新型真菌岩藻糖苷酶及其在预防和/或治疗动物病原体感染中的用途
阅读说明：本技术 新型真菌岩藻糖苷酶及其在预防和/或治疗动物病原体感染中的用途 (Novel fungitype fucosidase and its purposes in prevention and/or treatment animal pathogen infection ) 是由 张正红 于 2018-02-27 设计创作，主要内容包括：公开了使用糖苷水解酶,例如α-L-岩藻糖苷酶,来预防和/或治疗动物中的病原体感染和/或腹泻的方法和组合物,其中所述病原体感染由能够结合动物肠细胞的病原体引起,其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在,所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构,所述方法包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除所述至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分的糖苷水解酶。(It discloses and uses glycoside hydrolase, such as alpha-L-fucosidase, to prevent and/or treat the method and composition of the pathogenic infection and/or diarrhea in animal, wherein the pathogenic infection is by that can combine the pathogen of animal enterocyte to cause, wherein the combination of the pathogen depends on the presence of pathogen binding site, the pathogen binding site has by least one α -1, at least one glycan structures that 2-L- fucose moiety replaces, the method includes at least one described α -1 can be removed from the pathogen binding site to animal application is a effective amount of, the glycoside hydrolase of 2-L- fucose moiety.)
相关申请的交叉引用
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技术领域
该领域涉及糖苷水解酶，特别是新型α-L-岩藻糖苷酶，以及它们在动物饲料中的用途以及在预防和/或治疗动物肠道病原体感染和/或腹泻中的用途。
背景技术
抗生素在治疗人类和动物方面的使用导致了抗微生物抗性，现在已成为全球主要的健康威胁。因此，正在寻求开发抗生素替代品以解决该全球健康问题。
消费者非常关心抗生素在动物饲料中的广泛使用。零售商和农民将需要响应于消费者对无抗生素肉类的偏好的这种变化而进行改变。
产肠毒素大肠杆菌(E.coli)(ETEC)是幼畜(例如猪和小牛)中最常见类型的大肠杆菌病，通常表现为严重的水泻。这也是旅行者中腹泻(“旅行者腹泻”)和发展中国家儿童腹泻的重要原因。
已知几乎所有的ETEC细菌都通过蛋白质表面附属物(菌毛(fimbriae和pili))或通过非菌毛蛋白粘附于小肠上皮上的受体。此外，它们分泌蛋白毒素(肠毒素)以减少吸收并增加小肠上皮细胞的液体和电解质分泌。肠毒素局部作用于肠细胞。动物中ETEC感染和腹泻的流行病学、发病机理、诊断和预防的细节可见于以下文献中：Nagy和Fekete(1999)Vet Res.[兽医研究]30:259-84。
更具体地，已经发现ETEC和肠毒血症(ETEEC)大肠杆菌(F18+ E.Coli)表达F18菌毛，所述F18菌毛在小肠中定殖并且在非常年幼的动物(例如仔猪和小牛)中引起腹泻，并且其是第三世界中人类死亡的一个主要原因。通过防止这类病原体对动物肠细胞的菌毛粘附，可以建立对这类疾病的保护。因此，有必要找到新的替代方法来预防和治疗病原体感染，例如ETEC。
发明内容
在一个方面，公开了具有α-岩藻糖苷酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽选自由以下组成的组：
a)多肽，其具有与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少93％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
b)多肽，其具有与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
c)多肽，其具有与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
d)多肽，其具有与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少70％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
e)多肽，其具有与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
f)多肽，其具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少71％同一性的预测的成熟氨基酸序列；以及
g)多肽，其具有与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少97％同一性的预测的成熟氨基酸序列。
在第二个实施例中，存在具有α-岩藻糖苷酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽包含在预测的前体氨基酸序列中，所述前体氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；和SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；和SEQID NO:21。
在第三个实施例中，公开了重组构建体，所述重组构建体包含在生产宿主中起作用的调节序列，所述调节序列有效地连接到编码α岩藻糖苷酶的核苷酸序列，所述α岩藻糖苷酶选自由以下组成的组：
a)多肽，其具有与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少93％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
b)多肽，其具有与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
c)多肽，其具有与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
d)多肽，其具有与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少70％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
e)多肽，其具有与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
f)多肽，其具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少71％同一性的预测的成熟氨基酸序列；以及
g)多肽，其具有与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少97％同一性的预测的成熟氨基酸序列。
在第四个实施例中，公开了生产宿主，所述生产宿主选自由真菌、细菌和藻类组成的组。
在第五个实施例中，公开了用于生产具有α-岩藻糖苷酶活性的酶的方法，所述方法包括：
(a)用如权利要求3所述的重组构建体转化生产宿主；以及
(b)在产生具有α-岩藻糖苷酶活性的酶的条件下培养步骤(a)的生产宿主，并且任选地，可以从生产宿主回收α-岩藻糖苷酶。
在第六个实施例中，公开了通过本文所公开的任何方法获得的含有α-岩藻糖苷酶的培养物上清液。
在第七个实施例中，公开了用于表达具有α-岩藻糖苷酶活性的酶的重组微生物生产宿主，所述重组微生物生产宿主包含本文公开的重组构建体。此外，生产宿主可以选自由细菌、真菌和藻类组成的组。
在第八个实施例中，公开了动物饲料，所述动物饲料包含如权利要求1或2所述的任何α-岩藻糖苷酶多肽，其中所述α-岩藻糖苷酶以1-20g/吨饲料的量存在。
在第九个实施例中，本文所公开的动物饲料可以进一步包含至少其他酶或至少一种直接饲喂的微生物或者至少一种其他酶和直接饲喂的微生物这两者。
在第十个实施例中，公开了包含本文所公开的任何α-岩藻糖苷酶多肽的饲料(feed)、喂养料(feedstuff)、饲料添加剂组合物或预混物。
在第十一个实施例中，公开了包含至少一种直接饲喂的微生物或至少其他酶或者至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物这两者的如本文所公开的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物。
在第十二个实施例中，公开了如本文所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物进一步包含选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
在第十三个实施例中，描述了用于在动物饲料中使用的、包含本文所公开的α-岩藻糖苷酶多肽的颗粒状饲料添加剂组合物，其中所述颗粒状饲料添加剂组合物包含通过选自由以下组成的组的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。所述颗粒的平均直径大于50微米并且小于2000微米。此外，本文所述的饲料添加剂组合物可以是液体形式，更进一步该液体形式也可适合于在饲料丸粒上喷雾干燥。
在第十四个实施例中，公开了预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的方法，其中所述病原体感染和/或腹泻由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述方法包括向所述动物施用有效量的如权利要求1所述的α-岩藻糖苷酶，其中所述α-岩藻糖苷酶能够从所述病原体结合位点去除所述至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分。此外，该α-L-岩藻糖苷酶能够单独地或者与能够(a)将血型A抗原转化为血型H抗原或(b)将血型B抗原转化为血型H抗原的酶组合，从含有聚糖的结构中去除末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。
在第十五个实施例中，所述病原体可以是表达F18菌毛的大肠杆菌。
在第十六个实施例中，公开了如本文所述的方法，所述方法进一步包括向动物施用有效量的α-L-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物的组合。
在第十七个实施例中，将单独的α-岩藻糖苷酶或将α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物的组合施用于动物饲料或预混物中。
在第十九个实施例中，单独的α-岩藻糖苷酶或α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物的组合可以是颗粒形式。
在第二十个实施例中，公开了用于预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的组合物，其中所述病原体感染由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述预防和/或治疗包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分的如权利要求1所述的α-岩藻糖苷酶。
在第二十一个实施例中，公开了如本文所述的组合物，其中所述α-L-岩藻糖苷酶能够单独地或者与能够(a)将血型A抗原转化为血型H抗原或(b)将血型B抗原转化为血型H抗原的酶组合，从含有聚糖的结构中除去末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。
此外，所述病原体可以是表达F18菌毛的大肠杆菌。
在第二十二个实施例中，公开了组合物，所述组合物进一步包含(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物这两者。
在第二十三个实施例中，可以将单独的α-岩藻糖苷酶或将α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物这两者的组合包入胶囊内。
在第二十四个实施例中，单独的α-岩藻糖苷酶或α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物这两者的组合，无论是包入胶囊内还是未包入胶囊内的，都可以作为饲料或预混物施用于动物。
在第二十五个实施例中，单独的α-岩藻糖苷酶或α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物这两者的组合，无论是包入胶囊内还是未包入胶囊内的，都可以作为饲料或预混物以颗粒的形式施用于动物。
附图说明
图1描绘了用于表达真菌岩藻糖苷酶的示例性质粒图谱。
图2描绘了使用2'-岩藻糖基乳糖底物在pH 5和8下测量的岩藻糖苷酶活性。
图3描绘了在pH 3.5下与增加剂量的胃蛋白酶一起孵育后岩藻糖苷酶的残余活性。
图4描绘了在pH 5.0下与增加剂量的胃蛋白酶一起孵育后岩藻糖苷酶的残余活性。
图5描绘了与两种浓度(2ppm和20ppm)的6种不同岩藻糖苷酶一起孵育后从猪胃黏蛋白(II型)释放岩藻糖。
图6描绘了与两种浓度(0.25ppm和1ppm)的6种不同岩藻糖苷酶孵育后从H抗原三糖(I型)释放岩藻糖。
图7示出了真菌岩藻糖苷酶完全预测的成熟蛋白质序列的多序列比对。
以下序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules[含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则]”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和欧洲专利公约(EPC)以及专利合作条约(PCT)法规第5.2和49.5(a-bis)条，以及行政章程第208款和附件C关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中所述的条例。
SEQ ID NO:1设定了来自样品ID CRC04259的编码真菌岩藻糖苷酶的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2设定了来自样品ID CRC06086的真菌岩藻糖苷酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3设定了来自样品ID CRC06678的编码真菌岩藻糖苷酶的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4设定了来自样品ID CRC06719的编码真菌岩藻糖苷酶的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5设定了来自样品ID CRC06800的编码真菌岩藻糖苷酶的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6设定了来自样品ID CRC06807的编码真菌岩藻糖苷酶的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7设定了来自样品ID CRC06852的编码真菌岩藻糖苷酶的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8-28在表1中列出。
具体实施方式
引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用以其全文并入本文。
