter和lacI构成可诱导表达元件；10×His标签可以让目的蛋白基因表达的目的蛋白带上组氨酸标签；Thrombin表示凝血酶酶切位点，设计目的是用凝血酶将10×His标签和目的蛋白的融合蛋白切开，从而获得纯化的目的蛋白；EcoRI、SacI、KpnI、BamHI和XbaI是多克隆位点，可以将目的基因通过这些酶切位点连入表达载体pVLT33-10×His，从而进行表达。

S2、表达载体pVLT33-10×His-x的构建

将目的蛋白X的编码基因x连入pVLT33-10×His载体的EcoRI和BamHI位点之间，形成目的蛋白X的表达载体pVLT33-10×His-x。

实施例2、利用PP_0914蛋白作为目的蛋白来检测本发明的可行性

S1、表达载体pVLT33-10×His-PP_0914的构建

表达载体pVLT33-10×His-PP_0914的图谱如图2所示。PP_0914是恶臭假单胞KT2440中的一个磷酸二酯酶，负责降解第二信使分子c-di-GMP，调控菌株生物被膜和游动性。本发明用PP_0914蛋白作为目的蛋白来检验本发明的可行性。以恶臭假单胞菌KT2440基因组总DNA为模板，利用引物对P3/P4扩增出pp_0914基因，然后用EcoRI和BamHI连入pVLT33-10×His载体，测序验证，确定pp_0914基因***到pVLT33-10×His载体上，最终得到表达载体pVLT33-10×His-PP_0914。

S2、纯化目的蛋白

通过电转化将pVLT33-10×His-PP_0914载体导入恶臭假单胞菌KT2440中，培养至对数中期后，在16℃温度的条件下加0.5mM的IPTG诱导表达10h，收集菌液，破碎细胞，利用Ni离子亲和层析柱纯化10×His-PP_0914融合蛋白。用20mM浓度咪唑冲洗杂蛋白，待杂蛋白完全洗干净后，加入凝血酶，室温孵育20min，继续洗脱，将得到纯净的PP_0914蛋白。若不需要切除10×His标签，则在20mM浓度咪唑冲洗杂蛋白完成后，用250mM浓度咪唑将PP_0914蛋白洗脱下来，从而获得融合蛋白。用SDS-PAGE方法进一步验证纯化的PP_0914蛋白(如图3所示)。

对比例

通过电转化将实施例2步骤S1得到的pVLT33-10×His-PP_0914载体导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中诱导表达，采用实施例2步骤S2中同样方法得到纯PP_0914蛋白，并用SDS-PAGE方法进行验证(如图4所示)。因为表达载体在大肠杆菌中表达PP_0914蛋白时会形成包涵体，导致破碎细胞液中可溶性目的蛋白PP_0914含量很少，纯化得到的PP_0914蛋白量就极少。

表1本发明所用的引物序列

引物	DNA序列Sequence(5’-3’)	序列编号
			P1	cacagcagcggcctggtgccgcgcggcagcgaattcgagctcggtacccggg	SEQ ID No.3
P2	atgatgatgatgatgatgatgatgatggctgctgcccattgtttcctgtgtgaaattgtta	SEQ ID No.4
			P3	ccggaattcatgccatgcgcatggatta	SEQ ID No.5
P4	cgcggatcctcaggacaccgaaacccg	SEQ ID No.6

