具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的详细说明：

利用P.putida KT2440基因组中的cadR基因SEQ ID No.1、启动子P_cadSEQ ID No.1以及 cadO操纵子SEQ ID No.6；大肠杆菌(Escherichia coli)pGN68的带有红色荧光蛋白基因 mcherrySEQ ID No.3、T7RNAPmutSEQ ID No.4和启动子P_T7SEQ ID No.5，其中红色荧光蛋白基因mcherrySEQ ID No.3经过恶臭假单胞菌密码子优化。在P.putida KT2440中实现了对镉离子全细胞生物传感器的构建。

本发明所用pCDFDuet-2、pGN68质粒作为构建镉离子生物传感器的检测与荧光蛋白的表达载体。其中，质粒pCDFDuet-2为商业化质粒，质粒pGN68序列如SEQ ID No.7所示。

LB培养基组成为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为蒸馏水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种可检测镉离子含量全细胞生物传感器p2T7RNAPmut-68的构建

1.质粒的构建(如图1所示)

通过PCR扩增得到的镉特异性启动子P_cadSEQ ID No.1和特异性结合蛋白基因cadR序列 SEQ ID No.2以及T7RNAPmutSEQ ID No.4(部分氨基酸序列如图2所示)。在片段cadR-P_cad两端分别加上XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点,在片段RBS-T7RNAPmut两端分别加上XhoⅠ和 EcoRⅠ酶切位点。通过PCR扩增得到的T7启动子P_T7SEQ ID No.5、cadO序列SEQ ID No.6 以及红色荧光蛋白基因mcherrySEQ ID No.3。在片段-P_T7-cadO-RBS-mcherry-两端分别加上 BamHI和EcoRⅠ酶切位点。使用FastDigest内切酶进行酶切，反应体系1)为：5μL 10*FD buffer、2.5μL XhoI、2.5μL EcoRⅠ、30μL加酶切位点的cadR-P_cad片段和10μL超纯水；反应体系2)为：5μL10*FD buffer、2.5μL XhoI、2.5μL EcoRⅠ、30μL加酶切位点的-RBS-T7RNAPmut- 片段和10μL超纯水。反应体系3)为：5μL 10*FD buffer、2.5μL BamHI、2.5μL EcoRⅠ、30μL 加酶切位点的-P_T7-cadO-RBS-mcherry-片段和10μL超纯水。反应条件为：37℃，2h。使用PCR 纯化试剂盒，将50μL酶切产物中，加入250μL Bingding Buffer溶液，混匀后加入吸附柱中，静置一分钟，10,000xg离心1分钟，弃出流出液。加入650μL Wash Buffer，10,000g离心1 分钟，弃出流出液。10,000xg离心2分钟，去除残留的Wash Buffer。将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入30μL Elution Buffer(Elution Buffer提前在65℃水浴锅中预热)，室温静置1分钟，10,000xg离心1分钟，洗脱酶切后的-cadR-P_cad-、RBS-T7RNAPmut以及P_T7-cadO-RBS-mcherry。将酶切后-cadR-P_cad-和RBS-T7RNAPmut进行连接反应。反应体系为：1μL10*T4 DNA Ligase Buffer，1μL T4 DNA Ligase，4μL酶切后的-cadR-P_cad-片段和4μL酶切后的-RBS-T7RNAPmut-片段。反应条件为：22℃，10min。以酶切连接后的产物为模板PCR扩增得到-cadR-P_cad-RBS-T7RNAPmut-片段，使用FastDigest内切酶进行酶切，反应体系为：5 μL 10*FD buffer，5.0μL EcoRI、30μL加酶切位点的-cadR-P_cad-RBS-T7RNAPmut-片段和10μL 超纯水；同样将pCDFDuet-2质粒用FastDigest内切酶EcoRI进行酶切，pGN68质粒用FastDigest 内切酶BamHI和EcoRI进行酶切，PCR纯化试剂盒纯化回收。

将酶切后核苷酸和质粒进行连接反应。反应体系为：1μL 10*T4 DNA LigaseBuffer，1μL T4 DNA Ligase，6μL酶切后的核苷酸片段和2μL酶切后质粒。反应条件为：22℃，10min。酶切连接后转化感受态细胞P.putida KT2440，菌落PCR筛选阳性克隆提质粒，测序验证。

2.质粒转化到恶臭假单胞菌底盘菌株P.putida KT2440

重组表达载体转化到底盘菌株P.putida KT2440中的详细构建步骤如下：

1)将活化的P.putida KT2440 100μL，接种于10ml LB培养基中，30℃，220rpm，培养至OD₆₀₀为0.6时，转入10ml离心管中，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体；