在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，以下定义适用。
在元素或组分前的冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”关于所述元素或组分的实例(即，出现)的数目旨在是非限制性的。因此，“一个/种(a/an)”和“所述(the)”应理解为包括一个/种或至少一个/种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非所述数字明显意指单数。
术语“包含”意指如权利要求书中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施例。
在存在的情况下，所有范围是包含端值的和可组合的。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。
如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。
在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
术语“糖苷水解酶”可与“糖苷酶”和“糖基水解酶”互换使用。糖苷水解酶有助于复合糖(多糖)中糖苷键的水解。与糖基转移酶一起，糖苷酶形成用于糖苷键合成和破坏的主要催化机制。糖苷水解酶被分类为EC 3.2.1，作为催化O-或S-糖苷水解的酶。糖苷水解酶也可根据水解反应的立体化学结果进行分类，因此它们可被分类为构型保持酶(retainingenzyme)或构型翻转酶(inverting enzyme)。糖苷水解酶也可分为外切或内切作用，取决于它们分别作用于(通常非还原)寡糖/多糖链的末端还是中间。糖苷水解酶也可以通过基于序列或结构的方法进行分类。它们通常以它们所作用的底物命名。
术语“糖基转移酶”是指催化单糖之间糖苷键形成的酶。
术语“α-L-岩藻糖苷酶”、“α-L-岩藻糖苷岩藻糖水解酶”和“α-岩藻糖苷酶”在本文中可互换使用，并且是指EC类别号3.2.1.51中的酶，其将L-岩藻糖从α-L-岩藻糖苷中去除。α-L-岩藻糖苷酶是在各种生物体和哺乳动物中发现的外切糖苷酶。α-L-岩藻糖苷酶已被分为两个不同的糖苷水解酶家族：使用保持机制催化水解的α-L-岩藻糖苷酶属于熟知的糖苷水解酶家族29(GH29)。使用翻转机制催化水解的α-L-岩藻糖苷酶属于糖苷水解酶家族95(GH95)。
术语“α-1,2-L-岩藻糖苷酶”、“杏仁杏仁酪岩藻糖苷酶II”、“α-2-L-岩藻糖吡喃糖基-β-D-半乳糖苷岩藻糖水解酶”和“α-(1->2)-L-岩藻糖苷酶”在本文中可互换使用，并且是指EC类别号3.2.1.63中的酶，其催化通过1,2-α键连接到D-半乳糖残基的非还原性末端L-岩藻糖残基的水解。术语“α-1,3-L-岩藻糖苷酶”、“杏仁杏仁酪岩藻糖苷酶I”和“α-3-L-岩藻糖-N-乙酰葡糖胺基-糖蛋白岩藻糖水解酶”在本文中可互换使用，并且是指EC类别号3.2.1.111中的酶，其水解α-L-岩藻糖和N-乙酰葡糖胺残基之间的(1->3)-键。
术语“α-1,6-L-岩藻糖苷酶”、“α-L-岩藻糖苷酶”和“1,6-L-岩藻糖-N-乙酰-D-葡糖胺基糖肽岩藻糖水解酶”在本文中可互换使用，是指EC类别号3.2.1.127中的酶，其水解α-L-岩藻糖和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的(1->6)-键。
术语“去岩藻糖基化(defucosylate)”和“去岩藻糖基化(defucosylating)”可互换使用，并且是指能够从含有聚糖的结构中去除岩藻糖基基团的酶。
术语“聚糖”和“多糖”在本文中可互换使用。聚糖是指多糖或寡糖，或糖缀合物的碳水化合物部分，例如糖蛋白、糖脂或蛋白多糖，即使所述碳水化合物仅为寡糖。聚糖可以是单糖残基的同聚物或杂聚物。它们可能是线性或支链分子。可以发现，如在糖蛋白和蛋白多糖中一样，聚糖附接到蛋白质。通常，它们可以在细胞的外表面找到。O-和N-连接的聚糖在真核生物中非常常见，但是也可以在原核生物中发现，尽管不太常见。
如本文所用的术语“含有聚糖的结构”是指聚糖能以任何方式附接于其上的任何结构，例如蛋白质、脂质等。
术语“含N-乙酰-半乳糖胺的部分”是N-乙酰-半乳糖胺所附接的结构。这类结构包括但不限于碳水化合物等。
如本文所用的术语“FUT l”是指α-1,2-岩藻糖基转移酶1。岩藻糖基转移酶是将L-岩藻糖从GDP-岩藻糖供体底物转移至受体底物的酶。所述受体底物可以是另一种糖，例如在N-连接的糖基化的情况下将岩藻糖转移至核心GlcNAc糖，或者在通过O-岩藻糖基转移酶的O-连接的糖基化的情况下将岩藻糖转移至蛋白质。该组中的一些蛋白质负责血型抗原(红血球膜外层的表面标记)的分子基础。
如本文所用的术语“动物”包括所有非反刍动物(包括人类)和反刍动物。在具体实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于猪(pigs和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡、下蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
如本文所用的术语“病原体”意指任何疾病的致病物。这样的致病物可以包括但不限于细菌、病毒、真菌致病物等。
如本文所用的，术语“病原体结合位点”意指酶可将其自身附接于化合物并与其反应的区域或区。在本公开中，优选的病原体结合位点是具有被至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构的结合位点。
术语“F18+大肠杆菌”意指任何能够表达F18菌毛的大肠杆菌。
如本文所用的“芽孢杆菌属(Bacillus)”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应认识到，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，所述属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)(现在是“多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体。在胁迫环境条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
“饲料”和“食品”分别意指任何天然或人造饮食、膳食等，或此类膳食的组分，其旨在或适合于分别被非人类动物和人类食用、摄取、消化。
如本文所用的，术语“食品”以广义使用-并且涵盖用于人类的食品和食品产品以及用于非人类动物的食品(即饲料)。
关于在饲养家畜时饲喂动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可互换使用。在优选的实施例中，所述食物或饲料供非反刍动物和反刍动物食用。
如本文所用的，术语“直接饲喂的微生物”(“DFM”)是活的(有活力的)天然存在的微生物的来源。DFM的类别包括芽孢杆菌属、乳酸菌和酵母菌。芽孢杆菌属是独特的、形成孢子的革兰氏阳性杆菌。这些孢子非常稳定，并且可以承受环境条件，例如热、湿气和一定范围的pH。这些孢子当被动物摄入后会萌发成有活性的营养细胞，并可用于粗粉和压成丸粒的饮食中。乳酸菌是革兰氏阳性球菌，可产生对病原体有拮抗作用的乳酸。由于乳酸菌似乎有点对热敏感，所以它们不能用于压成丸粒的饮食中。乳酸菌的种类包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)和链球菌(Streptococcus)。酵母不是细菌。这些微生物属于真菌类群。
如本文所用的，术语“蛋白酶”是指能够切割肽键的酶。术语“蛋白酶”、“肽酶”和“朊酶”可互换使用。蛋白酶可以在动物、植物、细菌、古细菌和病毒中找到。蛋白质水解可通过目前被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
术语“分离的”意指处于在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何物质，包括但不限于任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，其至少部分地从与其天然相关的天然存在的成分中的一种或多种或全部中去除；(3)任何经人手修饰的物质(相对于自然界中发现的物质)；或(4)相对于与其天然相关联的其他成分，通过增加物质的量进行修饰的任何物质。术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”、和“分离的核酸片段”将可互换使用并是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非-天然的或改变的核苷酸碱基。呈DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成的DNA的一个或多个区段构成。
术语“经纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。经纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于所述分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(Joint Commission on BiochemicalNomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。当描述修饰时，位置后面在括号中列出的氨基酸指示由任何列出的氨基酸在所述位置处的取代清单。例如，6(L,I)意指位置6可以被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，F/V指示特定位置，在所述位置处可以具有苯丙氨酸或缬氨酸。
突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。
术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或酶的功能形式。
术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到所述蛋白质的氨基或羧基末端的前序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到前序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。
“前序列”或“前肽序列”是指在信号肽序列与成熟酶序列(例如，岩藻糖苷酶)之间的、酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前序列或前肽序列的切割产生成熟的活性酶，其通常表达为前酶。
术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。通常，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。通常，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。目的基因可以在有或没有信号序列的情况下表达。
关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”指示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
如本文所用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文所用的，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。
术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，所述术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。因此，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基取代另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸取代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸取代精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等效的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变所述蛋白的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如确定所编码的产物的生物活性的保留情况。
术语“密码子优化的”，如它是指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区，是指核酸分子的基因或编码区中密码子的改变，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变DNA编码的多肽。
术语“基因”是指表达特定蛋白质的核酸分子，包括所述编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指自然界中发现的具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不是在自然界中一起被发现的调节和编码序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或者包含衍生自同一来源但以不同于天然发现的方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”是指位于生物体基因组的天然位置中的天然基因。“外来”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。外来基因可以包含***非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序引入基因组中的一种基因。
术语“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的核苷酸序列。“合适的调节序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸分子上的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，所述编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与所述编码序列有效地连接。编码序列可以在正义或反义方向上有效地连接到调节序列上。
术语“调节序列”或“控制序列”在本文中可互换使用，并且是指能够增加或减少生物体内特定基因表达的核苷酸序列区段。调节序列的实例包括但不限于启动子、信号序列、操纵子等。如上所述，调节序列能以正义或反义方向有效地连接到目的编码序列/基因。
“启动子”或“启动子序列”是指定义RNA聚合酶在何处开始基因转录的DNA序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5'末端。启动子可以全部衍生自天然或天然存在的序列，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可能指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境或生理条件的表达(“诱导型启动子”)。
所述“3'非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括编码能够影响mRNA加工或基因表达(例如转录终止)的调节信号的序列。
如本文所用的，术语“转化”是指将核酸分子转移或引入到宿主生物体中。所述核酸分子可以作为线性或环状形式的DNA引入。所述核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进生产宿主的基因组中。含有转化的核酸的生产宿主被称为“转化的”或“重组的”或“转基因的”生物体或“转化体”。