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉博欧特生物科技有限公司

<120> 恶臭假单胞菌KT2440蛋白同源表达载体的构建及表达、纯化方法

<130> 2019-9-20

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 69

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcat catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg 60

cgcggcagc 69

<210> 2

<211> 8194

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

agcttcacgc tgccgcaagc actcagggcg caagggctgc taaaggaagc ggaacacgta 60

gaaagccagt ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg 120

gacaagggaa aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg 180

atagctagac tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc 240

ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat 300

ctgatggcgc aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 360

tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 420

tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 480

ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga 540

cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 600

cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 660

cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 720

gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 780

gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 840

tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga 900

ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 960

cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 1020

gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 1080

gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 1140

gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca 1200

tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc 1260

cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac 1320

cccgggctcg atcccctcgc gagttggttc agctgctgcc tgaggctgga cgacctcgcg 1380

gagttctacc ggcagtgcaa atccgtcggc atccaggaaa ccagcagcgg ctatccgcgc 1440

atccatgccc ccgaactgca ggagtgggga ggcacgatgg ccgctttggg cctgtctcgg 1500

tcgatcattc agcccggctc atccttctgg cgtggcggca gaccgaacaa ggcgcggtcg 1560

tggtcgcgtt caaggtacgc atccattgcc gccatgagcc gatcctccgg ccactcgctg 1620

ctgttcacct tggccaaaat catggccccc accagcacct tgcgccttgt ttcgttcttg 1680

cgctcttgct gctgttccct tgcccgctcc cgctgaattt cggcattgat tcgcgctcgt 1740

tgttcttcga gcttggccag ccgatccgcc gccttgttgc tccccttaac catcttgaca 1800

ccccattgtt aatgtgctgt ctcgtaggct atcatggagg cacagcggcg gcaatcccga 1860

ccctactttg taggggaggg cgcacttacc ggtttctctt cgagaaactg gcctaacggc 1920

cacccttcgg gcggtgcgct ctccgagggc cattgcatgg agccgaaaag caaaagcaac 1980

agcgaggcag catggcgatt tatcacctta cggcgaaaac cggcagcagg tcgggcggcc 2040

aatcggccag ggccaaggcc gactacatcc agcgcgaagg caagtatgcc cgcgacatgg 2100

atgaagtctt gcacgccgaa tccgggcaca tgccggagtt cgtcgagcgg cccgccgact 2160

actgggatgc tgccgacctg tatgaacgcg ccaatgggcg gctgttcaag gaggtcgaat 2220

ttgccctgcc ggtcgagctg accctcgacc agcagaaggc gctggcgtcc gagttcgccc 2280

agcacctgac cggtgccgag cgcctgccgt atacgctggc catccatgcc ggtggcggcg 2340

agaacccgca ctgccacctg atgatctccg agcggatcaa tgacggcatc gagcggcccg 2400

ccgctcagtg gttcaagcgg tacaacggca agaccccgga gaagggcggg gcacagaaga 2460

ccgaagcgct caagcccaag gcatggcttg agcagacccg cgaggcatgg gccgaccatg 2520

ccaaccgggc attagagcgg gctggccacg acgcccgcat tgaccacaga acacttgagg 2580

cgcagggcat cgagcgcctg cccggtgttc acctggggcc gaacgtggtg gagatggaag 2640

gccggggcat ccgcaccgac cgggcagacg tggccctgaa catcgacacc gccaacgccc 2700