2)用5ml预冷的灭过菌的0.1mol/L氯化钙洗涤菌体，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min离心5min，去上清，收集菌体，重复洗涤两次；

3)尽量将上清倒尽，加入50μL 0.1mol/L氯化钙，50μL 30％甘油重悬菌体，制成E.coli DH5α感受态细胞；

4)将实施例1中构建的质粒10μL，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。冰上防止半小时后，热击45s并迅速冰浴2min，加入1mL LB培养基，30℃复苏1h后涂布在含有卡那霉素抗性的平板上，过夜培养；

5)挑选菌落PCR验证的阳性转化子到5ml LB培养基中过夜培养，得到对镉离子全细胞生物传感器底盘细胞。

实施例2目标全细胞生物传感器的性能检测

1.目标全细胞生物传感器的生长曲线

1.1目标全细胞生物传感器底盘细胞的生长曲线

将含有传感器质粒的P.putida KT2440的单个菌落在含有抗生素的LB培养基中于30℃ 220rpm摇床过夜培养。然后用LB培养基稀释至OD₆₀₀为1，按1％的比例接种至没有抗性的 LB液体培养基的试管内；当菌液的吸光度OD₆₀₀为0.6-0.8时，向试管中加入终浓度为0、0.1、 1、10、100、200、300、400、500、600μM的Cd²⁺，于30℃220rpm摇床培养。未添加Cd²⁺前，每隔1个小时取一次样；添加Cd²⁺后，每隔2个小时取一次样，测定吸光度OD₆₀₀。其中，吸光度在600nm波长下进行测量。

数据处理：使用公式FIR＝AFU/BFU计算荧光相对值(FIR)，其中FIR样品检测荧光值(AFU) 定义为相对荧光值(RFU)除以样品吸光度；将对照检测荧光值(BFU)定义为P.putida KT2440 细胞(阴性对照)中检测到的相对荧光值(RFU)除以对照吸光度。将对照检测荧光值(BFU) 设定为1.0，其他样品归一化至对照检测荧光值(BFU)。

1.2实验结果

本发明中构建的镉离子全细胞生物传感器p2T7RNAPmut-68在加入不同浓度镉离子后，所测得生长变化曲线如图2所示。

当添加Cd²⁺浓度小于1μM时，当Cd²⁺浓度小于400μM时，传感器p2T7RNAPmut-68的生长状况与不添加Cd²⁺时基本一致，说明添加0-400μM的Cd²⁺对细胞生长几乎没有影响，传感器p2T7RNAPmut-68增加了细胞对Cd²⁺的耐受性。

2.目标全细胞生物传感器的时间-荧光响应

2.1目标全细胞生物传感器的时间-荧光响应

将含有传感器质粒的P.putida KT2440的单个菌落在含有抗生素的LB培养基中于30℃ 220rpm摇床过夜培养。然后用LB培养基稀释至OD₆₀₀为1，按1％的比例接种至没有抗性的LB液体培养基的试管内；当菌液的吸光度OD₆₀₀为0.6-0.8时，向试管中加入终浓度为0、0.01、 0.02、0.04、0.05、0.1、1、10μM的Cd²⁺，于30℃220rpm摇床培养，每隔2h取菌液200μL于96孔板中，用酶标仪测定样品的相对荧光值(RFU)与吸光度OD₆₀₀。

数据处理：使用公式FIR＝AFU/BFU计算荧光相对值(FIR)，其中FIR样品检测荧光值(AFU) 定义为相对荧光值(RFU)除以样品吸光度；将对照检测荧光值(BFU)定义为P.putida KT2440 细胞(阴性对照)中检测到的相对荧光值(RFU)除以对照吸光度。将对照检测荧光值(BFU) 设定为1.0，其他样品归一化至对照检测荧光值(BFU)。

2.2实验结果

本发明中构建的镉离子全细胞生物传感器p2T7RNAPmut-68在加入不同浓度镉离子后，所测得时间-荧光响应曲线如图3所示。

传感器p2T7RNAPmut-68的荧光响应随时间的增加而逐渐增大。在加Cd²⁺培养4h后，传感器p2T7RNAPmut-68的检测限由2h的1μM降至0.05μM；加Cd²⁺培养6h后，传感器p2T7RNAPmut-68的检测限降为0.01μM(低于WHO饮用水中的镉检测限值0.027μM)。

3.目标全细胞生物传感器的浓度-荧光响应

3.1目标全细胞生物传感器的浓度-荧光响应

将含有传感器质粒的P.putida KT2440的单个菌落在含有抗生素的LB培养基中于30℃ 220rpm摇床过夜培养。然后用LB培养基稀释至OD₆₀₀为1，按1％的比例接种至没有抗性的 LB液体培养基的试管内；当菌液的吸光度OD₆₀₀为0.6-0.8时，向试管中加入终浓度为0、0.01、 0.02、0.04、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100μM的Cd²⁺，于30℃220rpm摇床培养，8h 后取菌液200μL于96孔板中，用酶标仪测定样品的相对荧光值(RFU)与吸光度OD₆₀₀。吸光度在600nm波长下进行测量，红色荧光测量条件为：激发波长580nm，激发波长610nm。