如本文所用的，术语“重组”是指例如通过化学合成或者通过经基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分离的核酸序列区段进行人工组合。例如，其中一个或多个区段或基因已经被***的DNA，其自然地或通过实验室操作，从不同的分子、同一分子的另一部分或人工序列***，导致在基因中引入新的序列并随后在生物体中引入。术语“重组”、“转基因”、“转化”、“工程化”或“外源基因表达修饰”在本文中可互换使用。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“重组表达构建体”和“表达盒”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸片段，例如在自然界中未全部一起发现的调节序列和编码序列的人工组合。例如，构建体可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。这样一个构建体可以单独使用或可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解必须存在于载体上以便成功转化、选择和繁殖宿主细胞的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可以导致不同水平和模式的表达(Jones等人,(1985)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]4:2411-2418；De Almeida等人,(1989)Mol Gen Genetics[分子和普通遗传学]218:78-86)，并且因此通常筛选多个事件，从而获得显示所需表达水平和模式的品系。此类筛选可以是完成的标准分子生物学测定、生物化学测定以及其他测定，这些测定包括DNA的印迹分析、mRNA表达的Northern分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白表达的免疫印迹分析、酶测定或活性测定、和/或表型分析。
术语“生产宿主”、“宿主”和“宿主细胞”在本文中可互换使用，并且指任何生物体或其细胞，无论是人类还是非人类，其中重组构建体可以稳定或瞬时引入以表达基因。所述术语涵盖了亲本细胞的任何后代，由于在繁殖期间发生的突变，其与亲本细胞不同。
术语“百分比同一性”是如通过比较这些序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配核苷酸或氨基酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约州(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑),Academic Press[学术出版社],纽约州(1993)；Computer Analysis ofSequence Data[序列数据的计算机分析],第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡玛纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology[分子生物学的序列分析](von Heinje,G.编辑),Academic Press[学术出版社](1987)；Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州(1991)。确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。
如本文所用的，“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990；以及Karlin和Altschul,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊],90:5873-5787,1993)。BLAST程序使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人,NucleicAcids Res[核酸研究],25:3389-3402,1997；以及Schaffer等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。
如本文所用的，“同源蛋白质”或“同源酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,LipmanDJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database searchprograms.[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]Nucleic Acids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发育树。
可以使用LASERGENE生物信息计算包的Megalign程序(DNASTAR公司，麦迪逊，威斯康星州)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax公司，贝塞斯达，马里兰州)或EMBOSS开放软件包(EMBL-EBI；Rice等人,Trends in Genetics[遗传学趋势]16,(6):276-277(2000))进行序列比对和百分比同一性计算。可以使用具有默认参数的CLUSTAL比对方法(例如CLUSTALW；例如比对版本1.83(Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)；Higgins等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680(1994)；和Chenna等人,NucleicAcids Res[核酸研究]31(13):3497-500(2003))，其可通过欧洲生物信息学研究所从欧洲分子生物学实验室获得)来执行序列的多重比对。用于CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(例如，Gonnet250)、蛋白结束空位(ENDGAP)＝-1、蛋白空位距离(GAPDIST)＝4和KTUPLE＝1。在一个实施例中，在慢比对情况下，使用快或慢比对以及默认设置。可替代地，可以修改使用CLUSTALW方法(例如版本1.83)的参数以同样使用KTUPLE＝1、空位罚分＝10、空位延伸＝1、矩阵＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、窗口(WINDOW)＝5和顶部存储的对角线(TOP DIAGONALS SAVED)＝5。
作为某些方面的特征，本文公开了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。在某些实施例中可以使用与本文公开的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。可替代地，某些实施例中的变体多肽序列或多核苷酸序列可以与本文公开的序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与所公开的序列相同的功能，或具有所公开的序列的功能的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。
关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然存在的或人造的氨基酸取代、***或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参比多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参比多肽或多核苷酸的身份将从上下文中显而易见。
术语“质粒”、“载体”和“盒”意指染色体外元件，其通常携带非细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常呈双链DNA的形式。这样的元件可以是衍生自任何来源的、单链或双链DNA或RNA的、处于直链或环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体、或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经被连接或重组成能够将目的多核苷酸引入细胞中的独特构造。“转化盒”是指包含基因并具有促进特定宿主细胞转化的基因之外的元件的特定载体。术语“表达盒”和“表达载体”在本文中可互换使用，并且是指含有基因并具有允许在宿主中表达所述基因的基因之外的元件的特定载体。
如本文所用的，术语“表达”是指处于前体或成熟形式的功能性终产物(例如，mRNA或蛋白质)的生产。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
基因的表达涉及所述基因的转录并将mRNA翻译成前体或成熟蛋白。“反义抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的生产。“共抑制”是指能够抑制相同的或基本上相似的外来或内源基因的表达的正义RNA转录物的生产(美国专利号5,231,020)。“成熟”蛋白指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽或原肽可以是但不限于细胞内定位信号。“稳定转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组中，包括细胞核的和细胞器的基因组，导致遗传稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的细胞核中或含有DNA的细胞器中，导致基因表达而无整合或稳定的遗传。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”生物体。
所述表达载体可以是用于转化本领域已知的合适的生产宿主的任何数量的载体或盒中的一种。通常，所述载体或盒将包括指导相关基因的转录和翻译的序列、可选择标记、和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体通常包括含有转录起始对照的基因的5'区和控制转录终止的DNA片段的3'区。两个对照区都可以衍生自与转化的生产宿主细胞的基因同源的基因和/或对所述生产宿主来说是天然的基因，尽管这样的控制区不需要如此衍生。
如本文所用的，“同源蛋白质”或“同源酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,LipmanDJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database searchprograms.[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]Nucleic Acids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发育树。可以在例如Vector NTI Advance套件等程序中输入氨基酸序列，并且可以使用邻接(Neighbor Joining(NJ))法创建引导树(Saitou和Nei,Mol BiolEvol[分子生物学与进化],4:406-425,1987)。可以使用针对序列距离的Kimura校正并且忽略具有空位的位置来计算树结构。程序例如AlignX可以在系统发生树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值。
了解分子之间的同源性可以揭示分子的进化历史以及它们的功能信息；如果新测序的蛋白质与已经表征的蛋白质同源，则存在新蛋白质的生物化学功能的强烈指示。两个实体之间最基本的关系是同源性；如果两个分子衍生自共同的祖先，则它们被称为是同源的。同源分子或同源物可以分为两类：旁系同源物和直系同源物。旁系同源物是存在于一个物种内的同源物。旁系同源物在它们的详细生物化学功能上往往不同。直系同源物是存在于不同物种内并且具有非常相似或完全相同功能的同源物。蛋白质超家族是可以推断出共同祖先的蛋白质的最大分组(进化枝)。通常这个共同祖先是基于序列比对和机械相似性。通常，超家族含有若干个在该家族内显示序列相似性的蛋白质家族。基于MEROPS蛋白酶分类系统，术语“蛋白质宗族”通常用于蛋白酶超家族。
CLUSTAL W算法是序列比对算法的另一个实例(参见Thompson等人,NucleicAcids Res[核酸研究]22:4673-4680,1994)。CLUSTAL W算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质权重矩阵＝BLOSUM系列；DNA权重矩阵＝IUB；延迟发散序列％＝40；空位分隔距离＝8；DNA转换权重＝0.50；列表亲水残基＝GPSNDQEKR；使用负性矩阵＝关；切换特殊残基罚分＝开；切换亲水罚分＝开；以及切换结束空位分隔罚分＝关。在CLUSTAL算法中，包括在任一末端发生的缺失。例如，在500个氨基酸的多肽的任一末端(或多肽内)具有五个氨基酸缺失的变体相对于“参比”多肽具有99％(495/500个同一的残基×100)的百分比序列同一性。此类变体将被与所述多肽具有“至少99％的序列同一性”的变体所涵盖。
如本文所用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，所述术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定系统。例如，在α-L-岩藻糖苷酶的情况下，功能测定可涉及确定α-L-岩藻糖苷酶水解α-L-岩藻糖苷底物的有效性。
在一个实施例中，公开了新型真菌α-岩藻糖苷酶。具体地，具有α-岩藻糖苷酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽选自由以下组成的组：
a)多肽，其具有与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少93％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
b)多肽，其具有与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
c)多肽，其具有与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
d)多肽，其具有与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少70％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
e)多肽，其具有与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
f)多肽，其具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少71％同一性的预测的成熟氨基酸序列；以及
g)多肽，其具有与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少97％同一性的预测的成熟氨基酸序列。
在第二个实施例中，公开了具有α-岩藻糖苷酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽包含在预测的前体氨基酸序列中，所述前体氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；和SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；和SEQ ID NO:21。
含有L-岩藻糖的糖缀合物对于无数的生理和病理活动(例如炎症、细菌和病毒感染等)是重要的。
岩藻糖基化聚糖在胃肠道内是常见的，它们在胃肠道中的细胞表面和黏蛋白上被发现。黏蛋白是以膜相关和分泌的形式发现的高分子量、重糖基化蛋白质。
针对F18的肠道受体的存在与否是遗传控制的。已经证明，携带F18的大肠杆菌在水肿病中定植的易感性受显性等位基因控制和抗性受隐性等位基因的控制(Vogeli等人,(1996)Anim Genet.[动物遗传学]27(5):321-8)。
已显示控制大肠杆菌F18受体表达的基因链接到α1,2L-岩藻糖基转移酶1基因(FUT1)。FUT1基因编码半乳糖苷2-α-L-岩藻糖基转移酶，该酶修饰发生粘附的聚糖末端。