agatcatcga cttacaggaa taccgggagg caatagacca tgaacgcaat cgacagagtg 2760

aagaaatcca gaggcatcaa cgagttagcg gagcagatcg aaccgctggc ccagagcatg 2820

gcgacactgg ccgacgaagc ccggcaggtc atgagccaga ccaagcaggc cagcgaggcg 2880

caggcggcgg agtggctgaa agcccagcgc cagacagggg cggcatgggt ggagctggcc 2940

aaagagttgc gggaggtagc cgccgaggtg agcagcgccg cgcagagcgc ccggagcgcg 3000

tcgcgggggt ggcactggaa gctatggcta accgtgatgc tggcttccat gatgcctacg 3060

gtggtgctgc tgatcgcatc gttgctcttg ctcgacctga cgccactgac aaccgaggac 3120

ggctcgatct ggctgcgctt ggtggcccga tgaagaacga caggactttg caggccatag 3180

gccgacagct caaggccatg ggctgtgagc gcttcgatat cggcgtcagg gacgcaccca 3240

ccggccagat gatgaaccgg gaatggtcag ccgccgaagt gctccagaac acgccatggc 3300

tcaagcggat gaatgcccag ggcaatgacg tgtatatcag gcccgccgag caggagcggc 3360

atggtctggt gctggtggac gacctcagcg agtttgacct ggatgacatg aaagccgagg 3420

gccgggagcc tgccctggta gtggaaacca gcccgaagaa ctatcaggca tgggtcaagg 3480

tggccgacgc cgcaggcggt gaacttcggg ggcagattgc ccggacgctg gccagcgagt 3540

acgacgccga cccggccagc gccgacagcc gccactatgg ccgcttggcg ggcttcacca 3600

accgcaagga caagcacacc acccgcgccg gttatcagcc gtgggtgctg ctgcgtgaat 3660

ccaagggcaa gaccgccacc gctggcccgg cgctggtgca gcaggctggc cagcagatcg 3720

agcaggccca gcggcagcag gagaaggccc gcaggctggc cagcctcgaa ctgcccgagc 3780

ggcagcttag ccgccaccgg cgcacggcgc tggacgagta ccgcagcgag atggccgggc 3840

tggtcaagcg cttcggtcat gacctcagca agtgcgactt tatcgccgcg cagaagctgg 3900

ccagccgggg ccgcagtgcc gaggaaatcg gcaaggccat ggccgaggcc agcccagcgc 3960

tggcagagcg caagcccggc cacgaagcgg attacatcga gcgcaccgtc agcaaggtca 4020

tgggtctgcc cagcgtccag cttgcgcggg ccgagctggc acgggcaccg gcaccccgcc 4080

agcgaggcat ggacaggggc gggccagatt tcagcatgta gtgcttgcgt tggtactcac 4140

gcctgttata ctatgagtac tcacgcacag aagggggttt tatggaatac gaaaaaagcg 4200

cttcagggtc ggtctacctg atcaaaagtg acaagggcta ttggttgccc ggtggctttg 4260

gttatacgtc aaacaaggcc gaggctggcc gcttttcagt cgctgatatg gccagcctta 4320

accttgacgg ctgcaccttg tccttgttcc gcgaagacaa gcctttcggc cccggcaagt 4380

ttctcggtga ctgatatgaa agaccaaaag gacaagcaga ccggcgacct gctggccagc 4440

cctgacgctg tacgccaagc gcgatatgcc gagcgcatga aggccaaagg gatgcgtcag 4500

cgcaagttct ggctgaccga cgacgaatac gaggcgctgc gcgagtgcct ggaagaactc 4560

agagcggcgc agggcggggg tagtgacccc gccagcgcct aaccaccaac tgcctgcaaa 4620

ggaggcaatc aatggctacc cataagccta tcaatattct ggaggcgttc gcagcagcgc 4680

cgccaccgct ggactacgtt ttgcccaaca tggtggccgg tacggtcggg gcgctggtgt 4740

cgcccggtgg tgccggtaaa tccatgctgg ccctgcaact ggccgcacag attgcaggcg 4800

ggccggatct gctggaggtg ggcgaactgc ccaccggccc ggtgatctac ctgcccgccg 4860

aagacccgcc caccgccatt catcaccgcc tgcacgccct tggggcgcac ctcagcgccg 4920

aggaacggca agccgtggct gacggcctgc tgatccagcc gctgatcggc agcctgccca 4980

acatcatggc cccggagtgg ttcgacggcc tcaagcgcgc cgccgagggc cgccgcctga 5040

tggtgctgga cacgctgcgc cggttccaca tcgaggaaga aaacgccagc ggccccatgg 5100

cccaggtcat cggtcgcatg gaggccatcg ccgccgatac cgggtgctct atcgtgttcc 5160

tgcaccatgc cagcaagggc gcggccatga tgggcgcagg cgaccagcag caggccagcc 5220

ggggcagctc ggtactggtc gataacatcc gctggcagtc ctacctgtcg agcatgacca 5280

gcgccgaggc cgaggaatgg ggtgtggacg acgaccagcg ccggttcttc gtccgcttcg 5340

gtgtgagcaa ggccaactat ggcgcaccgt tcgctgatcg gtggttcagg cggcatgacg 5400

gcggggtgct caagcccgcc gtgctggaga ggcagcgcaa gagcaagggg gtgccccgtg 5460

gtgaagccta agaacaagca cagcctcagc cacgtccggc acgacccggc gcactgtctg 5520

gcccccggcc tgttccgtgc cctcaagcgg ggcgagcgca agcgcagcaa gctggacgtg 5580