数据处理：使用公式FIR＝AFU/BFU计算荧光相对值(FIR)，其中FIR样品检测荧光值(AFU) 定义为相对荧光值(RFU)除以样品吸光度；将对照检测荧光值(BFU)定义为P.putida KT2440 细胞(阴性对照)中检测到的相对荧光值(RFU)除以对照吸光度。将对照检测荧光值(BFU) 设定为1.0，其他样品归一化至对照检测荧光值(BFU)。

3.2实验结果

本发明中构建的镉离子全细胞生物传感器p2T7RNAPmut-68在加入不同浓度镉离子后，所测得浓度-荧光响应曲线如图4所示。

传感器p2T7RNAPmut-68在5μM的Cd²⁺存在下荧光响应最好，对镉离子浓度-荧光响应曲线进行线性拟合，p2T7RNAPmut-68的线性响应范围为0.01-0.5μM，灵敏度为388.74。

4.目标全细胞生物传感器的特异性

4.1目标全细胞生物传感器的特异性

将含有传感器质粒的P.putida KT2440的单个菌落在含有抗生素的LB培养基中于30℃ 220rpm摇床过夜培养。然后用LB培养基稀释至OD₆₀₀为1，按1％的比例接种至没有抗性的 LB液体培养基的试管内；当菌液的吸光度OD₆₀₀为0.6-0.8时，向试管中加入终浓度为0.01、 0.1、1、10μM的Cd²⁺、Pd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、As³⁺，于30℃220rpm摇床培养，8h后取菌液200 μL于96孔板中，用酶标仪测定样品的相对荧光值(RFU)与吸光度OD₆₀₀。吸光度在600nm 波长下进行测量，红色荧光测量条件为：激发波长580nm，激发波长610nm。

数据处理：使用公式FIR＝AFU/BFU计算荧光相对值(FIR)，其中FIR样品检测荧光值(AFU) 定义为相对荧光值(RFU)除以样品吸光度；将对照检测荧光值(BFU)定义为P.putida KT2440 细胞(阴性对照)中检测到的相对荧光值(RFU)除以对照吸光度。将对照检测荧光值(BFU) 设定为1.0，其他样品归一化至对照检测荧光值(BFU)。

4.2实验结果

本发明中构建的镉离子全细胞生物传感器p2T7RNAPmut-68在加入不同浓度镉离子后，其特异性分析如图5所示。

Cd²⁺浓度为0.01μM、0.1μM、1μM和10μM时，传感器p2T7RNAPmut-68的荧光响应明显高于其他重金属离子产生的荧光响应。p2T7RNAPmut-68在Cd²⁺浓度为0.1μM时的荧光响应是10μM Pd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、As³⁺时的7.6-17.8倍，则p2T7RNAPmut-68的特异性为7.6，。

其中，Zn²⁺浓度为10μM时，传感器的荧光响应均高于其他Zn²⁺浓度的荧光响应。这是由于镉响应转录因子CadR蛋白的特殊结构造成的，CadR蛋白具有2种不同类型的功能位点：金属结合位点I(S1和S1′)与金属结合位点II(S2和S2′)。金属结合位点II(S2和S2′)位于分子的中间，由2个组氨酸残基(α5螺旋中的His87和His90)、1个谷氨酸残基(α4螺旋中的Glu62)和来自His尾区的可变配体形成，3个组氨酸残基和1个谷氨酸残基呈四面体结构排列，能与Cd²⁺和Zn²⁺结合。

本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种镉离子全细胞生物传感器电路放大的构建方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacgaaatct ccagcaagtg gcttgaccct atagtggcta cagggtgttc acttggcaac 60

aggctcaatt taaggatgac ccc 83

<210> 2

<211> 444

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagatcg gagaactggc caaagccacc gactgcgcgg tggaaaccat ccgctactac 60

gagcgtgaaa acctgctgcc agagccggcg cgcagcgagg gcaactaccg gttgtacacc 120

caggcccatg tggagcggct gaccttcatc cgcaactgcc gcacgctgga catgaccctg 180

gacgaaattc gcagcctgct acgcctgcgc gacagccccg acgacgcgtg cggcagcgtc 240

aatgcgctga tcgacgagca tatcgagcat gttcaggcgc ggatcgatgg cttggtggca 300

ttgcaggagc agctggtgga gctgcggcgg cgctgcaacg cgcaggggag tgaatgcgcg 360

atcttgcagc aactggagac aaacggggcg gtatcggtac cggataccga acattcccat 420

gtggggcgga gtcacgggca ttga 444

<210> 3

<211> 605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgaaggcga gggtcgtccg tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaaag 60