ETEC抗性动物显示出显著较低水平的FUT1酶(Francis DH(2002)J Swine HealthProd.[猪健康与生产杂志],10(4):171-5；Meijerink等人(1997)Mammalian Genome[哺乳动物基因组]8:736-41)。已显示岩藻糖基转移酶参与肠上皮细胞的岩藻糖基化，并且此外，在动物发育过程中岩藻糖基化水平不同(Torres-Pinedo和Mahmood(2004)BiochemBiophys Res Commun[生物化学和生物物理研究通讯]125:546-53；Ruggiero-Lopez等人(1991)Biochem J[生物化学杂志]279:801-6；Biol等人(1987)Pediatr Res[儿科研究]22:250-6)。
血型抗原是红细胞膜上的表面标记。它们通常被定义为通过向在红细胞和某些上皮细胞(包括覆盖胃肠道、泌尿道和呼吸道的那些)上检测到的脂质和蛋白质的碳水化合物侧链上连续添加糖类而形成的分子。
特定的寡糖抗原附接于红细胞表面上的蛋白质和脂质。所附接的最基本寡糖称为O抗原(也称为H抗原)。人类血型取决于糖基转移酶(催化单糖之间形成糖苷键的酶)的功能。特定的寡糖抗原附接于红细胞表面上的蛋白质和脂质。
该O(或H)抗原是在所有三种血型AB、A和B中发现的碱基寡糖。所述O抗原是(-脂质-葡萄糖-半乳糖-N-乙酰葡糖胺-半乳糖-岩藻糖)形式。血型O只有附接于红细胞上的O抗原。
已经发现α-1-2岩藻糖基转移酶对于形成血型抗原是必需的。所述O或H抗原是α-1,2-连接到半乳糖的岩藻糖。在血型A抗原中，将GalNAc添加到H抗原中的半乳糖中。H和A抗原存在于人类和猪中。
决定血型A特异性的免疫显性单糖是末端α-1,3-连接的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，而血型B特异性的相应单糖是α-1,3-连接的半乳糖(Gal)。O型细胞在它们的寡糖链末端缺少这两种单糖，而是用α-1,2-连接的岩藻糖(Fuc)残基封端并指定为H抗原。
应该注意的是，虽然以血液抗原最为熟知，但是这些抗原在身体的大部分组织和上皮细胞和内皮细胞上表达。
A和B三糖表位由常见的H双糖底物α-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶(GTA)和α-半乳糖基转移酶(GTB)形成。相反，用于将血型A和B抗原酶促转化为H的策略涉及特异性水解α-1,3-GalNAc(使用α-N-乙酰半乳糖苷酶，A-zyme)或α-1,3-半乳糖(使用α-半乳糖苷酶，B-zyme)以形成在O RBC上发现的常见H结构的外切糖苷酶。
如以下实例所证明的，似乎α-L-岩藻糖苷酶能够从H1抗原三糖中去除岩藻糖残基，但似乎难以从A抗原四糖中去除岩藻糖残基，这可能是由于空间位阻造成的。然而，当α-L-岩藻糖苷酶与能够去除含α-N-乙酰半乳糖胺的部分的酶组合时，那么α-L-岩藻糖苷酶可以从含A抗原葡聚糖的结构中去除岩藻糖。
使用α-半乳糖苷酶将血型B抗原转化为H抗原也是可能的。能够从含葡聚糖的结构中去除含α-N-乙酰半乳糖胺的部分的这类酶的实例包括但不限于N-乙酰半乳糖胺酶。
本公开还涉及预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的方法，其中所述病原体感染和/或腹泻由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述方法包括向所述动物施用有效量的、用于从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分的本文所公开的任何新型真菌α-岩藻糖苷酶。
也在本公开范围内的是用于预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的组合物，其中所述病原体感染和/或腹泻由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述预防或治疗包括向所述动物施用有效量的、能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分的本文所公开的任何新型真菌α-岩藻糖苷酶。
在本文所公开的所有方面(所述方法、组合物、或其用途)，α-L-岩藻糖苷酶能够单独地或者与能够从含有聚糖的结构中去除含N-乙酰半乳糖胺部分的酶组合，从含有聚糖的结构中去除末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。这在下面的实例中进一步讨论。
不受理论束缚，据信末端α1,2连接的岩藻糖的水解防止了与肠细胞的粘附，例如，如在由ETEC表达的F18菌毛的情况下。
可能希望的是工程化α-L-岩藻糖苷酶，使得其在低pH下稳定并且对胃蛋白酶也是稳定的。此外，也可能希望工程化α-L-岩藻糖苷酶以具有更广的底物特异性，例如能够接受A(并且甚至B)血型抗原作为底物。换言之，扩大底物特异性，使得工程化的α-L-岩藻糖苷酶能够从A四糖中去除岩藻糖残基而不需要添加α-N-乙酰半乳糖胺酶。
在一些实施例中，本文所述的新型真菌α-岩藻糖苷酶多肽可用于预防和/或治疗病原体感染，并可掺入预防性和/或治疗性组合物中。
如本文所述，同源性可以通过氨基酸序列比对，例如使用如BLAST、ALIGN、或CLUSTAL等程序来确定。在一些实施例中，所述多肽是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的酶，其能够至少从所述病原体结合位点去除至少一个岩藻糖基部分。可能的是，该多肽可以去除所述病原体结合位点的更大部分，条件是也去除至少一个岩藻糖基部分。优选地，所述酶具有α-L-岩藻糖苷酶活性，或催化从多糖(例如α-L-岩藻糖苷)切割末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。
对于本领域技术人员显而易见的是，如本文所述的全长和/或成熟的α-L-岩藻糖苷酶可以使用本领域中任何熟知的技术来制备。
在另一方面，包含编码任何多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列的任何分离的、重组的、基本上纯的、合成方式衍生的、或非天然存在的核酸能够至少从所述病原体结合位点去除至少一个岩藻糖基部分。可能的是，该多肽可以去除所述病原体结合位点的更大部分，条件是也去除至少一个岩藻糖基部分。
本文具体公开了重组构建体，所述重组构建体包含在生产宿主中起作用的调节序列，所述调节序列有效地连接到编码丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列，所述丝氨酸蛋白酶选自由以下组成的组：
a)多肽，其具有与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少93％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
b)多肽，其具有与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
c)多肽，其具有与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
d)多肽，其具有与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少70％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
e)多肽，其具有与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
f)多肽，其具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少71％同一性的预测的成熟氨基酸序列；以及
g)多肽，其具有与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少97％同一性的预测的成熟氨基酸序列。
还公开了生产宿主，其可以选自由真菌、细菌和藻类组成的组。
此外，感兴趣的是产生具有α-岩藻糖苷酶活性的酶的方法，所述方法包括：
(a)用如权利要求3所述的重组构建体转化生产宿主；以及
(b)在产生具有α-岩藻糖苷酶活性的酶的条件下培养步骤(a)的生产宿主。
从生产宿主回收α-岩藻糖苷酶可以是任选的。
还可以提及通过本文所述的任何方法获得的含有α-岩藻糖苷酶的培养物上清液。
此外，用于表达具有α-岩藻糖苷酶活性的酶的重组微生物生产宿主可包含本文所讨论的重组构建体。
另外感兴趣的是包含编码葡萄糖水解酶(例如α-L-岩藻糖苷酶，其从α-1,2-L-岩藻糖苷中水解L-岩藻糖部分)的多核苷酸的载体。
对技术人员将显而易见的是，所述载体可以是任何合适的表达载体并且对载体的选择可因载体待***其中的细胞的类型而异。合适的载体包括pGAPT-PG、pRAX1、pGAMD、pGPT-pyrG1、pC194、pJH101、pE194和pHP13(参见Harwood和Cutting[编辑],第3章,Molecular Biological Methods for Bacillus[针对芽孢杆菌的分子生物学方法],JohnWiley&Sons[约翰威利父子公司][1990])。还参见，Perego,Integrational Vectors forGenetic Manipulations in Bacillus subtilis[在枯草芽孢杆菌中用于遗传操作的整合载体],在Sonenshein等人[编辑]Bacillus subtilis and Other Gram-PositiveBacteria:Biochemistry,Physiology and Molecular Genetics[枯草芽孢杆菌和其他***：生物化学、生理学和分子遗传学],American Society for Microbiology[美国微生物学会],华盛顿特区[1993],第615-624页；和p2JM103BBI。
所述表达载体可以是用于转化本领域已知的合适的生产宿主的任何数量的载体或盒中的一种。通常，所述载体或盒将包括指导相关基因的转录和翻译的序列、可选择标记、和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体通常包括含有转录起始对照的基因的5'区和控制转录终止的DNA片段的3'区。两个对照区都可以衍生自与转化的生产宿主细胞的基因同源的基因和/或对所述生产宿主来说是天然的基因，尽管这样的控制区不需要如此衍生。
控制转录终止的DNA片段也可以衍生自对优选的生产宿主细胞来说是天然的各种基因。在某些实施例中，包括终止控制区是任选的。在某些实施例中，所述表达载体包括衍生自优选的宿主细胞的终止控制区。
所述表达载体可以包括在所述生产宿主中，特别是在微生物生产宿主的细胞中。所述生产宿主细胞可以是在真菌或细菌家族中发现的微生物宿主，并且其在大范围的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、藻类和真菌(例如丝状真菌和酵母)中的任何一种可以合适地容纳所述表达载体。
在所述生产宿主细胞中包括所述表达载体可以用于表达目的蛋白质，使得其可以存在于细胞内、细胞外或细胞内和细胞外的组合中。与用于回收细胞内表达所产生的蛋白质的方法相比，细胞外表达使从发酵产物中回收所需蛋白质更容易。
重组表达载体可以是任何载体，例如质粒或病毒，其可以方便地进行重组DNA程序并导致核苷酸序列的表达。载体选择通常取决于载体与所述载体待引入的生产宿主的相容性。所述载体可以是线性或闭环质粒。所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。所述载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，所述载体可以是当被引入生产宿主时整合到基因组中并与已整合到其中的染色体一起复制的载体。此类载体的一些非限制性实例提供于Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains[真菌遗传学库存中心菌株目录](FGSC，<www.fgsc.net》)中，合适的表达和/或整合载体的另外实例提供于Sambrook等人,(1989)同上，Ausubel(1987)同上，van den Hondel等人(1991)在Bennett和Lasure(编辑)MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI[真菌中更多的基因操作],Academic Press[学术出版社],396-428和美国专利号5,874,276中。特别有用的载体包括pTREX、pFB6、pBR322、PUCI8、pUCI00和pENTR/D。用于细菌细胞的合适的质粒包括允许在大肠杆菌中复制的pBR322和pUC19，以及例如允许在芽孢杆菌中复制的pE194。
简言之，就在生产宿主细胞中的生产而言，可以参考Sambrook等人,(1989)同上，Ausubel(1987)同上，van den Hondel等人(1991)在Bennett和Lasure(编辑),MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI[真菌中更多的基因操作],Academic Press[学术出版社](1991)第70-76和396-428页；Nunberg等人,(1984)Mol.Cell BioI.[分子细胞生物学]4:2306-2315；Boel等人,(1984)30EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:1581-1585；Finkelstein在BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI[丝状真菌的生物技术],Finkelstein等人编辑,Butterworth-Heinemann[巴特沃斯海涅曼出版社],波士顿,马萨诸塞州(1992),第6章；Kinghorn等人(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI[丝状真菌的应用分子遗传学],Blackie Academic and Professional[布莱基学术与专业],Chapmanand Hall[C-H出版社],伦敦；Kelley等人,(1985)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]4:475-479；Penttila等人,(1987)Gene[基因]61:155-164；和美国专利号5,874,276。合适载体的列表可以在Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains[真菌遗传学库存中心菌株目录](FGSC，www at fgsc.net)中找到。合适的载体包括从例如英杰公司(Invitrogen)、生命技术公司(Life Technologies)和普洛麦格公司(Promega)获得的那些载体。适合用于真菌宿主细胞的特定载体包括例如pFB6、pBR322、pUC 18、pUC100、pDONTM201、pDONRTM221、pENTRTM、3Z和4Z等载体。
所述载体系统可以是单个载体或质粒，或者两个或更多个载体或质粒，它们一起含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。
所述载体还可以含有一个或多个可选择标记以允许容易选择转化的细胞。可选择标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性等。可选择标记的实例包括赋予抗微生物抗性的标记。营养标记也可用于本发明，包括本领域作为amdS、argB和pyr4已知的那些标记。可用于转化木霉的标记是本领域已知的(参见例如，Finkelstein,第6章,在Biotechnologyof Filamentous Fungi[丝状真菌的生物技术],Finkelstein等人编辑,Butterworth-Heinemann[巴特沃斯海涅曼出版社],波士顿,马萨诸塞州(1992)和Kinghorn等人,(1992)Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi[丝状真菌的应用分子遗传学],Blackie Academic and Professional[布莱基学术与专业],Chapman and Hall[C-H出版社],伦敦)。在一些实施例中，所述表达载体也包括复制子、编码允许选择携带重组质粒的细菌的抗生素抗性的基因、和在质粒的非必需区域中的允许***异源序列的独特限制性位点。所选择的特定抗生素抗性基因不是决定性的；本领域已知的许多抗性基因中的任一种都是合适的。优选地选择原核序列，使得它们不干扰DNA在里氏木霉中的复制或整合。