acgtatgact acggcgacgg caagcggatc gagttcagcg gcccggagcc gctgggcgct 5640

gatgatctgc gcatcctgca agggctggtg gccatggctg ggcctaatgg cctagtgctt 5700

ggcccggaac ccaagaccga aggcggacgg cagctccggc tgttcctgga acccaagtgg 5760

gaggccgtca ccgctgaatg ccatgtggtc aaaggtagct atcgggcgct ggcaaaggaa 5820

atcggggcag aggtcgatag tggtggggcg ctcaagcaca tacaggactg catcgagcgc 5880

ctttggaagg tatccatcat cgcccagaat ggccgcaagc ggcaggggtt tcggctgctg 5940

tcggagtacg ccagcgacga ggcggacggg cgcctgtacg tggccctgaa ccccttgatc 6000

gcgcaggccg tcatgggtgg cggccagcat gtgcgcatca gcatggacga ggtgcgggcg 6060

ctggacagcg aaaccgcccg cctgctgcac cagcggctgt gtggctggat cgaccccggc 6120

aaaaccggca aggcttccat agataccttg tgcggctatg tctggccgtc agaggccagt 6180

ggttcgacca tgcgcaagcg ccgcaagcgg gtgcgcgagg cgttgccgga gctggtcgcg 6240

ctgggctgga cggtaaccga gttcgcggcg ggcaagtacg acatcacccg gcccaaggcg 6300

gcaggctgac cccccccact ctattgtaaa caagacattt ttatctttta tattcaatgg 6360

cttattttcc tgctaattgg taataccatg aaaaatacca tgctcagaaa aggcttaaca 6420

atattttgaa aaattgccta ctgagcgctg ccgcacagct ccataggccg ctttcctggc 6480

tttgcttcca gatgtatgct cttctgctcc cgaacgccag caagacgtag cccagcgcgt 6540

cggccagctt gcaattcgcg ctaacttaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 6600

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 6660

ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg 6720

attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgt ggtttgcccc 6780

agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg 6840

gtatcgtcgt atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg 6900

gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg 6960

ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc 7020

cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc 7080

agacgcgccg agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat 7140

gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg 7200

atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc 7260

acagcaatgg catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc 7320

gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac 7380

accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac 7440

ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc 7500

agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt 7560

tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa 7620

gagacaccgg catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg 7680

aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgca ccattcgatg 7740

gtgtcaacgt aaatgccgct tcgccttcgc gcgcgaattg caagctgatc cgggcttatc 7800

gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg tggtatggct 7860

gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata 7920

atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca 7980

attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 8040

acaatgggca gcagccatca tcatcatcat catcatcatc atcacagcag cggcctggtg 8100

ccgcgcggca gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca 8160

tgcaagcttg gctgttttgg cggatgagag aaga 8194

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

cacagcagcg gcctggtgcc gcgcggcagc gaattcgagc tcggtacccg gg 52

<210> 4

<211> 61

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

atgatgatga tgatgatgat gatgatggct gctgcccatt gtttcctgtg tgaaattgtt 60

a 61

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

ccggaattca tgccatgcgc atggatta 28

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

cgcggatcct caggacaccg aaacccg 27