gcggtccgct gccgttcgcc tgggacatcc tgtcgccaca gttcatgtac ggcagcaagg 120

cctacgtgaa gcacccagcg gacatcccgg actacctgaa gctgagcttc ccggaaggct 180

tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggtggcgt ggtgaccgtg acccaggaca 240

gcagcctgca ggacggcgag ttcatctaca aggtgaagct gcgtggcacc aacttcccga 300

gcgacggtcc ggtgatgcag aaaaagacca tgggctggga agccagcagc gagcgcatgt 360

acccggaaga tggtgccctg aagggcgaga tcaagcagcg cctgaaactg aaggatggcg 420

gtcactacga cgccgaggtc aagaccacct acaaggccaa gaagccggtc cagctgccag 480

gtgcctacaa cgtgaacatc aagctggaca tcaccagcca caacgaggac tacaccatcg 540

tggaacagta cgagcgtgcc gaaggccgtc acagcaccgg tggcatggac gagctgtaca 600

agtga 605

<210> 4

<211> 2652

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60

ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggccctttag 120

catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180

gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240

atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaaatgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300

acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360

accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420

atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480

cacttcaaga aatacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcgcgt ctacaagaaa 540

gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600

tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660

attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720

tctgagacta tcgaacccgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780

ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840

attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900

agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960

aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagagag tcctagcggt cgccaacgta 1020

atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080

ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140

gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200

atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260

gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320

aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380

aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440

ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500

tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560

gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620

tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680

ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgtg 1740

attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800

aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860

ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920

tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980

tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040

atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100

tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggagg gattcttcgc 2160

aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactccg gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220

aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280

attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340

aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga cggtagtgtg ggcacacgag 2400

aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460

gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520

gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580

atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640

gcgttcgcgt aa 2652

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactatagg 19

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctatagtggc tacagggtgt tcacttggca acaggctcaa tttaaggatg 50

<210> 7

<211> 3062

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaattcatac gtatttaaat caggagtgga aatgagtaaa ggagaagaac ttttcactgg 60

agttgtccca attcttgttg aattagatgg tgatgttaat gggcacaaat tttctgtcag 120

tggagagggt gaaggtgatg caacatacgg aaaacttacc cttaaattta tttgcactac 180

tggaaaacta cctgttccat ggccaacact tgtcactact ttgacttatg gtgttcaatg 240

cttttcaaga tacccagatc atatgaaacg gcatgacttt ttcaagagtg ccatgcccga 300

aggttatgta caggaaagaa ctatattttt caaagatgac gggaactaca agacacgtgc 360

tgaagtcaag tttgaaggtg atacccttgt taatagaatc gagttaaaag gtattgattt 420

taaagaagat ggaaacattc ttggacacaa attggaatac aactataact cacacaatgt 480

atacatcatg gcagacaaac aaaagaatgg aatcaaagtt aacttcaaaa ttagacacaa 540

cattgaagat ggaagcgttc aactagcaga ccattatcaa caaaatactc caattggcga 600

tggccctgtc cttttaccag acaaccatta cctgtccaca caatctgccc tttcgaaaga 660

tcccaacgaa aagagagacc acatggtcct tcttgagttt gtaacagctg ctgggattac 720

acatggcatg gatgaactat acaaataata aggatccaac taaagattaa ctttataagg 780

aggaaaaaca tatgccttct ctagttgata attatcgaaa aataaatata gcaaataata 840

aatcaaacaa cgatttaacc aaaagagaaa aagaatgttt agcgtgggca tgcgaaggaa 900

aaagctcttg ggatatttca aaaatattag gctgcagtga gcgtactgtc actttccatt 960

taaccaatgt gcaaatgaaa ctcaatacaa caaaccgctg ccaaagtatt tctaaagcaa 1020

ttttaacagg agcaattgat tgcccatact ttaaaaatta ataagcggcc gcttaattaa 1080

ttaatctaga ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 1140

atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccgcc ctagacctag 1200

ggcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 1260

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 1320

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 1380

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 1440

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1500

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 1560

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1620

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1680

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1740

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 1800

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1860

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1920

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1980

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg actagtgctt ggattctcac caataaaaaa 2040

cgcccggcgg caaccgagcg ttctgaacaa atccagatgg agttctgagg tcattactgg 2100

atctatcaac aggagtccaa gcgagctcga tatcaaatta cgccccgccc tgccactcat 2160

cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca cagacggcat 2220

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