所述载体还可以含有允许所述载体稳定整合到产物宿主基因组中或者允许载体在独立于所述细胞基因组的生产宿主中的自主复制的一种或多种元件。为了整合到宿主细胞基因组中，所述载体可以依赖于编码天冬氨酸蛋白酶的核苷酸序列或所述载体的任何其他元件，用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合到所述基因组中。
对于自主复制，所述载体可以进一步包含使所述载体能够在生产宿主中自主复制的复制起点。
可将编码α-L-岩藻糖苷酶的核苷酸序列的多于一个拷贝***生产宿主中以增加α-L-岩藻糖苷酶的产生。核苷酸序列拷贝数的增加可以通过将至少一个另外的序列拷贝整合到生产宿主的基因组中或通过包括可扩增的可选择标记基因来获得，并且因此可以通过在适当的选择剂存在下培养生产宿主细胞来选择核苷酸序列的另外拷贝。
将包含编码α-L-岩藻糖苷酶的核苷酸序列的载体引入生产宿主中，使得所述载体维持为染色体整合体或维持为自我复制的染色体外载体。一般认为整合是一个优点，因为所述核苷酸序列更可能稳定地维持在生产宿主中。如上所讨论的，将载体整合到生产宿主染色体中可以通过同源或非同源重组发生。
示例性载体包括但不限于pGXT(与公开的PCT申请WO 2015/017256中所述的pTTTpyr2载体相同)。还可以提及标准的细菌表达载体，包括噬菌体λ和M13，以及质粒例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D，以及融合表达系统如MBP、GST和LacZ。也可以将表位标签(例如c-myc)添加到重组蛋白中以提供便利的分离方法。
合适的表达和/或整合载体的实例提供于Sambrook等人,(1989)同上；Bennett和Lasure(编辑)More Gene Manipulations in Fungi[真菌中更多的基因操作],(1991)Academic Press[学术出版社]第70-76页和第396-428页以及其中引用的文章；USP 5,874,276和Fungal Genetic Stock Center Catalogue of Strains[真菌遗传学库存中心菌株目录](FGSC，www.fgsc.net.)中。有用的载体可以从普洛麦格公司和英杰公司获得。一些特定的有用载体包括pBR322、pUC18、pUC100、pDONTM201、pENTRTM、3Z和4Z。然而，也可以使用发挥等效功能并且在本领域中已知或变得已知的其他形式的表达载体。因此，可以在表达本文所公开的DNA序列中使用多种宿主/表达载体组合。例如，有用的表达载体可以由染色体、非染色体和合成的DNA序列的区段组成，例如SV40的各种已知衍生物和已知的细菌质粒(例如来自大肠杆菌的质粒，包括col E1、pCR1、pBR322、pMb9、pUC 19及其衍生物)，更广泛的宿主范围质粒(例如RP4)，噬菌体DNA(例如噬菌体λ的多种衍生物，例如NM989)，以及其他DNA噬菌体(例如M13和丝状单链DNA噬菌体)，酵母质粒(例如2.mu质粒或其衍生物)。
生产宿主的选择可以是任何合适的微生物，例如细菌、真菌和藻类。通常，所述选择取决于编码α-L-岩藻糖苷酶的基因。
合适的生产宿主的实例包括但不限于细菌、真菌、植物细胞等。优选地，所述生产宿主可以选自大肠杆菌，链霉菌属(Streptomyces)，汉逊酵母属(Hansenula)，木霉属(具体是里氏木霉)，芽孢杆菌属，乳杆菌属(Lactobacillus)，曲霉属(具体是黑曲霉(A.niger))，植物细胞和/或芽孢杆菌属、木霉属或曲霉属的孢子。
在一些实施例中，重组α-L-岩藻糖苷酶可用于本文所公开的方法和组合物中。在优选的方面，提供了食品或饲料添加剂，其包含能够从α-L-岩藻糖苷酶水解L-岩藻糖的α-L-岩藻糖苷酶。
许多标准转化方法可以用于产生表达大量所需糖苷水解酶(例如α-L-岩藻糖苷酶)的细菌和丝状真菌(例如曲霉属或木霉属)细胞系。一些用于将DNA构建体引入木霉属的产纤维素酶菌株的公开的方法包括Lorito,Hayes,DiPietro和Harman,(1993)Curr.Genet.[现代遗传学]24:349-356；Goldman,VanMontagu和Herrera-Estrella,(1990)Curr.Genet.[现代遗传学]17:169-174；以及Penttila,Nevalainen,Ratto,Salminen和Knowles,(1987)Gene[基因]6:155-164，还参见USP 6.022,725；USP 6,268,328和Nevalainen等人,“TheMolecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression ofBoth Homologous and Heterologous Genes”[木霉属的分子生物学及其在同源和异源基因表达中的应用],在Molecular Industrial Mycology[分子工业真菌学]中,编辑Leong和Berka,Marcel Dekker Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约州(1992)第129-148页；对于曲霉属，包括Yelton,Hamer和Timberlake,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474；对于镰孢菌属，包括Bajar,Podila和Kolattukudy,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:8202-8212；对于链霉菌属，包括Hopwood等人,1985,Genetic Manipulation of Streptomyces:Laboratory Manual[链霉菌属的遗传操作：实验室手册],The John Innes Foundation[约翰·英尼斯基金会],诺威奇,英国和Fernandez-Abalos等人,Microbiol[微生物学]149:1623-1632(2003)；以及对于芽孢杆菌属，包括Brigidi,DeRossi,Bertarini,Riccardi和Matteuzzi,(1990)FEMSMicrobiol.Lett.[FEMS微生物学快报]55:135-138)。
然而，可以使用用于将外来核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知的程序。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其他外来遗传材料引入宿主细胞的任何其他熟知方法(参见例如，Sambrook等人,同上)。还使用的是美国专利号6,255,115中描述的农杆菌介导的转染方法。只需要使用能够成功地将至少一个基因引入能够表达所述基因的宿主细胞中的具体基因工程化程序。
取决于所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的“剪切”或“截短”。例如，这可以导致使如本文所述的糖苷水解酶(例如α-L-岩藻糖苷酶)从无活性或基本上无活性的状态变为活性状态，如前肽在进行进一步的翻译后加工后成为具有酶活性的成熟肽的情况一样。在另一个情况下，该剪切可导致获得如本文所述的成熟糖苷水解酶(例如α-L-岩藻糖苷酶多肽)并且进一步去除N或C-末端氨基酸以产生截短形式的保留酶活性的α-L-岩藻糖苷酶。
转录后或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将认识到蛋白质可能经历的转录后或翻译后修饰的类型可取决于表达蛋白质的宿主生物体。
用于曲霉属和木霉属的转化方法描述于例如Yelton等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474；Berka等人,(1991)在Applications of Enzyme Biotechnology[酶生物技术的应用],编辑Kelly和Baldwin,Plenum Press[普莱纽姆出版社](纽约州)；Cao等人,(2000)Sci.[科学]9:991-1001；Campbell等人,(1989)Curro Genet.[现代遗传学]16:53-56；Pentilla等人,(1987)Gene[基因]61:155-164；de Groot等人,(1998)Nat.Biotechnol.[自然生物技术]16:839-842；USP 6,022,725；USP 6,268,328和EP 238 023中。以下文献中描述了异源蛋白质在木霉属中的表达：USP 6,022,725；USP 6,268,328；Harkki等人(1991),Enzyme Microb.Technol.[酶微生物技术]13:227-233；Harkki等人,(1989),Bio Technol.[生物技术]7:596-603；EP244,234；EP 215,594；以及Nevalainen等人,“The Molecular Biology of Trichodermaand its Application to the Expression of Both Homologous and HeterologousGenes[木霉属的分子生物学及其在同源和异源基因表达中的应用]”,在MOLECULARINDUSTRIAL MYCOLOGY[分子工业真菌学]中,编辑Leong和Berka,Marcel Dekker Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约州(1992)第129-148页。关于镰孢菌菌株的转化还可以参考以下文献：W096100787和Bajar等人,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:8202-28212。
将表达载体引入细胞后，在有利于表达在启动子序列控制下的基因的条件下培养转染或转化的细胞。在一些情况下，所述启动子序列是cbh1启动子。大批量的转化细胞可以如Ilmen等人1997中所述进行培养(“Regulation of cellulase gene expression in thefilamentous fungus Trichoderma reesei.[丝状真菌里氏木霉中纤维素酶基因表达的调控]”Appl.Envir.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:1298-1306)。
取决于钙离子浓度，将DNA摄取到宿主木霉属物种菌株中。通常，在摄取溶液中使用约10mM-50mM CaCl2。另外的合适的化合物包括缓冲系统，例如TE缓冲液(10mM Tris，pH7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS(pH 6.0)和聚乙二醇。据信聚乙二醇使细胞膜融合，从而允许培养基的内容物被递送至木霉属物种菌株的细胞质中。该融合时常留下整合到宿主染色体中的多个拷贝的质粒DNA。
通常，使用已经进行了渗透性处理的原生质体或细胞转化木霉属的物种，通常以105至107/mL、特别是2x 106/mL的密度进行。可以将在合适溶液(例如，1.2M山梨糖醇和50mMCaCl2)中的体积为100μL的这些原生质体或细胞
与所需DNA混合。通常，向摄取溶液中添加高浓度的PEG。可以将从0.1至1体积的25％PEG 4000添加到原生质体悬浮液中；然而，向原生质体悬浮液中添加约0.25体积是有用的。也可以将添加剂例如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加到摄取溶液中以促进转化。类似的程序可用于其他真菌宿主细胞。参见，例如美国专利号6,022,725。
用于培养细胞的培养基可以是适合于使宿主细胞生长和获得α-岩藻糖苷酶多肽的表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述)来制备。
在一些实施例中，可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的所消耗的全发酵液的制备，从而导致目的酶的表达。因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和酶能够被表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)。术语“所消耗的全发酵液”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“所消耗的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。
宿主细胞可以在允许表达α-葡糖苷酶的合适条件下培养。这些酶的表达可以是组成型的，使得它们能被连续产生，或诱导型的，需要刺激来启动表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质，例如***或IPTG或槐糖来启动蛋白质生产。
多肽也可以在体外无细胞系统(例如TNTTM(普洛麦格公司)兔网织红细胞系统)中重组生产。表达宿主也可以在有氧条件下在对于宿主来说适当的培养基中培养。可以提供摇动或搅动和通气的组合，其中生产在对所述宿主来说适当的温度下(例如从约25℃至约75℃(例如30℃至45℃)，这取决于宿主的需要和所需α-葡糖苷酶的生产)发生。培养可以发生从约12至约100小时或更长时间(以及其间的任何小时值，例如从24至72小时)。通常，培养肉汤的pH为约4.0至约8.0，同样取决于宿主相对于目的酶(例如岩藻糖苷酶)的生产所需的培养条件。因为可以在常规营养培养基中培养生产宿主和转化细胞。用于转化的宿主细胞的培养基可以适当地修饰以激活启动子并选择转化的细胞。特定培养条件(例如温度、pH等)可以是用于所选择的宿主细胞的表达的那些条件，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。此外，优选的培养条件可以在以下科学文献中找到，例如Sambrook,(1982)同上；Kieser,T,MJ.Bibb,MJ.Buttner,KF Chater,和D.A.Hopwood(2000),PracticalStreptomyces Genetics[实用链霉菌属遗传学],John Innes Foundation[约翰·内斯基金会],诺维奇,英国；Harwood等人,(1990)Molecular Biological Methods for Bacillus[芽孢杆菌属的分子生物学方法],John Wiley[约翰威利公司]，和/或来自美国典型培养物保藏中心(ATCC；www.atcc.org)。
本领域熟知的任何发酵方法都可以合适用来使如上所述的转化的或衍生的真菌菌株发酵。
经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且所述组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，用一种或多种所需生物体接种培养基。换言之，整个发酵过程发生而自始至终没有向发酵系统添加任何组分。
可替代地，分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格。此外，通常在整个发酵过程中进行尝试来控制因素例如pH和氧气浓度。通常，分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止的时间。在分批培养中，细胞通过静态停滞期进展到高生长对数期，最后进入生长速率减少或停止的稳定期。不经处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，在对数期的细胞负责产物的大量生产。标准分批系统的合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进展，将底物以增量添加。当已知分解代谢物抑制将抑制细胞的代谢时和/或在发酵培养基中希望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并且因此基于可测量因素(例如pH、溶解的氧和废气(例如CO2)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵是本领域熟知的。
连续发酵是另一种已知的发酵方法。它是开放的系统，在所述系统中，将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的密度，其中将细胞主要维持在对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如，限制营养素(例如碳源或氮源)可以维持在固定的速率，并允许调节所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳定态的生长条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。
分离和浓缩技术是本领域已知的，并且常规方法可用于制备包含本发明的α-葡糖苷酶多肽的浓缩溶液或肉汤。
发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得含酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。
有时可能需要浓缩包含目的多肽的溶液或肉汤以优化回收。使用未浓缩的溶液或肉汤通常会增加孵育时间，以便收集富集或经纯化的酶沉淀。
可以使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液直至获得所需酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化方法的实例包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。
可以使用本领域已知的各种测试来测试如本文所述的α-L-岩藻糖苷酶的活性。例如，可以根据需要通过将所述酶与糖蛋白或寡糖和水组合来测试活性。活性可以通过分析反应产物来测量，所述反应产物可以通过例如薄层色谱法或分光光度法来分离和可视化。岩藻糖分光光度测定的实例是梅格泽姆公司(Megazyme)K-FUCOSE试剂盒(Cao等人,(2014)J Biol Chem[生物化学杂志]289(37):25624-38)。
本文所公开的方法进一步包括向动物施用有效量的单独的本文所公开的任何新型α-L-岩藻糖苷酶或所述任何新型α-L-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶例如蛋白酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶例如蛋白酶这两者的组合。
可以将单独的本文所公开的α-L-岩藻糖苷酶或将本文所公开的α-L-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶例如蛋白酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶例如蛋白酶这两者的组合包入胶囊内用于在动物饲料或预混物中使用。此外，单独的任何这些α-L-岩藻糖苷酶或任何这些α-L-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶例如蛋白酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶例如蛋白酶这两者的组合，无论是否包入胶囊内，可以是颗粒形式。
据信，如本文所述的新型α-L-岩藻糖苷酶可以与一种或多种另外的酶组合使用。在一些实施例中，所述一种或多种另外的酶选自由以下组成的组：涉及蛋白质降解的那些酶，包括羧肽酶(优选地羧肽酶A、羧肽酶Y)、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶(PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd)、弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶或胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶、酸性真菌蛋白酶和细菌蛋白酶(包括枯草杆菌蛋白酶及其变体)；以及涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的那些酶；涉及糖原代谢的蛋白质或酶；降解其他污染物的酶；乙酸酯酶、淀粉酶、***糖酶、***呋喃糖苷酶、外切和内切肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、甲酰胺酶、半乳糖苷酶(例如α或β-半乳糖苷酶)、外切葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶(例如α或β-葡糖苷酶)、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、酚氧化酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、肽酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖：(3/4-氧化还原酶，EC 1.1.3.5))、酸性磷酸酶和/或其他酶或其组合。这些包括例如调节组合物或饲料的黏度的酶。
此外，可以将单独的α-L-岩藻糖苷酶或将α-L-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶例如蛋白酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶例如蛋白酶这两者的组合包入胶囊内，以便承受胃中发现的酸性pH。
可以将单独的这类α-L-岩藻糖苷酶或将这类α-L-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶例如蛋白酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶例如蛋白酶这两者的组合，无论是否包入胶囊内，施用于动物饲料或预混物中。
此外，单独的α-L-岩藻糖苷酶或α-L-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶例如蛋白酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶例如蛋白酶这两者的组合(无论是否包入胶囊内)在动物饲料或预混物中的施用可以是颗粒或液体形式。优选的形式是颗粒。
也包括在本公开范围内的是用于预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的组合物，其中所述病原体感染由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-L-本文所公开的任何新型α-岩藻糖苷酶取代的至少一个聚糖结构，所述α-岩藻糖苷酶能够从所述病原体结合位点去除至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分。
如上所指出，α-L-岩藻糖苷酶应该能够单独地或者与能够从含有聚糖的结构中去除含N-乙酰半乳糖胺部分的酶组合，从含有聚糖的结构中去除末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。优选地，所述α-L-岩藻糖苷酶选自由糖苷水解酶家族95(GH95)组成的组。
如上所讨论的，该组合物可用于预防和/或治疗任何肠道病原体感染。一种目的病原体是表达F18菌毛的大肠杆菌。
从上述讨论可以清楚地看出，所述组合物可以进一步包含单独的至少一种直接饲喂的微生物或至少一种直接饲喂的微生物与至少一种蛋白酶的组合。
动物饲料可以包括植物材料，例如玉米、小麦、高粱、大豆、卡诺拉油菜、向日葵，或针对家禽、猪、反刍动物、水产养殖和宠物的这些植物材料或植物蛋白源中的任何的混合物。预期动物性能参数，例如生长、采食量和饲料效率，但同时改善的均匀性、降低的动物房内的氨浓度以及因此改善的动物的福利和健康状况，都将得到改善。更具体地，如本文所用的“动物性能”可以通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养物质的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留量和/或通过动物避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来确定。
术语“动物饲料”、“饲料”、“喂养料”和“秣料”可互换使用，并且包含选自下组的一种或多种饲料材料，所述组包含：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、具有可溶物的干酒糟(Distillers Dried Grains with Solubles)(DDGS)(具体是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、小麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；和/或e)矿物质和维生素。
当用作或用于制备饲料(例如功能性饲料)时，本发明的酶或饲料添加剂组合物可以与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。例如，可以提及选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、偏亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
在一个优选的实施例中，将本发明的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。如本文所用的，“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种或更多种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。优选地，饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。可将根据本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。
本文所述的任何喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、黑小麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、湿饼(特别是基于玉米的湿饼)、干酒糟(DDG)(特别是基于玉米的干酒糟(cDDG))、具有可溶物的干酒糟(DDGS)(特别是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、小麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
如本文所用的，术语“秣料”意指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。秣料涵盖已经切下的植物。此外，秣料包括青贮饲料、压缩的和压成丸粒的饲料、油和混合给养、以及发芽谷物和豆类。
秣料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、休马流甘兰(Chau moellier)、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、羊茅草、雀麦草、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。
术语“复合饲料”意指呈粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的特定需求配制这些共混物。
复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养素(例如矿物质和维生素)的补充剂。
用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、卡诺拉菜籽粉、油菜籽粉、羽扇豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。
合适地，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、小麦麸、或其任何组合。
在一个实施例中，饲料组分可为玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、小麦麸、或其组合。在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)或其组合。
本文所述的喂养料可含有按重量计至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。
例如，喂养料可以含有约5％至约40％的玉米DDGS。对于家禽，所述喂养料平均可含有约7％至15％的玉米DDGS。对于猪(swine或pig)，所述喂养料可含有平均5％至40％的玉米DDGS。它也可以含有玉米作为单一谷物，在这种情况下，所述喂养料可以包含约35％至约80％的玉米。
在包含混合谷物(例如包含如玉米和小麦)的喂养料中，所述喂养料可包含至少10％的玉米。
另外或可替代地，喂养料也可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、玉米蛋白饲料、湿饼、干酒糟(DDG)、具有可溶物的干酒糟(DDGS)、小麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质源也可视为高纤维：获得自例如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花等来源的蛋白质。在一个方面，如本文所述的喂养料包含选自由以下组成的组的至少一种高纤维材料和/或所述至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物：例如具有可溶物的干酒糟(DDGS)(具体是cDDGS)、湿饼、干酒糟(DDG)(具体是cDDG)、小麦麸和小麦。在一个实施例中，本发明的喂养料包含选自由以下组成的组的至少一种高纤维材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物：例如含可溶物干酒糟(DDGS)(具体是cDDGS)、小麦麸和小麦。
所述饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸或(牲畜用)饼；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
如本文所用的，术语“饲料”在一些实施例中涵盖宠物食物。宠物食物是旨在由宠物消费的植物或动物材料，例如狗食或猫食。宠物食物(例如狗食和猫食)可以干燥形式(例如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食可含有氨基酸牛磺酸。
动物饲料还可以包括鱼食。鱼食通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以呈小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(例如β胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。
在仍另一方面，动物饲料涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。通常，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛肉或羊肉脂肪)。
如本文所用的，术语“接触”是指间接或直接将α-L-岩藻糖苷酶(或包含α-L-岩藻糖苷酶的组合物)应用到产品(例如饲料)中。可以使用的应用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。在一个实施例中，优选地将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。这允许所述组合物赋予性能益处。
术语“热稳定”意指加热至指定温度之前添加剂中存在/有活性的酶的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至指定温度之前添加剂中存在且有活性的酶的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。
也可能的是，本文所述的α-L-岩藻糖苷酶(或包含α-L-岩藻糖苷酶的组合物)可以均化以产生粉末。
在一个替代性优选的实施例中，将α-L-岩藻糖苷酶(或包含α-L-岩藻糖苷酶的组合物)配制成如WO 2007/044968(称作TPT颗粒)或W01997/016076或W01992/012645中所述的颗粒，将这些文献通过引用并入本文中。“TPT”意指热保护技术。
在另一方面，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含包覆在蛋白质核心上的水合屏障盐。这样的盐涂层的优点在于使耐热性改善、使保藏稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响所述酶的饲料添加剂的影响。优选地，用于盐涂层的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。在一些实施例中，盐涂层包含Na2S04。
制备α-L-岩藻糖苷酶(或包含α-L-岩藻糖苷酶的组合物)的方法还可以包括将粉末制成粒料的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸料。
任选地，制粒步骤可包括在丸粒形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。将混合物在达到指定温度的调节器中加热，例如从60℃-100℃，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、或95℃。停留时间可以是从几秒钟到几分钟并且甚至几小时不等。例如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。应当理解，本文所述的α-L-岩藻糖苷酶(或包含α-L-岩藻糖苷酶的组合物)适于添加至任何适宜的饲料材料中。
技术人员应当理解，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养所述动物的目的。
任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(例如像，钙)和/或另外的维生素。在一些实施例中，喂养料为玉米大豆粉混合物。
喂养料通常在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过所述方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，所述步骤包括制粒之前的挤出或膨化，具体是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。
所述喂养料可为用于以下的喂养料：单胃动物，例如家禽(例如肉鸡、下蛋鸡、肉用种鸡、产仔鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)和猪类(所有年龄类别)；反刍动物，例如牛(例如奶牛或公牛(包括牛犊))、马、绵羊、宠物(例如狗、猫)或鱼(例如无胃鱼，有胃鱼，淡水鱼，例如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤鱼)，海鱼(例如黑鲈)；和甲壳类动物，例如虾、贻贝和扇贝)。优选地，所述喂养料用于猪。
所述饲料添加剂组合物和/或包含其的喂养料可以任何合适的形式使用。所述饲料添加剂组合物能以固体或液体配制剂或其替代物形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。
在一些应用中，可将所述饲料添加剂组合物与饲料混合或在饮用水中施用。
饲料添加剂组合物，包含将如本文所教导的岩藻糖苷酶与饲料可接受载体、稀释剂或赋形剂混合，并且(任选地)进行包装。
可使喂养料和/或饲料添加剂组合物与至少一种矿物质和/或至少一种维生素混合。由此衍生的组合物可在本文中称为预混物。所述喂养料可包含按重量计至少0.0001％的饲料添加剂。合适地，所述喂养料可以包含按重量计至少0.0005％、至少0.0010％、至少0.0020％、至少0.0025％、至少0.0050％、至少0.0100％、至少0.020％、至少0.100％、至少0.200％、至少0.250％、至少0.500％的饲料添加剂。
优选地，食物或饲料添加剂组合物可以进一步包含至少一种生理学上可接受的载体。所述生理学上可接受的载体优选选自以下中的至少一者：麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2S04、滑石、PVA、及其混合物。在一个另外的实施例中，所述食物或饲料添加可还包含金属离子螯合剂。金属离子螯合剂可选自EDTA或柠檬酸。
在一些实施例中，所述食物或饲料添加剂组合物包含水平为至少0.0001g/kg、0.001g/kg、至少0.01g/kg、至少0.1g/kg、至少1g/kg、至少5g/kg、至少7.5g/kg、至少10.0g/kg、至少15.0g/kg、至少20.0g/kg、至少25.0g/kg的α-L-岩藻糖苷酶。在一些实施例中，所述食物或饲料添加剂包含一定水平的α-L-岩藻糖苷酶，使得当添加至食物或饲料材料时，所述饲料材料包含1-500mg/kg、1-100mg/kg、2-50mg/kg或2-10mg/kg范围的α-L-岩藻糖苷酶。在本发明的一些实施例中，所述食物或饲料材料包含至少100、1000、2000、3000、4000、5000、10000、20000、30000、50000、100000、500000、1000000或2000000单位的α-L-岩藻糖苷酶/千克饲料或食物材料。在一些实施例中，一个单位的α-1,2-岩藻糖苷酶活性可以被定义为在实例2中所述测定条件下每分钟可以从2'-岩藻糖基乳糖催化释放一微摩尔L-岩藻糖的酶的量。
范围可以包括但不限于上面讨论的较低和较高范围的任何组合。
包含本文所述的任何α-L-岩藻糖苷酶和组合物的制剂能以任何合适的方式制备以确保所述制剂包含活性酶。此类制剂可以是液体、干粉或颗粒。优选地，所述饲料添加剂组合物呈固体形式，适合于添加在饲料丸粒上或添加至饲料丸粒。
干粉或颗粒可以通过本领域技术人员已知的手段制备，例如高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷雾干燥。
本文所述的任何α-L-岩藻糖苷酶和组合物可以被包衣，例如包入胶囊内。在一个实施例中，所述涂层保护酶免受热影响并且可视为防热剂。在一个实施例中，所述涂层保护酶避免低pH。是可以使用的涂层材料的一个实例。
将本文所述的饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO 2007/044968(称为TPT颗粒)或WO 1997/016076或WO 1992/012645中所述(所述文献各自通过引用并入本文)。
在一个实施例中，可将动物饲料配制成包含以下的饲料组合物的颗粒：芯；活性剂；和至少一个涂层，在选自以下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保持至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制粒方法，b)蒸汽加热的饲料预处理方法，c)储存，d)作为未经制粒混合物中的成分储存，和e)作为包含选自以下的至少一种化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。
关于颗粒，至少一个涂层可包含占所述颗粒的至少55％w/w的水分水合材料；和/或至少一个涂层可包含两个涂层。所述两个涂层可为水分水合涂层和防潮涂层。在一些实施例中，所述水分水合涂层可为所述颗粒的25％w/w至60％w/w并且所述防潮涂层可为所述颗粒的2％w/w至15％w/w。所述水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且所述防潮涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
所述颗粒可使用饲料制粒方法制备并且所述饲料预处理方法可在70℃至95℃(例如在85℃至95℃)进行长达若干分钟。
可将饲料添加剂组合物配制成用于动物饲料的颗粒，所述颗粒包含：芯；活性剂，在储存之后以及在颗粒作为一种成分的蒸汽加热制粒方法之后，所述颗粒的活性剂保持至少80％活性；防潮涂层；和水分水合涂层，其至少为所述颗粒的25％w/w，所述颗粒在蒸汽加热制粒方法之前具有小于0.5的水活性。
所述颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮涂层并且所述水分水合材料可为无机盐。所述水分水合涂层可为所述颗粒的25％w/w至45％w/w并且所述防潮涂层可为所述颗粒的2％w/w至10％w/w。
颗粒可使用蒸汽加热制粒方法制备，所述方法可在85℃至95℃进行高至若干分钟。
可替代地，所述组合物处于适合于消耗的液体制剂中，优选地，这种液体消费品含有以下中的一种或多种：缓冲剂、盐、山梨糖醇和/或甘油。
此外，可通过将一种或多种酶施用(例如喷雾)于载体底物(例如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。
在一个实施例中，饲料添加剂组合物可以被配制成预混物。仅举个实例，所述预混物可包含一种或多种饲料组分，例如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
在一个实施例中，将至少一种DFM和/或糖苷水解酶，例如α-L-岩藻糖苷酶(无论是否包入胶囊内)和/或至少一种蛋白酶用至少一种生理学上可接受的载体配制，该载体选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。
在一些实施例中，α-L-岩藻糖苷酶将处于生理学上可接受的载体中。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。治疗性组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质(例如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质)可以存在于此类组合物中。此类载体使得药物组合物能够配制成用于被患者摄取的片剂、丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂和混悬剂。一旦配制，可以直接向受试者施用本发明的组合物。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施例中，这些组合物适合于向人类受试者施用。
本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：
1.一种具有α-岩藻糖苷酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽选自由以下组成的组：
a)多肽，其具有与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少93％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
b)多肽，其具有与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
c)多肽，其具有与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
d)多肽，其具有与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少70％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
e)多肽，其具有与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
f)多肽，其具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少71％同一性的预测的成熟氨基酸序列；以及
g)多肽，其具有与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少97％同一性的预测的成熟氨基酸序列。
2.一种具有α-岩藻糖苷酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽包含在预测的前体氨基酸序列中，所述前体氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；和SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；和SEQ ID NO:21。
3.一种重组构建体，所述重组构建体包含在生产宿主中起作用的调节序列，所述调节序列有效地连接到编码α-岩藻糖苷酶的核苷酸序列，所述α-岩藻糖苷酶选自由以下组成的组：
a)多肽，其具有与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少93％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
b)多肽，其具有与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
c)多肽，其具有与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
d)多肽，其具有与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少70％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
e)多肽，其具有与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％同一性的预测的成熟氨基酸序列；
f)多肽，其具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少71％同一性的预测的成熟氨基酸序列；以及
g)多肽，其具有与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少97％同一性的预测的成熟氨基酸序列。
4.如实施例3所述的生产宿主，其中所述宿主选自由以下组成的组：真菌、细菌和藻类。
5.一种用于产生具有α-岩藻糖苷酶活性的酶的方法，所述方法包括：
(a)用如实施例3所述的重组构建体转化生产宿主；以及
(b)在产生具有α-岩藻糖苷酶活性的酶的条件下培养步骤(a)的生产宿主。
6.如实施例5所述的方法，其中任选地从所述生产宿主回收所述α-岩藻糖苷酶。
7.一种含有α-岩藻糖苷酶的培养物上清液，所述培养物上清液通过如实施例5或6中任一项所述的方法获得。
8.一种用于表达具有α-岩藻糖苷酶活性的酶的重组微生物生产宿主，所述重组微生物生产宿主包含如实施例3所述的重组构建体。
9.一种动物饲料，所述动物饲料包含如实施例1或2所述的任何α-岩藻糖苷酶多肽，其中α-岩藻糖苷酶以1-20g/吨饲料的量存在。
10.如实施例9所述的动物饲料，所述动物饲料进一步包含：(a)至少一种直接饲喂的微生物，或(b)至少一种其他酶，或(c)至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物这两者。
11.一种饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，其包含如实施例1或2所述的任何α-岩藻糖苷酶多肽。
12.如实施例11所述的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，其进一步包含：(a)至少一种其他酶，或(b)至少一种直接饲喂的微生物，或(c)至少一种其他酶和至少一种直接饲喂的微生物。
13.如实施例11或12所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物进一步包含选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
14.一种用于在动物饲料中使用的颗粒状饲料添加剂组合物，所述颗粒状饲料添加剂组合物包含如实施例1或2所述的α-岩藻糖苷酶多肽，其中所述颗粒状饲料添加剂组合物包含通过选自由以下组成的组的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
15.如实施例14所述的颗粒状饲料添加剂组合物，其中所述颗粒的平均直径大于50微米并且小于2000微米。
16.如实施例15所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物呈液体形式。
17.如实施例16所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物呈适合于在饲料丸粒上喷雾干燥的液体形式。
18.一种预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的方法，其中所述病原体感染和/或腹泻由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述方法包括向所述动物施用有效量的如权利要求1所述的任何α-岩藻糖苷酶，其中所述α-岩藻糖苷酶能够从所述病原体结合位点去除所述至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分。
19.如实施例18所述的方法，其中所述α-岩藻糖苷酶能够单独地或与能够(a)将血型A抗原转化为血型H抗原或(b)将血型B抗原转化为血型H抗原的酶组合，从含有聚糖的结构中去除末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。
20.如实施例18或19所述的方法，其中所述病原体是表达F18菌毛的大肠杆菌。
21.如实施例18或19所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述动物施用有效量的单独的α-岩藻糖苷酶或α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶这两者的组合。
22.如实施例21所述的方法，其中将所述α-岩藻糖苷酶作为饲料或预混物施用于动物。
23.如实施例21或22所述的方法，其中将单独的所述α-岩藻糖苷酶或所述α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶这两者的组合以颗粒形式施用。
24.一种用于预防和/或治疗患有肠道病原体感染和/或腹泻的动物的组合物，其中所述病原体感染由能够结合动物肠细胞的病原体引起，其中所述病原体的结合依赖于病原体结合位点的存在，所述病原体结合位点具有被至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分取代的至少一个聚糖结构，所述预防和/或治疗包括向所述动物施用有效量的能够从所述病原体结合位点去除所述至少一个α-1,2-L-岩藻糖部分的如实施例1所述的α-岩藻糖苷酶。
25.如实施例24所述的组合物，其中所述α-岩藻糖苷酶能够单独地或与能够(a)将血型A抗原转化为血型H抗原或(b)将血型B抗原转化为血型H抗原的酶组合，从含有聚糖的结构中去除末端α-1,2-连接的岩藻糖基团。
26.如实施例25所述的组合物，其中所述病原体是表达F18菌毛的大肠杆菌。
27.如实施例25或26所述的组合物，其中所述组合物进一步包含：(a)至少一种直接饲喂的微生物，或(b)至少一种其他酶，或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶这两者。
28.如实施例27所述的组合物，其中将单独的所述α-岩藻糖苷酶或所述α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶这两者的组合包入胶囊内。
29.如实施例28所述的组合物，其中将单独的所述α-岩藻糖苷酶或所述α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶这两者的组合，无论是否包入胶囊内，作为饲料或预混物施用于动物。
30.如实施例29所述的组合物，其中将单独的所述α-岩藻糖苷酶或所述α-岩藻糖苷酶与(a)至少一种直接饲喂的微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂的微生物和至少一种其他酶这两者的组合，无论是否包入胶囊内，以颗粒形式施用。
实例
除非在本文中另有定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人,DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],第2版,John Wileyand Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994)，以及Hale和Marham,THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。
本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解，这些实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特性，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。
一般方法
标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的，并且描述于以下文献中：Sambrook,J.和Russell,D.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第三版,冷泉港实验室出版社[Cold Spring Harbor Laboratory Press],冷泉港,纽约州(2001)；和Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,Experiments with GeneFusions[基因融合实验],冷泉港实验室,冷泉港出版社,纽约州(1984)；以及Ausubel,F.M.等人,Short Protocols in Molecular Biology[简明分子生物学试验方案],第5版,Current Protocols[当前试验方案],John Wiley and Sons,Inc.[约翰威利父子公司],纽约州,2002。
实例1
真菌岩藻糖苷酶的鉴定、克隆和表达
GH95家族(CaZy分类)的酶包括α-L-岩藻糖苷酶(E.C.3.2.1.51)和α-1,2-L-岩藻糖苷酶(E.C.3.2.1.33)。属于GH95家族的蛋白质序列是从多种真菌基因组中采集的。表1提供了鉴定的新型GH95真菌酶的核苷酸和多肽序列的名称、源生物体和SEQ ID编号。
将编码CRC04259(SEQ ID NO:1)、CRC06086(SEQ ID NO:2)、CRC06678(SEQ ID NO:3)、CRC06719(SEQ ID NO:4)、CRC06800(SEQ ID NO:5)、CRC06807(SEQ ID NO:6)和CRC06852(SEQ ID NO:7)酶的基因从基因组DNA扩增。将扩增的基因***到在CBH1启动子(在公开的PCT申请WO 2011/063308中描述)控制下的pGXT载体(类似于公开的PCT申请WO2015/017256中描述的pTTTpyr2载体)中，并使用相应的天然信号肽进行每种酶的表达。
示例性表达质粒图谱(针对CRC04259)显示在图1中。编码序列或CDS(编码本研究中酶的外显子)提供如下：CRC04259(SEQ ID NO:8)、CRC06086(SEQ ID NO:9)、CRC06678(SEQ ID NO:10)、CRC06719(SEQ ID NO:11)、CRC06800(SEQ ID NO:12)、CRC06807(SEQ IDNO:13)和CRC06852(SEQ ID NO:14)。
使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]51:393-99)，将合适的里氏木霉菌株用表达质粒转化(方法描述于公开的PCT申请WO 05/001036中)。在含有乙酰胺(作为唯一氮源)的培养基上选择转化体。在乙酰胺板上生长5天后，收集转化体并在250mL摇瓶中在含有葡萄糖和槐糖混合物的确定成分培养基中发酵。通过过滤收集发酵液的上清液并进行SDS-PAGE用于表达。通过培养物上清液样品的SDS-PAGE目测确认真菌岩藻糖苷酶表达。
本研究中酶的全长多肽序列提供如下：CRC04259(SEQ ID NO:15)、CRC06086(SEQID NO:16)、CRC06678(SEQ ID NO:17)、CRC06719(SEQ ID NO:18)、CRC06800(SEQ ID NO:19)、CRC06807(SEQ ID NO:20)和CRC06852(SEQ ID NO:21)。通过去除SignalP 4.0预测的信号肽来预测成熟序列。本研究中酶的预测成熟多肽序列提供如下：CRC04259(SEQ ID NO:22)、CRC06086(SEQ ID NO:23)、CRC06678(SEQ ID NO:24)、CRC06719(SEQ ID NO:25)、CRC06800(SEQ ID NO:26)、CRC06807(SEQ ID NO:27)和CRC06852(SEQ ID NO:28)。
实例2
使用岩藻糖基乳糖底物对岩藻糖苷酶进行生物化学表征
1.针对粗培养物上清液中的α-1,2-岩藻糖苷酶活性的测定
为了测量α-1,2-岩藻糖苷酶活性，使用10mM 2'-岩藻糖基乳糖(卡博森斯公司(Carbosynth)，OF06739)作为底物，在37℃下测定岩藻糖苷酶CRC04259、CRC06086、CRC06678、CRC06719、CRC06800、CRC06807、CRC06852的粗培养物上清液。
通过将5μL含有每种酶的培养物上清液添加至在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)或50mM NaOH-HEPES缓冲液(pH 8.2)中制备的45μL底物溶液中来引发反应。在与空白对照相同的条件下测定不具有酶的培养物上清液样品。10分钟后，使用K-岩藻糖试剂盒(梅格泽姆公司(Megazyme)，爱尔兰)检测释放的L-岩藻糖。通过340nm处的吸光度测量所观察到的岩藻糖苷酶活性，并且将pH 5和pH 8下的结果(减去酶空白)报道在图2中。
2.对特异性α-1,2-岩藻糖苷酶活性的测量
用10mM 2'-岩藻糖基乳糖测量经纯化的岩藻糖苷酶CRC04259、CRC06086、CRC06678、CRC06719、CRC06800、CRC06807、CRC06852的比活性。在反应之前，从适当浓度开始制备具有6个连续2倍稀释度的酶样品。通过将5μL稀释的酶样品或水(空白对照)添加至在50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的45μL底物溶液中，然后在37℃下孵育10分钟来启动反应。使用K-岩藻糖试剂盒检测释放的L-岩藻糖。生成剂量响应曲线，其中吸光度变化为Y值，酶剂量为X值，并且将曲线的线性部分用于计算经纯化的酶样品的比活性。一个单位的α-1,2-岩藻糖苷酶活性被定义为在所述测定的条件下每分钟可以催化释放一微摩尔L-岩藻糖的酶的量。表2提供了CRC04259、CRC06086、CRC06678、CRC06719、CRC06800、CRC06807和CRC06852岩藻糖苷酶的特异性α-1,2-岩藻糖苷酶活性。
实例3
岩藻糖苷酶的pH和温度特征
测定CRC06678、CRC06800岩藻糖苷酶以确定它们的pH和温度特征。为了确定最佳pH，在pH范围为从3.0至10.0的50mM乙酸钠/HEPES/甘氨酸缓冲液中测量37℃下α-1,2-岩藻糖苷酶水解2'-岩藻糖基乳糖的能力。为了确定最佳温度，在30℃和90℃之间以10℃的间隔测量岩藻糖苷酶在50mM磷酸钠缓冲液中水解2'-岩藻糖基乳糖的能力。所有反应以一式两份进行并进行10分钟。表3提供了pH和温度最佳值，以及酶保留其最大活性的70％的范围。
实例4
评估岩藻糖苷酶抵抗胃应激物的能力
为了确定胃应激条件(低pH和胃蛋白酶存在)下的稳定性，将岩藻糖苷酶样品：CRC06086、CRC06678、CRC06719、CRC06800、CRC06807和CRC06852与胃蛋白酶(西格玛公司(Sigma)，目录号P7000)一起在50mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 3.5)或50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)中孵育。将100ppm酶的等分试样与胃蛋白酶以1:0、1:2.5、1:25、和1:250的比率(岩藻糖苷酶与胃蛋白酶)混合，并将酶混合物在37℃下孵育。作为对照，分别在37℃和4℃下，将100ppm岩藻糖苷酶在50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中不与胃蛋白酶一起孵育。孵育30分钟后，将样品适当稀释，并在37℃使用在50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的2'-岩藻糖基乳糖底物进行测定。使用水代替酶样品作为空白对照。根据净OD340(经孵育的酶)/净OD340(在4℃下储存的酶)x 100，计算残留的α-1,2-岩藻糖苷酶活性的百分比。所有反应以一式两份进行。在pH 3.5和pH 5下，CRC06086、CRC06678、CRC06719、CRC06800、CRC06807和CRC06852的胃蛋白酶抗性分别显示在图3和4中。
实例5
评估岩藻糖苷酶针对各种天然底物的活性
针对两种天然底物：猪胃黏蛋白(II型)(西格玛公司，M2378)和H抗原三糖(I型)(Elicityl公司，GLY031-1)评估CRC04259、CRC06086、CRC06678、CRC06719、CRC06800、CRC06807和CRC06852的酶活性。将两种浓度的每种岩藻糖苷酶(2和20ppm)与40mg/ml猪胃黏蛋白(II型)在37℃、pH 6.8下一起孵育10分钟，并使用如前所述的K-岩藻糖试剂盒定量释放的岩藻糖。类似地，将0.25ppm和1ppm的每种岩藻糖苷酶与3mM H抗原三糖(I型)在37℃、pH 6.8下一起孵育10分钟，并使用如前所述的K-岩藻糖试剂盒定量释放的岩藻糖。作为对照，使用水代替酶。猪胃黏蛋白(II型)水解的净OD340显示在图5中，H抗原三糖(I型)水解的净OD340显示在图6中。CRC06086未出现在图5中，因为它对猪胃黏蛋白没有活性。
实例6
真菌岩藻糖苷酶的序列分析
使用CRC04259(SEQ ID NO:22)、CRC06086(SEQ ID NO:23)、CRC06678(SEQ ID NO:24)、CRC06719(SEQ ID NO:25)、CRC06800(SEQ ID NO:26)、CRC06807(SEQ ID NO:27)和CRC06852(SEQ ID NO:28)针对公共和基因组查询专利数据库的预测成熟序列，通过BLAST搜索(Altschul等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],25:3389-402,1997)鉴定相关蛋白质序列，其中将搜索参数设置为默认值，并且将子集分别显示在表4A和4B(CRC04259)；表5A和5B(CRC06086)；表6A和6B(CRC06678)；表7A和7B(CRC06719)；表8A和8B(CRC06800)；表9A和9B(CRC06807)；以及表10A和10B(CRC06852)中。将两个搜索集的百分比同一性(PID)定义为相同残基的数量除以成对比对中经比对残基的数量。表上标有“序列长度”的值对应于以所列出的登录号提及的蛋白质的长度(以氨基酸计)，而“比对长度”是指用于比对和PID计算的序列。
预测成熟蛋白的氨基酸序列：CRC04259(SEQ ID NO:22)、CRC06086(SEQ ID NO:23)、CRC06678(SEQ ID NO:24)、CRC06719(SEQ ID NO:25)、CRC06800(SEQ ID NO:26)、CRC06807(SEQ ID NO:27)、CRC06852(SEQ ID NO:28)、以及同源物。将KKP06905(SEQ IDNO:29的氨基酸19-789)、XP_681418(SEQ ID NO:30的氨基酸20-809)、WO 2015048332-4759(SEQ ID NO:31的氨基酸21-793)和WO 2014202616-31814(SEQ ID NO:32)使用来自Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))的MUSCLE程序与默认参数进行比对(Robert C.Edgar.MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy andhigh throughput[MUSCLE：高精度和高通量的多序列比对]Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)。重叠区域的多序列比对显示在图7中。